INTISARI
Susu fermentasi merupakan susu yang dihasilkan dari proses fermentasi beberapa jenis bakteri, terutama bakteri asam laktat (BAL). Hasil dari fermentasi tersebut sebagian besar adalah senyawa asam laktat yang mempunyai potensi menghambat pertumbuhan bakteri patogen.
Penelitian ini bertujuan untuk menguji potensi antibakteri senyawa yang dihasilkan oleh bakteri Lactobacillus sp dalam susu fermentasi Yakult® terhadap bakteri Escherichia coli dan Enterococcus faecalis. Penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahap yaitu isolasi bakteri dalam susu fermentasi Yakult® dengan metode streak plate; isolasi senyawa yang dihasilkan bakteri Lactobacillus sp dalam susu fermentasi Yakult®; pengujian potensi senyawa yang dihasilkan bakteri Lactobacillus sp dalam susu fermentasi Yakult® dengan metode difusi menggunakan paper disc. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni dan bersifat eksploratif deskriptif.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa senyawa yang dihasilkan isolat bakteri Lactobacillus sp dalam susu fermentasi Yakult® mempunyai potensi antibakteri terhadap E.coli tetapi tidak untuk E. faecalis.
Kata kunci: Yakult®, susu fermentasi, E. coli, E. faecalis, potensi antibakteri, Lactobacillus sp.
ABSTRACT
Fermented milk is milk which produced by bacterial fermentation process, particularly acid lactic bacteria. Most of the fermentation’s result is lactic acid which have potential to inhibit pathogen bacterial growth
This research was aimed to examine antibacterial potential of compounds produced by bacteria Lactobacillus sp within Yakult® fermented milk toward Escherichia coli and Enterococcus faecalis. This research was done in several stages i.e. isolation of bacteria Lactobacillus sp within Yakult® fermented milk by streak plate method; achievement of compounds produced by bacteria Lactobacillus sp within Yakult® fermented milk and potential examination of Lactobacillus sp compounds by paper disc diffusion method. This research was a pure experimental and explorative descriptive research.
The result of research indicated that compounds produced by isolated bacteria Lactobacillus sp within Yakult® fermented milk had antibacterial potential toward E.coli but not with E.faecalis.
Keywords: Yakult®, fermented milk, E.coli, E.faecalis, antibacterial potential, Lactobacillus sp.
UJI POTENSI ANTIBAKTERI SENYAWA YANG DIHASILKAN BAKTERI DALAM SUSU FERMENTASI YAKULT ®
TERHADAP Escherichia coli DAN Enterococcus faecalis
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Ilmu Farmasi
Diajukan oleh: Aquina Alia Retnowati
NIM : 998114072
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA
2007
“Kristus Yesus datang ke dunia untuk menyelamatkan orang berdosa“, dan di antara mereka akulah yang paling berdosa. (1Tim 1:15)
Nothing in the world can take the place of Persistence.
Talent will not; nothing is more common than unsuccessful men with talent. Genius will not; unrewarded genius is almost a proverb.
Education will not; the world is full of educated derelicts. Persistence and determination alone are omnipotent.
The slogan “Press On” has solved and always will solve the problems of the human race.
- Calvin Coolidge
Kupersembahkan untuk:
Mama dan Papaku
Adikku, ‘Sahabat’ dan Temanku
PRAKATA
Puji syukur kepada Tuhan yang telah memberikan jalan serta rahmat dalam penyusunan skripsi ini. Atas berkat-Nya, penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul UJI POTENSI ANTIBAKTERI SENYAWA YANG DIHASILKAN BAKTERI DALAM SUSU FERMENTASI YAKULT® TERHADAP Escherichia coli DAN Enterococcus faecalis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
Penulis mengucapkan terimakasih kepada pihak-pihak yang telah membantu dengan memberikan dukungan secara material maupun spiritual:
1. Ibu Rita Suhadi, M.Si., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta, yang telah memberikan ijin dalam melaksanakan penelitian ini.
2. Ibu Maria Dwi Budi Jumpowati, S.Si., selaku dosen pembimbing skripsi dan dosen penguji yang memberikan bimbingan dan pengarahan selama penelitian hingga penyusunan skripsi ini selesai.
3. Ibu Yustina Sri Hartini, M.Si., Apt, dan Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si. selaku dosen penguji yang telah memberi masukan.
4. Pak Sarwanto, staf Laboratorium Mikrobiologi yang telah memberikan pelayanan sebagai laboran selama bekerja di laboratorium.
5. Papa, mama dan adikku yang telah memberikan doa dan dukungan.
6. Rm. Agung, SJ., yang telah membantu meminjamkan kamera digital dan memberikan saran yang bermanfaat untuk penelitian ini
7. Teman-teman, yang memberikan semangat dan bantuan yang berarti selama mengerjakan penelitian ini.
8. Seluruh pihak yang telah banyak membantu yang tidak dapat disebutkan satu persatu.
Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari sempurna karena penulis menyadari keterbatasan pengetahuan dan pengalaman. Oleh sebab itu penulis mengharapkan kritik dan saran.
Penulis berharap semoga skripsi in bermanfaat bagi perkembangan ilmu farmasi.
Yogyakarta, Desember 2007
Penulis
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA
Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.
