35
BAB 4 METODE PENELITIAN 4.1. Jenis Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian jenis eksperimental dengan pendekatan Post Test Control Group Design, yaitu rancang penelitian yang hasil penelitiannya diamati setelah perlakuan selesai.
4.2. Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang selama ± 2 bulan.
4.3. Populasi dan Sample 4.3.1. Populasi
Populasi pada penelitian ini ialah menggunakan seluruh tikus putih jantan (Rattus Norvegicus Strain Wistar).
4.3.2. Sampel
Sampel pada penelitian ini menggunakan tikus putih jantan (Rattus Norvegicus Strain Wistar) yang diambil dari populasi yang sesuai dengan kriteria inklusi.
4.3.3. Besar Sampel
Penelitian ini menggunakan 5 kelompok perlakuan yaitu terdiri dari Kontrol Positif (+), Kontrol Negatif (-), dan 3 kelompok perlakuan.
Penentuan jumlah sampel dalam setiap kelompok perlakuan dalam penelitian ditentukan menggunakan rumus pada Sample Size Calculation In Animal Studies tahun 2017, yaitu sebagai berikut :
Tabel 4.1 Rumus Penentuan Jumlah Sampel
Keterangan :
k : Jumlah Kelompok
ANOVA Design Application Minimum n/group
Maximum n/group One Way ANOVA Group
Comparison 10/k+1 20/k+1
n : Jumlah subjek tiap kelompok
Berdasarkan rumus diatas, maka jumlah subjek atau sampel pada setiap kelompok perlakuan bisa didapatkan dengan kalkulasi sebagai berikut:
Jumlah sampel minimum n = 10/k +1
n = 10/5 + 1 n = 3
Jumlah sampel maksimum n = 20/k + 1
n = 20/5 + 1 n = 5
Maka dari itu, pada penelitian ini diambil jumlah sampel setiap perlakuan yaitu 3 ekor sampel dengan mengambil jumlah sampel minimum karena tidak ditemukan jurnal yang menyebutkan bahwa pemberian ovalbumin pada tikus memiliki risiko dropout yang tinggi dan juga berpegang dengan prinsip 3R yaitu Replacement, Reduction, Refinement.
Sehingga pada penelitian ini menggunakan total 15 sampel tikus. Baik tikus cadangan dan tikus yang diberi perlakuan mendapat perlakuan yang sama dan pada waktu yang sama.
4.3.4. Teknik Pengambilan Sampel
Teknik pengambilan sampel pada penelitian ini ialah menggunakan metode simple random sampling.
4.3.5. Karakteristik Sampel Penelitian 4.3.5.1. Kriteria Inklusi
a) Tikus Rattus Norvegicus Strain Wistar dengan kelamin jantan.
b) Umur 2-3 bulan
c) Berat Badan (200±22) gram
d) Tikus dengan keadaan sehat, dengan tanda gerakan yang aktif, mata yang jernih, dan bulu yang tebal.
4.3.5.2. Kriteria Eksklusi
a) Tikus sakit selama proses perlakuan dengan tanda gerakan yang tidak aktif, rambut kusam atau rontok, tidak mau makan, dan keluar eksudat yang tidak normal
b) Terdapat penurunan berat badan lebih dari 10% setelah masa adaptasi di laboratorium
c) Tikus yang mati selama penelitian 4.3.6. Variabel Penelitian
4.3.6.1. Variabel Bebas
Ekstrak kulit mangga dalam berbagai dosis 4.3.6.2. Variabel Terikat
Ketebalan mukosa bronkus tikus jantan galur wistar.
4.4. Definisi Operasional
a. Ekstrak Kulit Mangga (Mangifera indica L.)
Simplisia kulit mangga bersertifikat didapat dari Materia Medika Kota Batu yang kemudian akan diekstraksi di Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran UMM. Skala pada variable ini ialah kategorik yaitu skala data ordinal.
b. Ovalbumin
Ovalbumin (OVA) adalah protein dari putih telur yang digunakan untuk menstimulasi reaksi alergi. Telur yang digunakan pada penelitian ini merupakan telur ayam ras yang dibeli dari pedagang di pasar tradisional Blimbing Kota Malang. Menggunakan skala numerik yaitu skala data ratio.
c. Mukosa Bronkus
Ketebalan mukosa bronkus yang meningkat akibat dari hiperplasi sel goblet di epitel diukur dari mukosa hingga membrane basalis yang merupakan batas epitel dengan lapisan dibawahnya. Bronkus sendiri adalah kaliber jalan udara pada sistem pernapasan yang membawa udara ke paru-paru. Skala pada variabel ini adalah numerik yaitu skala rasio.
