1 OPTIMASI METODE ISOLASI DNA GENOM PADA TANAMAN NIBUNG
(Oncosperma tigillarium (Jack) Ridl.) Deti Novela1 dan Fitmawati2
1Mahasiswa Program Studi S1 Biologi FMIPA UNRI
2Dosen Bidang Botani Jurusan Biologi FMIPA UNRI
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Riau [email protected]
ABSTRACT
Nibung (Oncosperm tigillarium (Jack) Ridl.) belongs to family Arecaceae. Characterization based on morphological features in nibung is difficult, therefore molecular characterization is necessary to be done. Molecular characterization based on DNA markers provides a fairly high degree of accuracy. Plant DNA isolation is the key step in genetic and molecular experiments. One factor that has an important effect on DNA isolation is leaf condition. This research was carried out with the aim to find out the quality of DNA from the isolation of fresh nibung leaves and dried leaves storing in silica gel. Based on the results of this study, DNA isolation of the nibung dried leaves showed DNA band with good quality compared to fresh leaves.
Key word: Oncosperma tigillarium, DNA isolation, Fresh leaves, Dry leaves, Nibung ABSTRAK
Nibung (Oncosperma tigillarium (Jack) Ridl.) merupakan salah satu jenis dari famili Arecaceae. Karakterisasi berdasarkan ciri morfologi pada nibung sulit dilakukan, sehingga perlu dilakukan karakterisasi secara molekuler. Karakterisasi molekuler berdasarkan penanda DNA memberikan tingkat akurasi yang cukup tinggi. Proses isolasi DNA pada tumbuhan menjadi langkah awal yang sangat menentukan dalam penelitian bidang genetika dan molekuler suatu spesies. Salah satu faktor yang mempunyai pengaruh penting dalam isolasi DNA adalah kondisi daun. Oleh karena itu, dilakukan penelitian ini dengan tujuan untuk mengetahui kualitas DNA hasil isolasi dari daun nibung segar dan daun kering hasil penyimpanan dalam silica gel. Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, hasil isolasi DNA genom tanaman nibung menggunakan daun kering hasil penyimpanan menggunakan silica gel menunjukkan hasil pita dengan kualitas baik dibandingkan dengan penggunaan daun segar.
Kata Kunci: Oncosperma tigillarium, Isolasi DNA, Daun Segar, Daun Kering, Nibung PENDAHULUAN
Nibung (Oncosperma tigillarium (Jack) Ridl.) merupakan salah satu jenis dari famili Arecaceae, subfamili Arecoide (Uhl dan Dransfield 1987). Nibung adalah
kelompok palem kategori Hasil Hutan Bukan Kayu (HHBK) yang dimanfaatkan batangnya (Permenhut No P.35 2007).
Tanaman ini banyak ditemukan di daerah
2 pesisir, hutan rawa gambut atau hutan
pantai (Witono 2005).
Nibung mempunyai karakter yang khas yaitu seluruh bagian tubuhnya dilindungi duri keras berwarna hitam. Batang nibung mempunyai karateristik keras, kuat dan tahan rayap sehingga dijadikan tegakan untuk jembatan dan bangunan pantai (Desti dan Mellisa 2017). Nibung merupakan tanaman yang membutuhkan waktu lama untuk tumbuh. Hal ini menyebabkan karakterisasi nibung berdasarkan ciri morfologi sulit dilakukan, sehingga diperlukan karakterisasi secara molekuler. Karakterisasi secara molekuler menggunakan penanda DNA memberikan tingkat akurasi yang cukup tinggi. Tahapan isolasi DNA dari mahluk hidup meliputi lisis sel, penghilangan RNA dan protein serta pemurnian dan pengendapan DNA (Sambrook et al. 1989).
Proses isolasi DNA genom pada tumbuhan menjadi langkah awal yang sangat menentukan dalam penelitian bidang genetika dan molekuler suatu spesies. Proses ini memerlukan persiapan sampel untuk mendapatkan DNA dengan kualitas yang baik sehingga dapat digunakan untuk analisis secara genetik.
Analisis DNA dari berbagai sampel membutuhkan optimasi agar didapat DNA dengan kualitas dan kuantitas yang baik.
Setiap tumbuhan memiliki kekhasan sifat dan metabolit sekundernya sehingga tidak semua prosedur isolasi DNA sesuai untuk setiap tumbuhan, oleh karena itu diperlukan improvisasi agar diperoleh DNA dengan kualitas yang baik. Salah satu faktor yang mempunyai pengaruh penting dalam isolasi DNA adalah kondisi daun. Kualitas dan kuantitas DNA yang baik dapat dicapai melalui penanganan
fisik dari daun, yang pada prinsipnya bertujuan untuk melindungi DNA genom dari degredasi senyawa metabolit sekunder, terutama sampel daun yang diambil dari jarak yang jauh, sehingga membutuhkan teknik penyimpanan dan isolasi yang baik. Oleh karena itu, dilakukan penelitian ini yang bertujuan untuk mengetahui kualitas DNA hasil isolasi dari daun nibung segar dan daun kering hasil penyimpanan dalam silica gel.
METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini telah dilaksanakan pada bulan November – Desember 2020 di Laboratorium Botani dan Laboratorium Genetika Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Riau.
Alat dan Bahan Penelitian
Peralatan yang dibutuhkan dalam melakukan penelitian ini adalah tabung 1,5 ml sentrifuse, mortal, pestel, neraca analitis, freezer dan waterbath. Sedangkan bahan yang dibutuhkan dalam penelitian ini adalah sampel daun nibung segar dan sampel daun nibung yang telah dilakukan penyimpanan dengan silica gel selama 1 minggu, buffer CTAB 2x (2% CTAB; 1,4 M NaCl; 0,1 M Tris-HCl; 0,02 M EDTA), Nitrogen cair, 70% alkohol, kloroform, isopropanol, buffer TE, ethium bromide, polivinilviloridon (PVP), 1% agarose, DNA ladder 1 kb, seperangkat alat elektroforesis dan alat dokumentasi gel UV.
3 Prosedur Kerja
1. Metode Pertama
Daun nibung segar sebanyak 0,5 gram kemudian ditambahkan 0,2 gram PVP dan digerus menggunakan mortar. Nitrogen cair ditambahkan pada saat penggerusan sample. Setelah halus, sample dimasukkan kedalam tabung 1,5 ml dan ditambahkan 2x CTAB sebanyak 5 ml. Komposisi larutan 2x CTAB yaitu CTAB, Tris-HCl, NaCl, EDTA dan aqua-demineralisasi.
Sampel kemudian diinkubasi di dalam waterbath selama 1 jam dengan suhu 65°C dan setiap 10 menit sampel dibolak-balik.
Sampel didinginkan pada suhu ruang dan ditambahkan 5 ml kloroform. Sampel disentrifuse dengan kecepatan 13.000 rpm selama 15 menit. Supernatan yang terbentuk dipindahkan kedalam tabung 1,5 ml yang baru kemudian ditambahkan 5 ml kloroform dan disentrifuse kembali dengan kecepatan 13.000 rpm selama 10 menit.
Supernatan pada bagian atas kemudian dipindahkan kedalam tabung 1,5 ml baru dan ditambahkan isopropanol sebanyak 2/3 sampel. Sampel dihomogenkan sebelum disimpan di dalam freezer selama satu malam. Setelah diendapkan semalaman, disentrifuse dengan kecepatan 8000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang, pelet atau endapan DNA yang terbentuk didasar tabung di cuci menggunakan 70%
alkohol sebanyak 500 µl dan disentrifuse dengan kecepatan 8000 rpm selama 10 menit. Pelet dibiarkan diudara terbuka sampai kering. Setelah kering, pelet ditambahkan buffer TE kurang lebih 50 µl kemudian disimpan kedalam freezer sebagai larutan stok DNA.
2. Metode Kedua
Daun nibung kering hasil penyimpanan dalam silica gel sebanyak 0,5 gram kemudian ditambahkan 0,2 gram PVP dan digerus menggunakan mortar. Nitrogen cair ditambahkan pada saat penggerusan sample. Setelah halus, sample dimasukkan kedalam tabung 1,5 ml dan ditambahkan 2x CTAB sebanyak 5 ml. Komposisi larutan 2x CTAB yaitu CTAB, Tris-HCl, NaCl, EDTA dan aqua-demineralisasi.
Sampel kemudian diinkubasi di dalam waterbath selama 1 jam dengan suhu 65°C dan setiap 10 menit sampel dibolak-balik.
Sampel didinginkan pada suhu ruang dan ditambahkan 5 ml kloroform. Sampel disentrifuse dengan kecepatan 13.000 rpm selama 15 menit. Supernatan yang terbentuk dipindahkan kedalam tabung 1,5 ml yang baru kemudian ditambahkan 5 ml kloroform dan disentrifuse kembali dengan kecepatan 13.000 rpm selama 10 menit.
Supernatan pada bagian atas kemudian dipindahkan kedalam tabung 1,5 ml baru dan ditambahkan isopropanol sebanyak 2/3 sampel. Sampel dihomogenkan sebelum disimpan di dalam freezer selama satu malam. Setelah diendapkan semalaman, disentrifuse dengan kecepatan 8000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang, pelet atau endapan DNA yang terbentuk didasar tabung di cuci menggunakan 70%
alkohol sebanyak 500 µl dan disentrifuse dengan kecepatan 8000 rpm selama 10 menit. Pelet dibiarkan diudara terbuka sampai kering. Setelah kering, pelet ditambahkan buffer TE kurang lebih 50 µl kemudian disimpan kedalam freezer sebagai larutan stok DNA.