Yogyakarta, 21 Desember 2007 Penulis,
Aquina Alia Retnowati
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL...i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING...ii
HALAMAN PENGESAHAN...iii
HALAMAN PERSEMBAHAN...iv
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI...v
PRAKATA...vi
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA...viii
DAFTAR ISI...ix
DAFTAR TABEL...xiii
DAFTAR GAMBAR...xiv
DAFTAR LAMPIRAN...xv
INTISARI...xvii
ABSTRACT...xviii
BAB I PENDAHULUAN...1
A. Latar Belakang ...1
1. Perumusan Masalah...3
2. Keaslian Penelitian ...3
3. Manfaat Penelitian...3
B. Tujuan Penelitian ...4
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA...5
A. Susu Fermentasi ...5
B. Susu Fermentasi Yakult®...10
C. Bakteri Asam Laktat (BAL)...11
D. Senyawa Antibakteri dalam Bakteri Asam Laktat (BAL) ...14
E. Bakteri Uji...14
1. Escherichia coli...14
2. Enterococcus faecalis...15
F. Pengujian Potensi Senyawa Antibakteri ...17
1. Metode Difusi...17
2. Metode Dilusi ...18
3. Metode Turbidimetri ...19
G. Keterangan Empiris ...19
BAB III METODOLOGI PENELITIAN...22
A. Jenis dan Rancangan Penelitian ...22
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional...22
1. Variabel Penelitian ...22
2. Definisi Operasional...23
C. Bahan dan Alat...24
1. Bahan Penelitian...24
2. Alat Penelitian ...26
D. Tata Cara Penelitian ...26
1. Isolasi Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® dengan Metode Streak Plate...26
2. Identifikasi dan Determinasi Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi
Yakult®...26
3. Isolasi Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult®...34
4. Pengujian Potensi Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® Terhadap Escherichia coli dan Enterococcus faecalis dengan Metode Difusi Menggunakan Paper Disc...34
E. Analisis Hasil ...35
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN...36
A..Isolasi Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® dengan Metode Streak Plate...36
B. Identifikasi dan Determinasi Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult®...38
1. Morfologi Sel Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult®...38
2. Morfologi Koloni Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult®...46
3. Uji Biokimia Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult®...50
C. Isolasi Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Lactobacillus sp...58
D. Pengujian Potensi Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Lactobacillus sp. terhadap E.coli dan E. faecalis dengan Metode Difusi Menggunakan Paper Disc...60
1. Pembuatan Suspensi E.coli dan E. faecalis...60
2. Pembiakan E.coli dan E.faecalis Secara Pour Plate...61
3. Pengujian Potensi Antibakteri dengan Metode Difusi Menggunakan
Paper Disc...61
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN...68
A. Kesimpulan ...68
B. Saran ...68
DAFTAR PUSTAKA...69
LAMPIRAN...72
BIOGRAFI PENULIS...90
DAFTAR TABEL
Tabel I. Beberapa ciri produksi dari susu yang difermentasi oleh bakteri asam laktat... 14 Tabel II. Hasil Pengamatan Morfologi Sel Isolat Bakteri dalam Susu
Fermentasi Yakult®... 46 Tabel III. Hasil Pengamatan Morfologi Koloni Isolat Bakteri dalam Susu
Fermentasi Yakult®... 49 Tabel IV. Hasil Uji Biokimia Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult®.... 57 Tabel V. Hasil Determinasi Isolat Bakteri dalam Fermentasi Susu Yakult®... 58 Tabel VI. Hasil pengukuran diameter zona hambat isolat Lactobacillus sp
dalam susu fermentasi Yakult® terhadap E.coli waktu inkubasi 24 jam ... 63 Tabel VII. Hasil pengukuran diameter zona hambat isolat Lactobacillus sp
dalam susu fermentasi Yakult® terhadap E.faecalis waktu inkubasi 24 jam ... 64
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Skema Kerja Penelitian ... 21 Gambar 2. Hasil Pengecatan Gram Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi
Yakult®... 41 Gambar 3. Hasil Pengecatan Acid Fast Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi
Yakult®... 43 Gambar 4. Hasil Pengecatan Spora Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi
Yakult®... 45 Gambar 5. Hasil Uji Potensi Antibakteri Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan
Lactobacillus dalam Susu Fermentasi Yakult® Terhadap E. coli... 63 Gambar 6. Hasil Uji Potensi Senyawa Antibakteri Lactobacillus dalam Susu
Fermentasi Yakult® terhadap E. faecalis...64
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Daftar Komposisi Media MRS (Man Rogosa Sharpe) Agar dan Broth Oxoid... 72 Lampiran 2. Hasil Isolasi Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® dengan
metode streak plate... 74 Lampiran 3. Hasil Pengamatan Pergerakan Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi
Yakult® dengan metode tusukan ... 75 Lampiran 4. Hasil Uji Morfologi Koloni Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi
Yakult® dalam MRS Agar Tegak ... 76 Lampiran 5. Hasil Morfologi Koloni Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi
Yakult® dalam MRS Agar Miring... 77 Lampiran 6. Hasil Morfologi Koloni Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi
Yakult®dalam MRS Cair (Broth) ... 78 Lampiran 7. Hasil Morfologi Koloni Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi
Yakult®dalam MRS Agar Plate... 79 Lampiran 8. Hasil Uji Oksidase Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult®.... 80 Lampiran 9. Hasil Uji O-F dengan Parafin Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi
Yakult®... 81 Lampiran 10. Hasil Uji O-F tanpa Parafin Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi
Yakult®...82 Lampiran 11. Hasil Uji Penggunaan Sitrat Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi
Yakult®... 83
Lampiran 12. Hasil Uji Dekarboksilase Lisin Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult®...84 Lampiran 13. Hasil Uji Hidrolisis Gelatin Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi
Yakult®... 85 Lampiran 14. Hasil Uji Pembentukan H2S Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi
Yakult®... 86 Lampiran 15. Hasil Uji Indol Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult®... 87 Lampiran 16. Hasil Uji MR (Methyl Red) Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi
Yakult®... 88 Lampiran 17. Hasil Uji VP (Voges Proskauer) Isolat Bakteri dalam Susu
Fermentasi Yakult®... 89
INTISARI
Susu fermentasi merupakan susu yang dihasilkan dari proses fermentasi beberapa jenis bakteri, terutama bakteri asam laktat (BAL). Hasil dari fermentasi tersebut sebagian besar adalah senyawa asam laktat yang mempunyai potensi menghambat pertumbuhan bakteri patogen.
Penelitian ini bertujuan untuk menguji potensi antibakteri senyawa yang dihasilkan oleh bakteri Lactobacillus sp dalam susu fermentasi Yakult® terhadap bakteri Escherichia coli dan Enterococcus faecalis. Penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahap yaitu isolasi bakteri dalam susu fermentasi Yakult® dengan metode streak plate; isolasi senyawa yang dihasilkan bakteri Lactobacillus sp dalam susu fermentasi Yakult®; pengujian potensi senyawa yang dihasilkan bakteri Lactobacillus sp dalam susu fermentasi Yakult® dengan metode difusi menggunakan paper disc. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni dan bersifat eksploratif deskriptif.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa senyawa yang dihasilkan isolat bakteri Lactobacillus sp dalam susu fermentasi Yakult® mempunyai potensi antibakteri terhadap E.coli tetapi tidak untuk E. faecalis.
Kata kunci: Yakult®, susu fermentasi, E. coli, E. faecalis, potensi antibakteri, Lactobacillus sp.
ABSTRACT
Fermented milk is milk which produced by bacterial fermentation process, particularly acid lactic bacteria. Most of the fermentation’s result is lactic acid which have potential to inhibit pathogen bacterial growth
This research was aimed to examine antibacterial potential of compounds produced by bacteria Lactobacillus sp within Yakult® fermented milk toward Escherichia coli and Enterococcus faecalis. This research was done in several stages i.e. isolation of bacteria Lactobacillus sp within Yakult® fermented milk by streak plate method; achievement of compounds produced by bacteria Lactobacillus sp within Yakult® fermented milk and potential examination of Lactobacillus sp compounds by paper disc diffusion method. This research was a pure experimental and explorative descriptive research.
The result of research indicated that compounds produced by isolated bacteria Lactobacillus sp within Yakult® fermented milk had antibacterial potential toward E.coli but not with E.faecalis.
Keywords: Yakult®, fermented milk, E.coli, E.faecalis, antibacterial potential, Lactobacillus sp.
BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang
Susu fermentasi dihasilkan dari susu (air, casein, laktosa, lemak, lactalbumin dan garam elektrolit (Alcamo, 1997) yang telah difermentasi oleh beberapa jenis bakteri sehingga menghasilkan senyawa yang dapat memberi karakteristik rasa, warna dan tekstur tertentu yang berbeda dari susu biasa (Atlas, 1997). Susu fermentasi diketahui mengandung bakteri asam laktat yang menghasilkan metabolit sekunder yang dapat menekan pertumbuhan bakteri penyebab penyakit saluran pencernaan (Buckle, Edwards, Fleet & Wootton, 1987).
Yakult® termasuk produk susu fermentasi yang beredar di pasaran yang mengandung bakteri non patogen yang berguna untuk menjaga kesehatan dengan mempertahankan keseimbangan flora usus di saluran pencernaan. Maksud mempertahankan keseimbangan flora adalah mempertahankan keadaan dimana bakteri non patogen menghasilkan efek menguntungkan (contoh: menghasilkan senyawa antimikroba) bagi usus, dapat menetralkan efek merugikan dari bakteri patogen dan bakteri pembusuk (sebagai flora yang berpotensi patogen). Hal ini dapat membantu meningkatkan sistem kekebalan di usus sehingga manusia terhindar dari penyakit-penyakit yang berhubungan dengan organ tersebut (Anonim, 2006). Produk ini mengandung bakteri yang merupakan salah satu genus bakteri asam laktat. Bakteri asam laktat (BAL) adalah bakteri yang menghasilkan asam laktat sebagai hasil utama dari metabolisme fermentasi karbohidrat (Daeschel, 1989). Senyawa
hasil fermentasi tersebut diketahui dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme lain (Frazier & Westhoff, 1988).
Asam laktat mengubah kondisi lingkungan menjadi asam (pH sekitar 3,5). Banyak bakteri patogen dihambat pertumbuhannya oleh kondisi asam tersebut dan tidak dapat tumbuh pada pH di bawah 4,5 (Nester, Anderson, Roberts, Pearsall & Nester, 2001), seperti Enterococcus faecalis dan E.coli (Holt, Krieg, Sneath, Stanley & Williams, 2000).
Dari sekian banyak spesies flora usus manusia, E.coli dan E.faecalis termasuk salah satu di dalamnya. E.coli dan E.faecalis termasuk bakteri yang berpotensial patogen di usus (Todar, 2002). Bila terjadi ketidakseimbangan flora, jumlah E.coli akan meningkat dan eksotoksin yang dihasilkan oleh E.coli juga bertambah. Eksotoksin ini yang dapat menyebabkan terjadinya diare (Nester et al., 2001). Begitu juga dengan E.faecalis, ketika tidak terjadi keseimbangan flora usus, populasi E.faecalis akan meningkat dan menghasilkan cytolysin dalam jumlah yang besar sehingga mengakibatkan penyakit infeksi enterococcal pada manusia (Koneman, Allen, Janda, Schreckenbergen, & Winn,1997).
Riana (2001) meneliti potensi senyawa yang dihasilkan oleh proses fermentasi yang dilakukan bakteri dalam dua produk susu fermentasi yaitu Yakult®
Berdasarkan latar belakang permasalahan di atas, diuji potensi senyawa yang dihasilkan oleh bakteri dalam susu fermentasi Yakult®, khususnya terhadap E.coli dan E. faecalis. Senyawa dari bakteri dalam susu fermentasi Yakult® diharapkan mempunyai potensi antibakteri terhadap E.coli dan E. faecalis. Uji potensi tersebut dapat ditunjukkan dengan diameter zona hambat yang terbentuk.
1. Perumusan Masalah
a. Bagaimana identitas isolat bakteri dalam susu fermentasi Yakult® ?
b. Apakah senyawa yang dihasilkan oleh bakteri dalam susu fermentasi Yakult® menunjukkan potensi antibakteri terhadap Escherichia coli dan Enterococcus faecalis atau tidak?
2. Keaslian Penelitian
Penelitian berjudul Uji Potensi Antibakteri Senyawa yang dihasilkan oleh bakteri dalam susu fermentasi Yakult® terhadap Enterococcus faecalis belum pernah dilakukan.
3. Manfaat Penelitian a. Manfaat teoritis
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang potensi senyawa penghambat yang dihasilkan oleh bakteri dalam susu fermentasi Yakult® terhadap E.coli dan E.faecalis.
b. Manfaat praktis
B. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan:
a. Mengetahui identitas isolat bakteri dari susu fermentasi Yakult®
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA A. Susu Fermentasi
Bahan pangan (makanan/minuman) merupakan medium pertumbuhan yang baik bagi bermacam-macam mikroorganisme. Pertumbuhan dan aktivitas mikroorganisme di dalam bahan pangan mengakibatkan kualitas pangan menjadi rusak dan terjadi pembentukan toksin. Bagi yang mengkonsumsinya dapat mengalami keracunan, bahkan kematian. Tidak semua mikroorganisme merugikan, ada mikroorganisme yang bersifat menguntungkan (Pelczar & Chan, 1988). Keuntungannya yaitu dengan menghasilkan produk pangan khusus berupa pangan fermentasi seperti keju, tempe, tape, bir, anggur, yoghurt dan lain-lain yang dapat meningkatkan nilai gizi (Tarigan, 1988). Pangan fermentasi adalah pangan yang dihasilkan dari fermentasi mikroorganisme dengan tekstur dan rasa yang lebih disukai daripada pangan biasa. Contoh pangan fermentasi yaitu sour cream, yoghurt dan blue cheese yang menggunakan bakteri sebagai mikroorganismenya dan susu sebagai media fermentasinya; minuman keras seperti bir dan wine, menggunakan mikroorganisme fungi dan media fermentasinya adalah air beras dan anggur; bumbu makanan Asia seperti soy sauce dan miso menggunakan fungi untuk memfermentasi kedelai (Nester et al, 2001; Frazier & Westhoff, 1988).
Susu termasuk bahan pangan yang bernutrisi tinggi. Bentuknya cair dan memiliki pH 7,0. Bahan yang terkandung di dalam susu adalah air (sekitar 87 %), casein (2,5 %), laktosa (5 %), lemak (4 %), sisanya lactalbumin dan garam elektrolit (Alcamo, 1997). Hal itu berarti susu merupakan media organik yaitu media yang
tersusun dari bahan-bahan organik. Media adalah bahan yang terdiri dari campuran nutrisi yang dipakai untuk menumbuhkan mikroba. Mikroba dapat tumbuh dengan baik dalam suatu media jika media tersebut: harus mengandung nutrisi yang mudah digunakan oleh bakteri, mempunyai pH yang sesuai, dan tidak mengandung zat-zat penghambat. Ada pula media sintetik yaitu media yang susunan kimianya dapat diketahui dengan pasti seperti media MRS (de Man Rogosa Sharp) yang digunakan dalam penelitian ini (Jutono dkk, 1980). MRS (Oxoid) mempunyai komposisi (g/l): peptone 10; “lab-lemco” powder 8; yeast extract 4; glucose 20; sorbitan monooleate (1 ml); dipotassium hydrogen phosphate 2; sodium acetate 3H2O 5; triammonium citrate 2; magnesium sulphate 7H2O 0,2; manganese sulphate 4H2O 0,05. Media tersebut memenuhi syarat sebagai pengganti susu karena memiliki karbohidrat (glucose), protein (peptone, yeast extract, lab-lemco), mineral (magnesium, mangan) dan komponen lain. MRS merupakan media yang mendukung pertumbuhan bakteri asam laktat sebanyak-banyaknya (Bridson, 1998).
