LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER
ISOLASI DNA METODE DIXIT DAN PCI (Phenol Chloroform Isoamyl Alcohol) Kelompok 7 :
1.Sri Wahyu Purnami 4411412015 2.Silviatun Nihayah 4411412042 3.Intan Latifa Amalia 4411412068
4.Fatchun Naim 4411412051
Tanggal Praktikum Jumat, 10Oktober 2014
JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS NEGERI SEMARANG
BAB VI DAN VII
ISOLASI DNA METODE DIXIT (1998) DAN PCI (Phenol Chloroform Isoamyl Alcohol)
I. Tujuan
Untuk melakukan ekstraksi DNA dari berbagai sumber dari jaringan tumbuhan dan
hewan dengan metode dixit (1998) dan PCI.
II. Landasan Teori
DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) adalah master molecul (molekul utama) yang
mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap
organisme. DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa
nitrogen dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida (Istanti, 1999)
DNA dapat mengalami denaturasi dan renaturasi. Selain itu DNA juga bisa
diisolasi. Isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain: preparasi
esktrak sel, pemurnian DNA dari ekstrak sel dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi
DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian
tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini karena adanya senyawa
polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat
pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sampel buah yang berbeda,
dapat memberi hasil yang berbeda pula. Buah dengan kadar air tinggi akan
menghasilkan isolat yang berbeda jika dibandingkan dengan buah berkadar air
rendah. Semakin tinggi kadar air maka sel yang terlarut di dalam ekstrak akan
semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit (Zubaidah,2004
dalam Jamilah,2005)
DNA pada makhluk hidup dapat diisolasi secara sederhana. Pengisolasian
DNA secara sederhana dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran
plasma dan membran inti baik secara mekanik maupun secara kimiawi. Isolasi DNA
merupakan suatu teknik yang digunakan untuk memperoleh DNA murni, yaitu tanpa
Pemecahan dinding sel secara mekanik dapat dilakukan dengan pemblenderan
atau penggerus menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara kimiawi dapat
dilakukan dengan pemberian detergen. Penambahan sabun cair dan garam dapur
adalah untuk melisiskan membran inti untuk mengeluarkan isi inti sel yang berisi
DNA.
Setelah menunggu beberapa saat terjadi presipitasi pada lapisan atas bukan
lapisan bawah, yang menunjukkan bahwa DNA tidak larut dalam etanol tetapi larut
dalam air. Ketika molekul DNA terlarut, mereka tersebar dalam larutan sehingga
tidak terlihat. Ketika molekul tersebut berpindah kedalam larutan yang bukan pelarut
meraka akan berkumpul/ menggumpal sehingga dapat dilihat. Presipitat DNA terlihat
seperti serabut-serabut putih yang terkumpul diatas permukaan larutan karena masa
jenis etanol lebih kecil dari pada masa jenis air. Etanol yang digunakan harus
benar-benar dingin dan berasal dari lemari pendingin, hal ini bertujuan untuk
menyempurnakan presipitasi. Apabila etanol yang digunakan kurang dingin, maka
mengakibatkan pembentukan presipitat kurang sempurna.
Plasmid merupakan DNA yang
tidakterlaluesensialbagifungsikehidupanbakteri,
tetapipentingdalampengaturansiklushidupdanperumbuhandalamlokasihidupnya.
Kebanyakan plasmid adalahsirkulardantersusundaribeberaparibupasanganbasa.
Plasmid mempunyaititikori (origin of replication)
sehinggamampumereplikasidiritanpapengaturandari DNA kromosom.
Replikasidimulaidarititikorihinggasemua plasmid tereplikasi (Pierce,
2005:203dalamSaputra, 2013).
Isolasi DNA merupakanlangkah yang tepatuntukmempelajari DNA.
Prinsipnyaadadua, yaitusentrifugasidanpresipitasi.
Sentrifugasimerupakanteknikuntukmemisahkancampuranberdasarkanberatmolekulko
mponennya. Molekul yang mempunyaiberatmolekulbesarakanberada di
bagianbawahtabungdanmolekulringanakanberadapadabagianatastabung.
Hasilsentrifugasiakanmenunjukkanduamacamfraksi yang terpisah,
yaitusupernatanpadabagianatasdanpeletpadabagianbawah (Campbell dkk, 2002:
Langkahawalsetiappercobaan di bidangbiologimolekuleradalahmemperoleh
DNA yang dapatberasaldariberbeagaijaringanatauselmakhlukhidup.
Prinsipdasarisolasi / ekstrasi DNA adalahpenghancurandindingdanmembrane sel,
pemisahan DNA dari debris seldanpurifikasi DNA. Dalammelakukanmetodeekstrasi
DNA yang digunakansangatbegantungpadasumber DNA-nya,
apakahdariselataujaringan, hewan, tumbuhan, ataumikroorganisme.