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Proses isolasi DNA nibung dilakukan dengan metode Doyle and Doyle (1991) yang telah dimodifikasi. Modifikasi dilakukan dengan penambahan nitrogen cair untuk memudahkan proses penggerusan secara mekanik. CTAB (Cetyl Trimmetil Ammonium Bromida) yang digunakan berfungsi untuk melisis dinding sel yang terdiri dari lipid dan protein. PVP (Polivilpirolidone) berfungsi untuk mengurangi senyawa fenolik pada tumbuhan. Inkubasi sampel pada suhu 65°C selama 1 jam bertujuan untuk memaksimalkan kerja larutan CTAB (Cheng et al. 2003). Proses sentrifuse bertujuan untuk memisahkan larutan menjadi dua bagian yaitu pelet yang berisi debris DNA dan supernatan yang mengandung DNA. Penambahan kloroform berfungsi sebagai pelarut organik yang mampu melarutkan lipid, protein dan polisakarida (Syafaruddin dan Santoso 2011).
DNA hasil isolasi kemudian dielektroforesis pada 1% gel agarose di dalam larutan buffer TAE 1X.
Elektroforesis merupakan teknik yang dapat memisahkan molekul bermuatan listrik menggunakan medan listrik yang di alirkan pada medium yang mengandung molekul (Yuwono 2010). Hasil elektroforersis kemudian direndam kedalam larutan ethium bromide yang berfungsi untuk mewarnai DNA sehingga terlihat pada saat penyinaran UV transluminator. Perbandingan hasil isolasi menggunakan metode pertama (daun segar) dan metode kedua (daun yang telah disimpan dalam silica gel) disajikan pada Gambar 1.
Gambar 1. (M) Marker 1 kb, (K) Daun Nibung Kering dan (S) Daun Nibung Segar
Hasil isolasi DNA nibung menggunakan dua kondisi daun yang berbeda menunjukkan perbedaan yang signifikan. DNA genom yang berasal dari daun kering mempunyai pita tebal, jelas dan sedikit smear, sedangkan DNA genom yang berasal dari daun segar menunjukkan pita dengan smear yang tebal. Smear menunjukkan DNA hasil ekstraksi yang tidak utuh (Hikmah et al. 2016) dan berasal dari degradasi DNA sehingga mempunyai berat bervariasi (Prayitno dan Nuryandani 2011).
Penggunaan daun kering untuk isolasi DNA tanaman nibung lebih baik dibandingkan daun segar. Hal ini disebabkan tanaman nibung mempunyai kandungan senyawa fenol dan polisakarida yang tinggi. Penyimpanan sampel daun nibung menggunakan silica gel mampu menekan aktifitas metabolisme pada daun.
Menurut Ediwirman dan Mansya (2009),
M K S
5 proses pengeringan pada media simpan
yang memiliki kelembapan rendah akan berpengaruh terhadap penurunan metabolisme sel, sehingga terjadi penghambatan aktifitas metabolit sekunder yang membuat kondisi sel tetap baik.
Apabila kondisi sel tanaman baik, maka DNA yang terdapat didalam sel tanaman akan dalam kondisi yang baik.
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, hasil isolasi DNA genom tanaman nibung menggunakan daun kering hasil penyimpanan menggunakan silica gel menunjukkan hasil pita dengan kualitas baik dibandingkan dengan penggunaan daun segar.
UCAPAN TERIMAKASIH
Penulis mengucapkan terima kasih kepada ibu Dr. Fitmawati, M.Si yang telah membimbing selama penelitian, Kepala dan Laboran Laboratorium Botani Jurusan Biologi, Kepala dan Laboran Laboratorium Genetika FMIPA Universitas Riau atas izin dan fasilitas yang diberikan selama penelitian.
Terimaksih juga penulis ucapkan kepada semua pihak yang mendukung dan membantu penulis dalam penelitian ini.
DAFTAR PUSTAKA
Desti D dan Mellisa M. 2017. Profil Morfologi Tumbuhan Nibung (Oncosperma tigillarium) dan Pengembangannya untuk Bahan Ajar. Jurnal Bioterdidik 5(7).
Ediwirman dan Mansya Ellina. 2009.
Optimalisasi Metode Isolasi DNA
Genom Tanaman Kapulasan. Jur.
Agroekotek 1(1):7-11.
Peraturan Menteri Kehutanan Nomor P.35/Menhut-II/2007. Tentang Hasil Hutan Bukan Kayu (HHBK).
Jakarta: Departemen Kehutanan.
Sambrook J, Fritsch EF dan Maniatis T.
1989. Moleculer Cloning, A Laboratory Manual. Second Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
Uhl NW dan Dransfield J. 1987. Genera Palmarum, a classification of the palms based on the work of Harold E. Moore Jr. Lawrence: Liberty Hyde Bailey Hortorium and the International Palm Society, Kansas.
Witono JR. 2005. Keanekaragaman Palem (Palmae) di Gunung Lumut,
Kalimantan Tengah.
BIODIVERSITAS 6(1): 22-30.