proses pemanasan, pendinginan, pengeringan dan fermentasi (Frazier & Westhoff, 1988). Pemanasan susu cara pasteurisasi yaitu proses memanaskan susu yang dapat merusak bakteri patogen tanpa mengubah rasa dan nutrisi susu. Karena bakteri patogen terbunuh, susu tidak dapat menyebabkan penyakit, tetapi bakteri berspora dan bakteri termofil tidak dapat terbunuh dengan cara ini (Tarigan, 1988). Pendinginan dilakukan untuk menghambat pertumbuhan mikroorganisme di dalam susu selama proses penyimpanan. Untuk proses pengeringan, susu diubah menjadi bentuk kering, contohnya susu skim yang tidak ada kandungan air di dalamnya. Proses pengawetan susu dengan fermentasi, menggunakan fermentasi asam laktat (fermentasi karbohidrat menjadi asam laktat) sebagai jalan untuk mendapatkan senyawa (asam laktat) yang dapat menghambat bakteri patogen di dalam susu, sehingga kultur bakteri yang dibutuhkan untuk fermentasi ini adalah bakteri dari golongan bakteri asam laktat, karena hanya golongan bakteri ini yang dapat melakukan fermentasi asam laktat (Frazier & Westhoff, 1988).
Embden-Meyerhoff-Parnas (EMP) atau glikolisis ditemukan pada fungi dan kebanyakan bakteri. Senyawa yang dihasilkan adalah asam laktat (pada BAL), etanol, dan CO2 (pada khamir) (Fardiaz, 1992). Jalur Entner-Doudoroff (ED) hanya ditemukan pada beberapa bakteri. Hasil akhir yang diperoleh berupa etanol. Jalur Heksamonofosfat (HMF) dan Fosfoketolase ditemukan pada bakteri tergolong laktobasili heterofermentatif. Senyawa akhir yang terbentuk adalah asam laktat, etanol, dan CO2 (Boyd, 1984). Di antara ketiganya yang berguna sebagai senyawa penghambat bakteri adalah asam laktat (Prangdimurti, 2006). Untuk fermentasi asam amino, asam amino difermentasi oleh bakteri berjenis Clostridia menghasilkan senyawa lain, seperti asam propionat dan asam asetat (Fardiaz, 1992).
Dalam fermentasi pangan, kecepatan pertumbuhan mikroorganisme sangat penting karena mempengaruhi hasil fermentasi. Kecepatan pertumbuhan itu ditentukan oleh kondisi lingkungan. Untuk mendapatkan hasil fermentasi yang diinginkan, kondisi lingkungan perlu dijaga. Kondisi secara natural yang ada di dalam pangan seperti kelembaban, keasaman, dan nutrien disebut faktor intrinsik. Kondisi lingkungan seperti temperatur dan atmosfer (ada/tidaknya oksigen) penyimpanan pangan disebut faktor ekstrinsik (Nester et al., 2001).
1. Kelembaban.
tidak dapat digunakan oleh mikroorganisme karena air tersebut berinteraksi secara kimiawi dengan gula. Makanan yang mengandung garam tinggi mempunyai kelembaban yang sedikit (Nester et al., 2001).
Water activity (aw) digunakan untuk memperkirakan jumlah air dalam makanan. Air murni ber- aw: 1.0. Makanan segar ber-aw: 0.98, ham ber-aw: 0.91, selai ber- aw: 0.85, dan kue ber- aw: 0.7. Bakteri biasanya membutuhkan aw sekitar 0.9 untuk tumbuh, yang menjelaskan mengapa pangan yang kelembabannya tinggi dapat membusuk lebih cepat daripada makanan kering, bergula, atau makanan bergaram (Nester et al, 2001).
2. pH
pH pangan juga penting untuk menentukan mikroorganisme yang bisa bertahan dan hidup dalam pH tersebut. Banyak bakteri termasuk yang patogen dihambat pertumbuhannya oleh kondisi asam dan tidak dapat tumbuh pada pH di bawah 4,5. Pengecualian untuk bakteri asam laktat yang dapat tumbuh pada pH rendah 3,5 dan digunakan untuk produksi pangan fermentasi seperti yoghurt dan sauerkraut. Grup bakteri ini memproduksi asam laktat sebagai hasil metabolisme fermentasi. Meskipun mereka berguna dalam produksi pangan yaitu tumbuh dan memproduksi asam, tapi mereka juga penyebab utama pembusukan susu yang tidak dipasteurisasi dan bahan pangan lain (Nester et al, 2001).
3. Nutrien
Kemampuan mikroba dalam mensintesis vitamin, dapat tumbuh jika kondisi lainnya baik (Nester et al, 2001).
Pada umumnya nutrien harus disediakan hal-hal berikut ini: (1) donor hidrogen dan penerima hidrogen kira-kira 2 g/L; (2) sumber karbon kira-kira 1 g/L; (3) sumber nitrogen kira-kira 1 g/L; (4) mineral-mineral belerang dan fosfor, masing-masing kira-kira 50 mg/L; unsur-unsur lain masing-masing-masing-masing 0,1-1 mg/L; (5) faktor-faktor pertumbuhan : asam amino, purin, pirimidin, masin-masing kira-kira 50 mg/L; vitamin-vitamin, masing-masing 0,1-1 mg/L. Untuk mempelajari metabolisme mikroba biasanya perlu dibuat media yang seluruhnya sintetik, sehingga sifat dan konsentrasi tiap bahan diketahui secara tepat. Dalam keadaan biasa, lebih murah dan sederhana bila digunakan bahan alami seperti ekstrak ragi, sari protein atau zat-zat sejenis. Untuk banyak organisme, satu senyawa (seperti asam amino) dapat berlaku sebagai sumber energi, sumber karbon, dan sumber nitrogen; mikroorganisme lain memerlukan senyawa yang berbeda untuk tiap sumber (Jawetz dkk, 1996)
4. Temperatur Penyimpanan
5. Atmosfer
Ada atau tidaknya oksigen mempengaruhi populasi mikroorganisme yang tumbuh di dalam pangan. Contohnya Pseudomonas yang merupakan aerob obligat dan bakteri ini tidak dapat tumbuh dalam pangan yang disimpan pada kondisi tanpa oksigen. Tidak adanya oksigen dalam pangan memungkinkan pertumbuhan bakteri lain seperti anaerob obligat Clostridium botulinum (Nester et al., 2001).