(Mustikaningtyas, 2014)
Metode yang digunakanuntukmengisolasi DNA dariberbagaijenistanaman,
organ tanaman, maupunjaringannyadapatdilakukandenganberbagaicara.
Namunpadaintinyaterdapattigafaktorutama yang
sangatpentinguntukdalammelakukanpurifikasidanekstraksi DNA secaramaksimal.
Pertamaadalahcaradalammenghomogenkanjaringantanamankhususnyaadalahdinding
selnya. Keduaadalahkomposisidarilarutan buffer yang
ditambahkandalampenggerusanjaringantanamandan yang
ketigaadalahpenghilanganenzimpenghambat-polisakarida.
Inkubasisampeldalam water bath bersuhu 60 derajat C selama 60 menit. Hal
inidilakukanuntukoptimalisasikerja buffer ekstrak.
Selanjutnyadilakukansentrifugasisampeldengankecepatan 12000 rpm selama 10
menithalinidilakukanuntukmemisahkan debris dankomponensel lain yang
menjadipengotordengan DNA.
Supernatan yang
telahdiperolehselanjutnyadiambildanditambahkandenganlarutanPhenol:Chloroform:I
solamylAlkohol (PCI)atau dixit. Hal inidilakukanuntukmengekstraksi DNA
darikontaminan. Fenolmerupakanpelarutorganik yang dapatmelarutkan protein, lipid
danmolekul lain sepergipolisakaridasehinggadiharapkanakandidapatkansupernatan
yang berisi DNA bebaskontaminan. Setelahpencampuran,
homogenattersebutdivorteksuntukoptimalisasihomogenasi.
Selanjutnyadilakukansentrifugasihomogenatdengan PCI
tersebutdengankecepatan 13000 rpm selama 5 menitdalam. Hasil yang
didapatkanadalahsupernatandanpelet yang beradapadatigalapisanlapisanatas.
atasdanditambahkanlarutanChloroform:IsoamylAlkoholuntukpresipitasilanjutan.
Kemudiankembalidilakukanvorteksdansentrifugasi.
Hasil yang didapatkanakanterbentukkembalisupernatandanpeletpadaeppendorf,
kemudiandilakukanpengambilansupernatan.
Supernatanditambahkandenganamoniumnitratdanetanolabsolutuntukpresipitasilanjut
andanmenghilangkankontaminan.
Seharusnyahasildapatdiketahuiterbentukfilamen-filamen DNA dalamlarutanjernihtersebut.
Kemudiandilakukaninkubasiselamasatumalamuntukoptimalisasipresipitasi.
Fungsialat-alatisolasi DNA. Sentrifuseberfungsimemisahkanantarabagian
yang padatdancair (supernatant dandebsis).
Mikropipetberfungsiuntukmengambillarutan supernatant danzatkimia lain.
Ependorfberfungsiuntukwadahsampel yang akan di ekstraksi Water bath
berfungsiuntukmemanaskan DNA sampel.
Mortirberfungsiuntukmenghaluskansampel yang kan di ekstraksi.
Timbanganberfungsiuntukmenimbangjumlahsampel yang dibutuhkan. Thermometer
berfungsiuntukmengukursuhu.
Petridishberfungsiuntukmembersihkansampel..Erlemenyerberfungsiuntukmencairkan
agarose. Incubator berfungsiuntukinkubasisampel. Pinsetberfungsiuntukmengambil
material kecil. Sarungtanganberfungsiuntukmelindungitangandarizatberbahaya.
III. PERMASALAHAN
a. Bagaimana mahasiswa mampu menjelaskan jaringan tumbuhan dan hewan yang
dapat digunakan sebagai sumber DNA.
b. Bagaimana mahasiswa mampu menjelaskan metod ekstraksi DNA.
c. Bagaimana mahasiswa mampu melakukan ekstraksi DNA dari jaringan hewan
dan tumbuhan.
IV. ALAT DAN BAHAN
V. METODE
A. Langkah kerja Isolasi DNA Metode Dixit (1998) Dimodifikasi
1. Menggerus0.5 g sampel dengan menambahkan 3ml buffer ekstraksi 2. Menambahkan 600µl 20% SDS, mengkocok dengan kuat
4. Mensentrifus pada suhu 4 °C dengan kecepatan 10,000 rpm selama 5 menit
5. Memiindahkan supernatant ke tube baru, dan menambahkan 1 ml Potassium asetat
6. Menginkubasi pada suhu -20 °C selama 10 menit
7. Mensentrifus pada suhu 4 °C dengan kecepatan 10,000 rpm selama 2 menit
8. Memindahkan supernatant ke tube baru, dan menambahkan isopropanol sebanyak 2/3 volume supernatant.
9. Mengkocok perlahan membentuk angka 8.
10.Menyentrifuspadasuhu 4 °C dengankecepatan 10,000 rpm selama 2menit. 11.Membuang supernatant, kemudian mencuci pellet menggunakan 1 ml
ethanol 70%
12.Menyentrifuspadasuhu 4 °C dengankecepatan 10,000 rpm selama 1 menit 13.Mengeringkan pellet padasuhu37 °C selama 60 menit.