4.5. Alat dan Bahan 4.5.1. Alat
a. Pisau
b. Timbangan analitik c. Gelas ukur
d. Botol ekstrak e. Rotary evaporator f. Timbangan hewan g. Kandang hewan
h. Tempat makan dan minum tikus i. Spuit injeksi
j. Sonde k. Pipet l. Nebulizer m. Mikroskop 4.5.2. Bahan
a. Tikus (Rattus norvegicus strain wistar) b. Buah mangga
c. Etanol 80%
d. Aquadest
e. Putih telur ayam f. Normal saline g. Al(OH)3 h. NaOH i. Sekam
j. Pakan standart BR-1 k. Kassa
l. Handscoon m. Tissue
4.6. Prosedur Penelitian
4.6.1. Pengelompokan Hewan Coba
Tikus yang digunakan pada penelitian ini yaitu sebanyak 25 ekor yang akan dibagi menjadi 5 kelompok dan per kelompok terdapat 5 ekor tikus :
a. Kontrol negatif : Diberi pakan standar BR-1 sebanyak 40 g/hari/tikus serta minum aquadest selama 30 hari.
b. Kontrol positif : Diberi pakan standar BR-1 sebanyak 40 g/hari/tikus serta minum aquades. Ditambah pemberian ovalbumin 10 µg dan 2 mg Al(OH)3 dalam 0,2 cc normal saline secara intraperitoneal pada hari pertama, hari ke-tujuh dan hari ke-empat belas, dan diberi ovalbumin 1% dalam 10 ml normal saline secara inhalasi dengan menggunakan nebulizer selama 30 menit pada hari ke-sembilan belas dan hari ke-dua puluh dua.
c. Kelompok III : Diberi pakan standar BR-1 sebanyak 40 g/hari/tikus serta minum aquades. Ditambah pemberian ovalbumin 10 µg dan 2 mg Al(OH)3 dalam 0,2 cc normal saline secara intraperitoneal pada hari pertama, hari ke-tujuh dan hari ke-empat belas, dan diberi ovalbumin 1% dalam 10 ml normal saline secara inhalasi dengan menggunakan nebulizer selama 30 menit pada hari ke-sembilan belas dan hari ke-dua puluh dua. Serta diberikan ekstrak kulit mangga dengan dosis 5,34 mg/KgBB peroral pada hari ke-15 sampai hari ke-22.
d. Kelompok IV : Diberi pakan standar BR-1 sebanyak 40 g/hari/tikus serta minum aquades. Ditambah pemberian ovalbumin 10 µg dan 2 mg Al(OH)3 dalam 0,2 cc normal saline secara intraperitoneal pada hari pertama, hari ke-tujuh dan hari ke-empat belas, dan diberi ovalbumin 1% dalam 10 ml normal saline secara inhalasi dengan menggunakan nebulizer selama 30 menit pada hari ke-sembilan belas dan hari ke-dua puluh dua. Serta diberikan ekstrak kulit mangga dengan dosis 10,69 mg/KgBB peroral pada hari ke-15 sampai hari ke-22.
e. Kelompok V : Diberi pakan standar BR-1 sebanyak 40 g/hari/tikus serta minum aquades. Ditambah pemberian ovalbumin 10 µg dan 2 mg Al(OH)3 dalam 0,2 cc normal saline secara intraperitoneal pada hari pertama, hari ke-tujuh dan hari ke-empat belas, dan diberi ovalbumin 1% dalam 10 ml normal saline secara inhalasi dengan menggunakan nebulizer selama 30 menit pada hari ke-sembilan belas dan hari ke-dua puluh dua. Serta diberikan ekstrak kulit mangga dengan dosis 21,38 mg/
KgBB peroral pada hari ke-15 sampai hari ke-22.