B. Yakult
Yakult® adalah minuman susu fermentasi, yang dibuat dengan cara memfermentasi susu bubuk skim yang mengandung bakteri asam laktat hidup. Pada tahun 1930, Dr. Minoru Shirota, seorang dokter dan peneliti di bidang mikrobiologi, telah berhasil mengkulturkan berbagai jenis bakteri asam laktat dan memilih satu jenis bakteri yang bersifat paling tahan terhadap cairan pencernaan. (Anonim, 2006).
Bahan-bahan Yakult® terdiri dari bakteri, susu bubuk skim, sukrosa, glukosa, aroma, dan air. Kandungan gizi di dalam Yakult® (kalori 48 kcal) adalah protein 0,8 g; lemak 0,0 g; karbohidrat 11,3 g; kolesterol tidak terdeteksi; Kalsium 28,0 g; Natrium 7,8 mg; Kalium 31,2 mg; Indeks glycaemic 46 (rendah) (Anonim, 2006).
Yakult® harus selalu disimpan pada suhu di bawah 10°C supaya kualitasnya terjaga. Warna Yakult® coklat muda dan volume per botolnya 65 ml. (Anonim, 2006).
pencernaan, meningkatkan daya tahan tubuh, meningkatkan jumlah bakteri berguna dalam usus, mengurangi racun dalam usus, membatasi jumlah bakteri yang merugikan usus (Anonim, 2006).
Yakult® mulai diproduksi dan dipasarkan di Taiwan pada tahun 1964, kemudian diikuti dengan hal yang sama di negara-negara lainnya di Asia, Australia dan dipasarkan di Eropa tahun 1990-an. Saat ini jaringan global Yakult® berkembang meliputi 22 negara dan dikonsumsi sebanyak 15 juta botol perhari (Anonim, 2006).
Susu Fermentasi Yakult® pernah diteliti Riana (2001) dengan menguji daya hambat senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh bakteri dalam susu fermentasi tersebut terhadap E. coli dan S. aureus. Menurutnya dengan metode difusi sebagai salah satu metode pengujian antibakteri menunjukkan bahwa senyawa antibakteri tersebut tidak memiliki aktivitas antibakteri terhadap E. coli dan S. aureus.
C. Bakteri Asam Laktat (BAL)
Fermentasi asam laktat merupakan salah satu tipe fermentasi karbohidrat yang dilakukan oleh bakteri asam laktat dengan menghasilkan asam laktat seluruhnya, disebut fermentasi homolaktat, sedangkan bila menghasilkan asam laktat dan senyawa lain seperti etanol dan CO2 disebut fermentasi heterolaktat (Singleton & Sainsbury, 2001). Bakteri asam laktat memetabolisme karbohidrat untuk memperoleh energi dan biasanya terbatas pada lingkungan yang mengandung karbohidrat (Madigan, Martinko & Parker, 2000).
Metabolisme pada BAL (Bakteri Asam Laktat) melalui dua jalur yang berbeda yang digunakan untuk menggolongkan BAL homofermentatif dan heterofermentatif. Golongan homofermentatif memproduksi asam laktat dari glukosa lebih dari 85 % melalui jalur Embden-Meyerhoff-Parnas (EMP), sedang golongan heterofermentatif melalui jalur Fosfoketolase memproduksi asam laktat 50% dan menghasilkan produk lain yaitu asam asetat, etanol dan CO2 melalui jalur Heksosa Monofosfat Shunt (HMS). Perbedaan jalur tersebut disebabkan oleh enzim-enzim yang dimiliki berbeda (Ray & Sandine, 1992).
et al., 2001). Bakteri asam laktat sebagai starter culture (biakan pemula) yang berbeda-beda dengan fraksi susu sebagai starting substrate, menghasilkan produk susu fermentasi yang berbeda-beda pula. Sour cream contohnya, menggunakan Streptococcus cremoris atau Lactobacillus lactis untuk menghasilkan asam laktat dan Leuconostoc cremoris untuk menghasilkan rasa yang khas. Contoh lain, Bulgarian buttermilk dibuat oleh Lactobacillus bulgaricus sehingga menghasilkan asam laktat dan rasa yang khas (Atlas, 1997).
Tabel I. Beberapa ciri produksi dari susu yang difermentasi oleh bakteri asam laktat (Pelczar & Chan, 1988).
Produk Fermentasi Mikroorganisme Utama Yang Melakukan Fermentasi
Perubahan Yang Dihasilkannya Rum masam yang dibiaki
mikroorganisme
Sama dengan yang digunakan untuk pembuatan susu mentega yang dibiaki bakteri, yaitu Streptokokus, Leukonostok.
Asam dan rasa/ aroma
Susu bulgaria Lactobacillus bulgaricus Asam dan rasa/ aroma
Susu acidofilus L. acidophillus Asam dan rasa/
aroma
Yogurt Streptococcus termophilus
L. bulgaricus
Asam dan rasa/ aroma
Kefir S. lactis
L. bulgaricus
Khamir peragi laktosa
Asam dan rasa/ aroma
Kumiss Sama dengan yang dijumpai
pada kefir
Asam dan rasa/ aroma
D. Senyawa Antibakteri dalam Bakteri Asam Laktat (BAL)
asam. Hal ini akan menghambat pertumbuhan dari beberapa jenis mikroba patogen lainnya (Buckle dkk, 1987). Ray & Sandine (1992) melaporkan bahwa efek antibakteri dari asam laktat sangat kecil. Asam laktat mengubah kondisi lingkungan menjadi asam (pH sekitar 3,5). Banyak bakteri patogen dihambat pertumbuhannya oleh kondisi asam tersebut dan tidak dapat tumbuh pada pH di bawah 4,5 (Nester et al, 2001).
E. Bakteri Uji
1. Escherichia coli
E. coli penyebab yang lazim dari infeksi saluran kemih dan merupakan penyebab infeksi saluran kemih pertama pada kira-kira 90% wanita muda. E. coli sangat sering menyebabkan diare dan ditemukan di seluruh dunia khususnya pada bayi di negara berkembang (Jawetz dkk, 1996).
