Lampiran 1. Diagram Alir Penelitian
Sampel air kolam, usus ikan nila dan endapan air kolam ikan.
Isolasi dan Karakteristik Bakteri Asam Laktat
Isolat Bakteri Asam Laktat murni
Seleksi BAL pot ensial (uji antagonis)
Isolat Potensial
Produksi Senyawa Antibakteri
Pengendalian Biofilm S. agalactiae tertua pada permukaan plastik dan sisik ikan oleh senyawa antibakteri potensial 100% pada pengamatan waktu kontak 60 menit
Lampiran 2. Bagan Alir Isolasi Bakteri Asam Laktat
10 ml air kolam diencerkan pada pengenceran 10-4 hingga 10-8
diambil 0.1 mL dari pengenceran 10 CFU/mL dengan PBS
-4
hingga 10-8
diinkubasi suhu 30 CFU/mL
o
jam
C selama 24-48
dimurnikan pada media MRSA dengan metode kuadran gores setiap koloni dengan morfologi yang berbeda, diinkubasi pada suhu 30oC selama 24-48 jam
Air Kolam
Lampiran 3. Bagan Alir Seleksi BAL Potensial Terhadap S.agalactiae
Gigi
1-2 ose dibuat suspensi cair dalam 9 mL akuades steril diukur kekeruhannya dengan spektrofotometer hingga OD = 0,5 pada panjang gelombang 600 nm
dicelupkan cotton bud steril dalam suspensi dan diusapkan pada media MHA telah mengeras
ditotolkan 1 ujung tumpul tusuk gigi steril kultur 24 jam kandidat BAL
diinkubasi 24-48 jam pada suhu 28o .
C Kultur uji S. agalactiae
usia 24 jam
Lampiran 4. Bagan Alir Identifikasi Bakteri Asam Laktat dari Air Kolam
- ditumbuhkan pada media NB
- diinkubasi pada suhu 30 oC selama 24 jam
- membuat preparat ulas isolat
- difiksasi di atas Bunsen - ditetesi dengan kristal
ungu
- diamkan selama 1 menit - dicuci dengan air
mengali
- ditetesi dengan safranin - diamkan selama 30 detik - dicuci kembali dengan
air mengalir - preparat dikeringkan
- diamati dibawah
mikroskop terhadap kandidat genus BAL - diamati bentuk koloni
Lampiran 5. Bagan Alir Kurva Pertumbuhan BAL Potensial
diinokulasikan sebanyak 10 ose kedalam 50 ml NB
diinkubasi pada suhu 30o
diukur kekeruhannya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang
600 nm
C
dilakukan perhitungan berulang setiap rentang 3 jam selama 24 jam L. plantarum
Lampiran 6. Bagan Alir Pembentukan Sel Biofilm S. agalactiae pada Permukaan Sisik dan Plastik
dibentuk masing-masing seluas 1 cm
dicuci dengan detergen selama 15 menit.pada bak sonikator,
2
kemudian bilas dengan akuades steril disterilkan dengan autoklaf 121o
dimasukkan media NB sebanyak 50 mL menumbuhkan hingga 10
C.
8
dimasukkan lempeng padat pada masing-masing botol. CFU/mL isolat S. agalactiae di dalam botol uji
digoyang pada kecepatan 120 rpm pada suhu 30o
dibilas 3x dengan akuades steril sebanyak 10 mL untuk C selama 1, 3 dan 5 hari.
masing-masing jenis lempeng.
dimasukkan ke dalam 9 mL NaCl 0.9 % dan 0.5 g serbuk kaca (glass bead).
divortek selama 2 menit untuk melepas biofilm tersisa dilakukan pengenceran berseri
dari tiap pengenceran berseri disebar 1 mL dari pada media PCA
diinkubasi pada suhu 30o
dihitung jumlah koloni yang tumbuh C selama 24 jam Lempeng Permukaan Padat
Lampiran 7. Produksi Senyawa Antibakteri BAL
diinokulasikan sebanyak 10 ose kedalam 50 mL NB
diinkubasi pada suhu 30 o
dipipet sebanyak 10 mL ke dalam masing-masing tabung sentrifugasi
C selama 15 jam
disentrifugasi 10.000 rpm pada suhu 4o
dipipet supernatan yang terpisah dengan peletnya ke dalam botol steril
C selama 15 menit
disimpan pada suhu 4o
tembus cahaya jika tidak langsung C dan botol tidak
digunakan Kultur AK5
Lampiran 8. Bagan Alir Pengendalian Biofilm S. agalactiae
dipreparasi berdasarkan jumlah sel tertinggi berdasarkan perlakuan sebelumnya
dibilas 3x dengan akuades steril untuk melepas sel planktonik
dimasukkan dalam masing-masing tabung steril,
ditambahkan 9 mL formulasi 100% senyawa antibakteri BAL digoyang pada kecepatan 120 rpm. dibilas 3x dengan akuades steril untuk melepas planktonik yang masih tersisa
dimasukkan ke dalam 9 mL NaCl 0.9 % dan 0.5 g serbuk kaca (glass bead).
divortek selama 2 menit untuk melepas biofilm tersisa
dilakukan pengenceran berseri
dari tiap pengenceran berseri disebar 1 mL dari pada media PCA
diinkubasi pada suhu 30o
dihitung jumlah koloni yang tumbuh C selama 24 jam Lempeng Biofilm
Lampiran 9. Bagan Alir Aktivitas Senyawa Anti Bakteri terhadap pH
dipipet 2 mL kedalam tabung reaksi
diatur pH dengan menambahkan HCl 0,1 N dan NaOH 0,1N secara terpisah sehingga mencapai variasi pH 2, 4, 6, 8, 10 dan 12
dipipet sebanyak 15 µ l suspensi pada kertas cakram steril
diamati sensitifitasnya dengan metode cakram terhadap bakteri uji S. agalactiae .
Senyawa Antibakteri
Ekstrak Kasar BAL AK 5 555GB55%555%5%
Lampiran 10 . Bagan Alir Aktivitas Senyawa Anti Bakteri terhadap Suhu
dipipet 2 ml kedalam tabung reaksi
di inkubasi pada inkubator termofil suhu 280C, 40 0C, 60 0C, 80 0
dipipet sebanyak 15 µ l suspensi pada kertas cakram steril
C selama 15 menit.
diamati sensitifitasnya dengan metode cakram terhadap bakteri uji S. agalactiae .
Senyawa Antibakteri Ekstrak Kasar BAL AK 5
Lampiran 11. Bagan Alir Aktivitas Senyawa Antibakteri terhadap Surfaktan
dipipet 1 mL kedalam tabung reaksi
dipipet 0,1 mL surfaktan EDTA dan Tween 80 masing-masing tabung reaksi
dipipet sebanyak 15 µ l suspensi pada kertas cakram steril
diamati sensitifitasnya dengan metode cakram terhadap bakteri uji S. agalactiae .
Senyawa Antibakteri Ekstrak Kasar BAL AK 5
Lampiran 12. Foto Bahan Penelitian
Glassbeads (manik-manik kaca)
Isolat S. agalactiae
Lempeng sisik ikan Lempeng plastik PVC