Pada hari pertama, hari ke-tujuh dan hari ke-empat belas dilakukan sensitisasi dengan pemberian ovalbumin (OVA) 10 µg secara intraperitoneal. Selanjutnya sensitisasi ulangan pemberian ovalbumin 1%
dalam 10 mL normal saline dengan menggunakan nebulizer selama 30 menit pada hari ke-sembilan belas dan hari ke-dua puluh dua. Kemudian, hari ke-lima belas sampai hari ke-dua puluh dua perlakuan, tikus kelompok III, IV, dan V diberikan ekstrak kulit mangga secara per oral dengan dosis yang berbeda-beda sesuai kelompoknya. Pada hari ke-dua puluh tiga dihentikan semua perlakuan yang diberikan. Selanjutnya dilakukan pembedahan tikus dan pengambilan preparat dinding bronkus primer.
4.6.2. Aklimatisasi
Proses aklimatisasi hewan coba dalam kandang dilakukan selama 7 hari dengan tujuan agar tikus menyesuaikan diri terhadap lingkungan yang baru. Selama adaptasi, tikus diberikan pakan standar BR-1 yang diberikan 1 kali sehari. Jika ada sisa makanan, maka sisanya dibuang lalu diganti dengan yang baru. Tikus juga diberi minum aquades secukupnya. Pada masa aklimatisasi, tikus ditimbang berat badannya.
4.6.3. Penentuan Dosis Ekstrak Kulit Mangga
Penentuan dosis ekstrak kulit mangga berdasarkan pada penelitian terdahulu mengenai efek pemberian ekstrak buah Anggur (Vitis vinifera L) pada tikus model asma yang menunjukkan pengaruh pada dosis 42,5 mg/kgBB. (Arora et al., 2016). Ekstrak buah Anggur (Vitis vinifera L) memiliki kandungan yang sama dengan ekstrak kulit mangga, yaitu
memiliki kandungan flavonoid yang berfungsi sebagai antiinflamasi.
Kandungan flavonoid pada ekstrak buah Anggur (Vitis vinifera L.) yaitu sebesar 14,37 mg/g. (Zeghad et al., 2019).
Dosis penelitian tersebut dikonversikan pada dosis untuk ekstrak kulit mangga :
14,37 mg/g
= X
57,1 mg/g 42,5 mg/KgBB
X = 10,69 mg/KgBB
Keterangan :
57,1 mg/g = Kandungan flavonoid pada ekstrak kulit mangga(Suleria et al., 2020).
X = Dosis ekstrak kulit mangga
Berdasar penelitian tersebut, peneliti ingin mengetahui pengaruh pemberian dosis ekstrak kulit mangga pada dosis yang lebih kecil dan lebih besar dari 10,69 mg/KgBB. Peneliti dalam menentukan dosis menggunakan rumus deret hitung sebagai berikut :
1. Dosis 1 : ½ N = 5,34 mg/KgBB 2. Dosis 2 : N = 10,69 mg/KgBB 3. Dosis 3 : 2 x N = 21,38 mg/KgBB
4.6.4. Pembuatan Ekstrak Kulit Mangga (Mangifera indica L.)
Simplisia kulit mangga bersertifikat yang didapat dari Materia Medika Kota Batu kemudian diekstraksi di Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran UMM menggunakan metode maserasi dengan larutan etanol 70% selama 3 hari dengan suhu ruangan. Selanjutnya, hasil ekstraksi tersebut akan difiltrasi untuk memisahkan ampas dengan filtratnya dan dikentalkan menggunakan vacuum rotary evaporator pada suhu 40o dan dikeringkan. Ekstrak yang sudah kering bisa diencerkan menggunakan aquadest agar bisa dispuit dan bisa dimasukkan ke tubuh tikus melalui sonde.
4.6.5. Pembuatan Larutan Ovalbumin
Pembuatan larutan ovalbumin yang pada penelitian ini akan digunakan sebagai alergen dapat dilakukan dengan menggunakan putih telur ayam ras sebanyak 50 mL kemudian diaduk hingga tidak terdapat gumpalan.
Sensitisasi pada tikus dilakukan dengan pemberian 10µg ovalbumin dan 2 mg Al(OH)3 dalam 0,2 cc normal salin secara i.p pada hari pertama, ke 7 dan ke 14. Selanjutnya sensitisasi ulangan dengan inhalasi ovalbumin 1%
dalam 10 mL normal saline dengan menggunakan nebulizer selama 20 menit berkala dari hari ke 19 sampai dengan ke 22.
4.6.6. Pembuatan Preparat Dinding Bronkus
Pembuatan preparat histopatologi dinding bronkus dilakukan dengan pembedahan di Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran UMM dan pembuatan preparat histopatologi dilakukan di Laboratorium KESIMA Malang.