2. Enterococcus faecalis
E.faecalis merupakan bakteri yang mempunyai sel berbentuk cocci, berantai pendek, tidak membentuk endospora, gram positif, termasuk fakultatif anaerob dan memfermentasi laktosa (Holt et al., 2000)
F. Pengujian Potensi Senyawa Antibakteri
Pengujian potensi senyawa antibakteri dapat dilakukan dengan metode:
1. Metode difusi
Metode difusi merupakan suatu metode yang digunakan untuk mengukur daya hambat obat terhadap bakteri dengan cara mencampurkan biakan ke dalam agar cair dan membiarkannya hingga padat (Jawetz & Melnick, 1986)
a) Metode Kirby Bouwer : Suspensi bakteri dengan konsentrasi tertentu dioleskan pada permukaan media hingga rata. Di atas media diletakkan paper disc yang mengandung bahan uji, kemudian diinkubasi pada 37 °C selama 18-24 jam dan hasil dibaca dengan mengukur zona hambatan (Hugo & Russel, 1987; Anonim, 1992).
b) Metode Sumuran : Penyiapan dilakukan seperti metode Kirby Bouwer. Setelah biakan siap, dibuat sumuran dengan diameter tertentu dan tegak lurus permukaan media. Ke dalam sumuran diteteskan larutan uji, lalu inkubasi 18-24 jam pada suhu 37 °C. Cara pembacaan hasil sama dengan cara Kirby (Hugo & Russel, 1987). Pengujian senyawa antibakteri dalam bentuk polimer sukar dan lambat berdifusi ke dalam agar (Hurst & Hoover, 1993). Menurut penelitian Riana (2001) pengujian daya hambat metabolit sekunder bakteri di dalam Susu Fermentasi Yakult® dan Kefir® (Yoghurt) terhadap E. coli dan S. aureus dengan metode difusi kurang efektif karena menurutnya metabolit sekunder bakteri terebut sukar berdifusi ke dalam media agar.
dan dibiarkan membeku. Setelah itu letakkan disk dengan bahan uji di atasnya kemudian inkubasi pada suhu 37°C selama 18-24 jam. Hasil dibaca seperti cara Kirby Bouwer (Trihendrokesowo, 1986).
2. Metode dilusi
Metode ini merupakan metode di mana sejumlah obat sebagai antibakteri dicampur dalam pembenihan mikrobia uji dalam bentuk cair/padat. Pada dilusi cair, masing-masing konsentrasi obat ditambahkan suspensi mikrobia uji. Pada dilusi padat, setiap konsentrasi obat dicampurkan ke dalam media agar, setelah menjadi padat baru ditanami mikrobia uji dan setelah itu diinkubasi (Hugo & Russel,1987).
Obat dibuat dalam berbagai konsentrasi kemudian ditambahkan pada media yang mengandung bakteri uji sehingga hasil yang diperoleh adalah kekeruhan. Kekeruhan menunjukkan adanya daya hambat obat pada konsentrasi tersebut. Oleh karena itu, pada metode ini Minimum Inhibitory Concentration (MIC) dari obat tersebut dapat ditentukan. Ada tiga macam cara metode dilusi :
a) Macro Broth Dilution. Obat dibuat dalam berbagai konsentrasi pada 10 tabung kemudian ditambahkan ke dalam media cair yang telah diinokulasi dengan bakteri. Kemudian suspensi ini diinkubasi selama 15-16 jam pada suhu 35°C. Hasilnya dilihat dengan membaca kekeruhan pada masing-masing konsentrasi sehingga bisa menentukan MIC (Koneman et al, 1997).
b) Micro Broth Dilution. Cara kerja yang digunakan sama dengan metode Macro Broth Dilution hanya tabung yang digunakan berbeda (Koneman et al, 1997). c) Agar Dilusi. Menggunakan satu seri plate agar, masing-masing mengandung
terapeutik. Pembacaan hasil sama dengan metode Macro Broth Dilution (Koneman et al, 1997).
3. Metode turbidimetri
Metode ini mengidentikkan pertumbuhan bakteri dengan kekeruhan yang diukur dengan spektrofotometer. Turbidimetri merupakan metode yang sangat cocok untuk mengevaluasi pengaruh senyawa antibakteri pada saat pertumbuhan. Kelemahan metode ini adalah hanya populasi yang terkecil (106 CFU/ml) yang dapat terdeteksi oleh spektrofotometer secara akurat. Oleh karena itu, metode turbidimetri tidak dapat digunakan untuk mendeteksi jumlah bakteri dan perubahan jumlah populasi bakteri yang rendah. Pengukuran jumlah bakteri yang kurang dari 106 CFU/ml dengan spektrofotometer tidak memberikan perubahan nilai Optical Density (OD) (Davidson & Parish, 1989)
G. Keterangan Empiris
Susu fermentasi diketahui mengandung bakteri asam laktat (BAL) yang dapat menekan pertumbuhan bakteri penyebab penyakit saluran pencernaan. Salah satu produk susu fermentasi yang sudah beredar di Indonesia bahkan mancanegara adalah Yakult®. Produk ini mengandung bakteri asam laktat. Bakteri asam laktat dapat menghambat bakteri patogen dan bakteri pembusuk (flora normal yang berpotensi patogen), seperti E.coli dan E.faecalis, yang mempunyai habitat di usus besar dan urogenital manusia.
maka perlu dilakukan pengujian potensi antibakteri senyawa tersebut dengan metode difusi paper disc dan diukur diameter zona hambat yang terbentuk. Tetapi sebelum itu, bakteri dalam susu fermentasi Yakult® diisolasi dan diidentifikasi terlebih dahulu.
Isolasi bakteri dalam susu fermentasi Yakult® dengan metode streak plate
Isolat biakan murni bakteri dalam susu fermentasi Yakult®
Identifikasi Isolat bakteri dalam susu fermentasi Yakult®
Morfologi sel : 1. bentuk sel 2. rangkaian sel 3. pergerakan bakteri 4. sifat gram
5. ada/tidaknya spora 6. sifat acid fast
Morfologi koloni : Pertumbuhan bakteri dalam :
1. media MRS agar miring,
2. media MRS agar tegak,
3. media MRS agar plate,
4. media MRS cair
Uji biokimia : 1. test katalase 2. test oksidase 3. test OF tanpa dan
dengan parafin 4. penggunaan sitrat 5. test dekarboksilase
lisin
6. test hidrolisis gelatin 7. test pembentukan H2S 8. test Indol
9. test MR 10. test VP
Determinasi isolat bakteri berdasarkan buku panduan determinasi bakteri (Holt et al., 2000)
Genus isolat bakteri dalam susu fermentasi Yakult®
Isolasi senyawa yang dihasilkan bakteri dalam susu fermentasi Yakult®
Pengujian potensi antibakteri senyawa yang dihasilkan bakteri dalam susu fermentasi Yakult® terhadap Escherichia coli dan Enterococcus faecalis dengan
metode difusi paper disk
BAB III
METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental murni dan bersifat eksploratif deskriptif. Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 1. Variabel penelitian
a. Variabel bebas : Senyawa yang dihasilkan oleh bakteri dalam susu fermentasi Yakult®.
b. Variabel tergantung : Diameter zona hambat yang terbentuk.
c. Variabel pengacau terkendali : Media penanaman dan identifikasi isolat bakteri dalam susu fermentasi Yakult® yaitu MRS (de Man Rogosa Sharpe), media penanaman dan identifikasi Escherichia coli dan Enterococcus faecalis yaitu Nutrien Agar dan Nutrien Broth, suhu inkubasi 37°C, waktu inkubasi 24 jam, kepadatan suspensi bakteri uji setara dengan larutan standar Mac Farland II (6 x 108 CFU/ml), diameter paper disc 6 mm, volume suspensi bakteri uji (1 ml), volume senyawa yang dihasilkan oleh bakteri dalam susu fermentasi Yakult® yang diujikan pada bakteri uji E. coli dan E. faecalis (10 ml).