14. Melarutkan pellet dalam 100µl buffer TE, simpanpadasuhu -20 °C
B. Langkah Kerja Isolasi DNA Metode PCI
1. Menggerus 30 mg sampeldengan mortar hinggahalus, tambahkan 500 µl buffer ekstraksi
2. Tambahkan 20 µl proteinase K (10mg/ml) dan 50 µl SDS, vortex
3. Inkubasidalamwaterbath 55 °Cselama 60 menit, kocokperlahantiap 10menit
4. Tambahkan 50 µl 5 M NaCl, 400 µl phenol, 400 µl CIAA. Putarpelanselama 60menitpadasuhuruang
5. Sentrifuspadasuhu 4 °C dengankecepatan 3,000 rpm selama 5menit 6. Pindah supernatant ke tube baru, tambahkan 50 µl 5 M NaCldan 1 ml
ethanol absolutdingin, kocokperlahan 7. Inkubasidi freezer selama 60 menit
8. Sentrifuspadasuhu 4 °C dengankecepatan 8,000 rpm selama 5 menit 9. Buang supernatant
10.Tambahkan 1 ml ethanol 70% ke pellet
11.Sentrifuspadasuhu 4 °C dengankecepatan 8,000 rpm selama 5 menit 12. Buang supernatant dantiriskansampaitidakadasisa ethanol yang
tertinggal
13.Keringkansisa ethanol padasuhu 37 °Cselama 60 menit
VI. Hasil dan Pembahasan
1. Hasil Pengamatan
a. Isolasi DNA Metode Dixit (1998) Dimodifikasi
No. Kegiatan Gambar
1. Menggerus 0.5 g sampel dengan menambahkan 3ml buffer ekstraksi
2. Menambahkan 600µl 20% SDS, mengkocok dengan kuat
4. Mensentrifus pada suhu 4 °C dengan kecepatan 10,000 rpm selama 5 menit
5. Memindahkan supernatant ke tube baru, dan menambahkan 1 ml Potassium asetat
6. Menginkubasi pada suhu -20 °C selama 10 menit
8. Memindahkan supernatant ke tube baru, dan menambahkan isopropanol sebanyak 2/3 volume supernatant.
9. Mengkocok perlahan membentuk angka 8.
10. Menyentrifus pada suhu 4 °C dengan kecepatan 10,000 rpm selama 2 menit.
12. Menyentrifus pada suhu 4 °C dengan kecepatan 10,000 rpm selama 1 menit
13. Mengeringkan pellet pada suhu37 °C selama 60 menit.
14. Melarutkan pellet dalam 100µl buffer TE, simpanpadasuhu -20 °C
b. Isolasi DNA Metode PCI
No. Perlakuan Gambar
1. Menggerus 30 mg sampel dengan mortar hingga halus, tambahkan 500 µl buffer ekstraksi
3. Menginkubasi dalam water bath 55 °Cselama 60 menit, kocokperlahantiap 10menit
4. Menambahkan 50 µl 5 M NaCl, 400 µl phenol, 400 µl CIAA. Memutarpelanselama
60menitpadasuhuruang
5. Mensentrifuspadasuhu 4 °C dengankecepatan 3,000 rpm selama 5menit
7. Menginkubasidi freezer selama 60 menit
8. Mensentrifuspadasuhu 4 °C dengankecepatan 8,000 rpm selama 5 menit
9. Membuang supernatant
11. Mensentrifus pada suhu 4 °C dengan
kecepatan 8,000 rpm selama 5 menit
12. Membuang supernatant dan meniriskan sampai tidak ada sisa ethanol yang tertinggal
13. Mengeringkansisa ethanol padasuhu 37 °Cselama 60 menit
14. Menambahkan 50-100 µl buffer TE
pada pellet danmenyimpannyapada
freezer
c. Pembahasan
DaftarPustaka
Istanti, Annie. 1999. Biologi Sel. Malang: jurusan Biologi FMIPA UM.
Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Deterjen, Penambahan Garam dan Ekstrak Nanas(Ananas Comusus) terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah sebagai Topik Praktikum Mata Kuliah Genetika. Skripsi. Malang: Program Sarjana (diaksespada 11 Oktober 2014 pukul 10.55 WIB)
Mustikaningtyas. 2014. Buku Ajar PraktikumBiologiMolekuler. Semarang: FMIPA UNNES
Saputra, Eka. 2013. LaporanPraktikumBioteknologiTransformasi Gen