4.6.7. Metode Analisis Preparat Dinding Bronkus
Melihat ketebalan mukosa bronkus menggunakan mikroskop cahaya. Preparat bronkus yang telah disiapkan akan dilakukan pewarnaan terlebih dahulu menggunakan pewarnaan HE (Hematoxilin Eosin). Preparat yang telah dilakukan pewarnaan menggunakan pewarnaan HE, akan diamati dibawah mikroskop cahaya dengan perbesaran 100x untuk menentukan lapang pandang yang akan diamati, perbesaran 400x untuk mengukur ketebalan mukosa bronkus yang diukur mulai dari mukosa hingga membran basalis. Pada pengamatan ketebalan mukosa bronkus ini, pengamatan dilakukan di 4 titik pada setiap preparat bronkus yaitu pada arah jam 12, 3, 6, dan 9. Pengamatan ketebalan mukosa bronkus ini dilakukan dibawah pengawasan dari ahli Patologi Anatomi.
4.6.8. Penguburan Hewan Coba
Tikus yang telah digunakan sebagai hewan coba penelitian dipastikan sudah mati, bangkai tikus diletakkan didalam baskom. Bangkai tikus penelitian dikubur di dalam tanah dengan kedalaman 50 cm dan luas lubang 0,25 m2. Setiap lubang hanya diisi 10 ekor tikus secara bersama.
Lubang ditutup kembali dengan tanah lalu lubang dipadatkan agar tidak tercium bau dari bangkai tikus tersebut.
4.7. Alur Penelitian
Adaptasi Hewan Coba
Pengelompokan Hewan
Kontrol (-) Kontrol (+) Perlakuan 1 Perlakuan 2 Perlakuan 3
Diberi pakan standar BR-1 (15 gram) dan air minum
Diberi pakan standar BR-1 (15 gram) dan air minum.
Pada hari ke-1, ke-7, dan ke-14 diinduksi ovalbumin 70µg dan 14 mg Al(OH)3 dalam 1,4 cc normal saline secara i.p.
Diberi pakan standar BR-1 (15 gram) dan air minum
Pada hari ke-1, ke-7, dan ke-14 diinduksi ovalbumin 70µg dan 14 mg Al(OH)3 dalam 1,4 cc normal saline secara i.p.
Diberi pakan standar BR-1 (15 gram) dan air minum
Diberi pakan standar BR-1 (15 gram) dan air minum
Pada hari ke-19 dan ke-22 diberi ovalbumin 1%
dalam 10 mL normal saline dengan menggunakan nebulizer selama 30 menit per hari.
Perlakuan 2
Perlakuan 1 Perlakuan 3
Diberi pakan standar BR-1 (15 gram) dan air minum
Pada hari ke-19 dan ke-22 diberi ovalbumin 1%
dalam 10 mL normal saline dengan menggunakan nebulizer selama 30 menit per hari.
Diberi ekstrak kulit mangga dengan dosis 10,69 mg/KgBB per oral
Diberi ekstrak kulit mangga dengan dosis 5,34 mg/KgBB per oral
Diberi ekstrak kulit mangga dengan dosis 21,38 mg/KgBB per oral
Pengambilan Preparat Bronkus dengan Pembedahan
Pengumpulan Data
Analisis Data
4.8. Analisis Data
Data-data yang telah diperoleh dari penelitian ini akan dianalisa menggunakan uji normalitas, uji homogenitas, uji ANOVA, uji post hoc test, uji regresi yang pengolahannya menggunakan IBM SPSS Statistic 25 for windows dengan taraf kepercayaan 95%.
1. Uji Normalitas dan Homogenitas digunakan untuk melihat persebaran data 2. Uji ONEWAY ANNOVA digunakan untuk membuktikan adanya perbedaan ketebalan mukosa bronkus antar kelompok. Hasil uji ANOVA dikatakan ada perbedaan yang bermakna jika signifikasi (sig) < 0,05.
3. Uji Post Hoc merupakan uji kelanjutan dari uji ANOVA, digunakan untuk mengetahui perbedaan yang bermakna antara 2 kelompok perlakuan dalam penelitian.
4. Uji regresi linier sederhana digunakan untuk mengetahui seberapa kuat hubungan yang didapat dari analisa kolerasi dan untuk mengetahui seberapa kuat pengaruh antara kandungan ekstrak kulit mangga dengan perlakuan (ketebalan mukosa bronkus primer).