2. Definisi operasional
a. Potensi antibakteri adalah kemampuan senyawa yang dihasilkan oleh bakteri
dalam susu fermentasi Yakult® dalam menghambat pertumbuhan atau membunuh bakteri uji E. coli dan E. faecalis dengan menunjukkan diameter zona hambat yang lebih besar daripada diameter zona hambat kontrol negatif b. Yakult® adalah suatu produk susu fermentasi yang mengandung bakteri asam
laktat, sukrosa dan susu skim. Konsistensinya berbentuk cair dan dikemas di dalam botol plastik bervolume 75 ml. Produk ini berasal dari Jepang dan telah diproduksi dan dipasarkan di banyak negara termasuk Indonesia.
c. Escherichia coli ATCC 25922 diperoleh dari Balai Kesehatan Departemen Kesehatan Yogyakarta.
d. Enterococcus faecalis ATCC 33816 diperoleh dari Balai Kesehatan Departemen Kesehatan Yogyakarta.
e. Senyawa antibakteri adalah senyawa yang dihasilkan oleh bakteri asam laktat yang dapat membunuh atau menghambat pertumbuhan bakteri uji E. coli dan E. faecalis.
f. Zona hambat adalah zona jernih bakteri uji yaitu E. coli dan E. faecalis di sekitar paper disc yang telah diinokulasi senyawa yang dihasilkan oleh bakteri asam laktat.
C. Bahan dan Alat 1. Bahan penelitian
a. Yakult® (produksi PT Yakult Indonesia Persada Sukabumi),
b. Media pertumbuhan dan identifikasi isolat bakteri dalam susu fermentasi Yakult® adalah MRS (de Man Rogosa Sharpe) (Oxoid) dengan komposisi (g/l) : peptone 10; “lab-lemco” powder 8; yeast extract 4; glucose 20; sorbitan monooleate (1 ml); dipotassium hydrogen phosphate 2; sodium acetate 3H2O 5; triammonium citrate 2; magnesium sulphate 7H2O 0,2; manganese sulphate 4H2O 0,05.
c. Biakan murni bakteri uji : Escherichia coli dari Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Farmasi USD dan Enterococcus faecalis ATCC 33816 dari Balai Kesehatan Yogyakarta.
d. Media pertumbuhan dan identifikasi biakan murni bakteri uji adalah NA (Nutrient Agar) (Oxoid) dengan takaran 28 g/L dengan komposisi (g/l) : “lab-lemco” powder 1; yeast extract 2; peptone 10; sodium chloride 5; agar 15 dan NB (Nutrient Broth) dengan takaran 37 g/L dengan komposisi (g/l) : “lab-lemco” powder 1; yeast extract 2; peptone 10; sodium chloride 5.
e. Bahan untuk uji identifikasi morfologi sel :
1) Gerakan bakteri metode tusukan : media agar semi solid (0,2-0,4 % agar) 2) Pengecatan
b) Pengecatan acid fast : Ziehl Neelson carbolfuchsin, methylen blue, alcohol 96 %,
c) Pengecatan spora : malachite green 5%, safranin f. Bahan untuk uji identifikasi morfologi koloni:
1) Medium Cair : MRS (de Man Rogosa Sharpe) Broth (Oxoid) 2) Medium Agar : MRS (de Man Rogosa Sharpe) Agar (Oxoid) g. Bahan untuk tes biokimia :
1) Uji oksidase : reagens tetramethyl-paraphenyldiamine 2) Uji katalase : reagens hidrogen peroksida
3) Uji fermentasi karbohidrat : medium O-F (Difco) 4) Uji sitrat : medium Simmon’s citrate (Difco)
5) Uji dekarboksilase lisin : medium LIA (Lysin Iron Agar) (Oxoid) 6) Uji hidrolisis gelatin : Nutrient Broth (Oxoid ) dan 12 % gelatin 7) Uji hidrogen sulfida : medium TSIA (Triple Sugar Iron Agar) (Oxoid) 8) Uji indol : medium triptone water dengan reagen Kovac
9) Uji MRVP : medium MR-VP (Methyl Red – Voges Proskauer) (Oxoid), methyl red, larutan nafto 5 % dan KOH 40 %
h. Larutan standar Mc Farland II (6 x 108 CFU/ml) i. Aquadest steril
j. Kontrol positif : Penicillin (paper disc)
2. Alat penelitian
Autoklaf (ALP Co.Ltd), Microbiological Safety Cabinet, Centrifuge (Heraust Christ), Filter bakteri 0,2 μm (Millipore), Jangka sorong, Mikropipet (Nichiryo 5000 DG), Inkubator (WTB Binder, Memert), Oven (WTC Binder), Mikroskop cahaya (Olympus Type CH 30), Shaker (Stuart Scientific), Jarum ose, Jarum inokulasi, Alat-alat gelas (Pyrex).
D. Tata Cara Penelitian
1. Isolasi Bakteridalam Susu Fermentasi Yakult® dengan Metode Streak Plate
Isolasi bakteri dari susu fermentasi Yakult® dilakukan dengan metode streak plate. Satu ose Yakult® digoreskan pada permukaan agar dalam cawan petri. Setelah itu cawan petri diinkubasi terbalik selama 2 hari pada suhu 37°C. Setelah inkubasi, akan terlihat koloni yang terpisah-pisah. Tiap koloni diharapkan berasal dari satu sel bakteri dan terdiri dari satu spesies bakteri. Hasil isolasi akan digunakan untuk tahap penelitian berikutnya.
2. Identifikasi dan Determinasi Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® Bakteri dari susu fermentasi Yakult® diidentifikasi dengan pengamatan morfologi sel, morfologi koloni dan uji biokimia.
a. Pengamatan morfologi sel meliputi pergerakan bakteri dengan metode tusukan, dan pengecatan bakteri yaitu pengecatan gram, pengecatan acid fast, pengecatan spora, dan pengecatan dinding sel.
Biakan bakteri diinokulasikan pada media agar semi solid (0,2-0,4 % agar) yang telah steril dengan menggunakan jarum inokulasi secara tusukan. Kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 48 jam.
2) Pengecatan bakteri a) Pengecatan gram
Membuat pulasan isolat bakteri dari susu fermentasi Yakult® di atas obyek gelas, lalu difiksasi dengan api. Pulasan tersebut ditetesi kristal violet dan didiamkan selama 1 menit. Setelah itu dicuci dengan air mengalir untuk membuang sisa cat. Larutan iodin diteteskan ke atas pulasan tersebut dan didiamkan selama 1 menit. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan ditambahkan alkohol sebagai larutan peluntur. Pulasan tersebut dicuci dengan air mengalir lagi dan diberi larutan safranin. Langkah berikutnya pulasan yang telah diberi safranin tersebut dicuci dengan air mengalir dan dibiarkan mengering. Setelah itu diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000X menggunakan minyak emersi. Pada pengamatan sifat gram, apabila warna sel adalah violet, menunjukkan bahwa bakteri tersebut termasuk bakteri gram positif. Namun, sebaliknya bila warna merah yang terjadi, berarti bakteri tersebut merupakan bakteri gram negatif.
b) Pengecatan acid fast
ditambahkan di atasnya. Setelah itu, dipanaskan di atas api spiritus dengan nyala kecil dan didiamkan selama 5 menit. Setelah 5 menit, obyek gelas didinginkan, dicuci dengan air mengalir dan diangin-anginkan. Dicuci dengan alkohol 96 % sambil digoyang-goyangkan sampai seluruhnya tidak tampak. Sesudah itu, dicuci dengan air mengalir dan diangin-anginkan. Methylen biru dibubuhkan di atas obyek gelas dan didiamkan selama 20-30 detik. Dicuci, dikeringkan dan diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran kuat sampai 1000X menggunakan minyak emersi. Bakteri yang bersifat acid fast tampak berwarna merah, sedangkan yang non acid fast berwarna biru.
c) Pengecatan spora
Pulasan isolat bakteri dari susu fermentasi Yakult® dibuat di atas obyek gelas dan difiksasi dengan api. Setelah itu, malachite green diteteskan ke atas pulasan tersebut dan dipanaskan kembali selama 1 menit. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan diberi cat safranin selama 30-40 detik. Berikutnya dicuci dengan air mengalir kembali dan diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000X. Sel vegetatif berwarna merah dan spora berwarna hijau.
b. Pengamatan morfologi koloni.
1) Penanaman pada medium MRS agar tegak
itu, dilakukan pengamatan pertumbuhan pada bagian permukaan dan bagian dasar, juga bentuk pertumbuhan pada bekas tusukan.
2) Penanaman pada medium MRS agar miring
Medium MRS agar miring diinokulasi secara aseptik dengan biakan bakteri menggunakan jarum inokulasi secara goresan lurus. Lalu diinkubasi selama 48 jam pada suhu 37°C. Yang diamati adalah pertumbuhannya, bentuk pertumbuhan pada bekas goresan, elevasi, topografi, warna chromogenesis, bau, konsistensi dan warna medium.
3) Penanaman pada medium MRS cair
Medium MRS cair diinokulasi secara aseptik dengan biakan bakteri menggunakan ose. Inkubasi dilakukan pada suhu 37°C selama 48 jam. Pengamatannya meliputi : pertumbuhan pada permukaan, kekeruhan, bau dan endapan.
4) Penanaman pada medium MRS agar
c. Uji biokimia 1) Uji katalase
Satu atau dua ose isolat bakteri dari susu fermentasi Yakult® diinokulasikan ke dalam tabung reaksi yang berisi media Nutrien Broth sebanyak 5 ml lalu H2O2 3% diteteskan ke dalamnya. Bila terbentuk gelembung gas O2 berarti katalase positif, sedangkan sebaliknya bila tidak ada gelembung atau buih berarti katalase negatif.
2) Uji oksidase
Larutan tetramethyl-paraphenyldiamine diteteskan pada kertas saring. Satu ose dari kultur bakteri diletakkan pada kertas saring tersebut, kemudian diamati hasilnya. Reaksi positif terjadi apabila timbul perubahan warna menjadi ungu tua setelah didiamkan selama 10 menit. Hal ini berarti bakteri tersebut memiliki enzim oksidase sitokrom. Sebaliknya bila tidak terjadi perubahan warna, berarti sebagai reaksi negatif.
3) Uji oksidasi fermentasi (O-F)
dan bila medium yang ditutupi parafin berubah warna menjadi kuning berarti bakteri tersebut memetabolisme karbohidrat secara fermentatif, sedangkan untuk yang tidak ditutupi parafin bila mediumnya berubah warna menjadi kuning berarti bakteri dapat memetabolisme karbohidrat secara oksidatif
4) Uji sitrat
Satu tabung medium Simmon’s citrate yang berbentuk agar miring diinokulasi dengan satu ose kultur bakteri secara goresan. Untuk kontrol disiapkan juga satu tabung medium Simmon’s citrate tanpa inokulasi bakteri. Kemudian keduanya diinkubasi pada suhu 37°C selama 48 jam. Hasil yang diperoleh bila terjadi perubahan warna dari hijau menjadi biru menunjukkan bahwa bakteri menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon.
5) Uji dekarboksilase lisin
6) Uji hidrolisis gelatin
Kultur bakteri diinokulasikan secara tusukan pada media dengan komposisi nutrient broth 13 g/L, gelatin 12 % dan agar 0,3 %. Kontrol yang berisi medium tanpa inokulasi bakteri juga dibuat untuk pembanding. Lalu diinkubasi selama 72 jam pada suhu 37°C. Pada saat pengamatan, tabung dimasukkan ke dalam lemari es selama 30 menit. Terjadinya pencairan gelatin dibandingkan dengan kontrol membuktikan bahwa bakteri mampu menghasilkan eksoenzim gelatinase.
7) Uji pembentukan H2S
8) Uji pembentukan indol
Satu ose kultur bakteri diinokulasikan ke dalam satu tabung medium tripton water dan kemudian diinkubasi selama 48 jam dan suhu 37°C. Satu tabung medium pepton water yang lain digunakan untuk kontrol (tanpa inokulasi bakteri). Inkubasi dilakukan selama 48 jam pada suhu 37°C. Reagen Kovac ditambahkan ke dalamnya setelah inkubasi. Bila terbentuk cincin merah yang tidak larut pada permukaan medium maka itu berarti hasilnya positif. Reaksi ini menunjukkan bahwa bakteri mampu menghasilkan enzim triptofanase yang bisa mengkatalisasi penguraian gugus indol dari triptofan sehingga indol akan menumpuk dalam medium biakan sebagai produk buangan.
9) Uji MR-VP (Methyl Red-Voges Proskauer)
3.Isolasi Senyawa yang Dihasilkan oleh Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult®
Beberapa ose kultur isolat bakteri dalam susu fermentasi Yakult® diinokulasi ke dalam medium MRS cair sebanyak 100 ml di dalam erlenmeyer. Lalu diinkubasi selama 3-4 hari pada suhu 37°C dan dilakukan penggojogan berkecepatan 170 rpm di dalam shaker inkubator. Setelah itu disentrifugasi menggunakan sentrifuge yang berkecepatan 5000 rpm selama 1 jam supaya ada pemisahan senyawa penghambat dari biomassa sel yang mengendap. Supernatan disterilisasi dengan filter bakteri steril diameter 0,2 μm sehingga diperoleh metabolit sekunder yang dihasilkan Lactobacillus sp.
4. Pengujian Potensi Senyawa yang Dihasilkan oleh Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® terhadap Escherichia coli dan Enterococcus faecalis
dengan Metode Difusi Menggunakan Paper Disc
a. Pembuatan suspensi bakteri uji
Bakteri uji diinokulasikan pada medium NB (Nutrient Broth) dan diinkubasi selama 1-2 hari. Setelah itu, bakteri uji yang tumbuh di medium NB tersebut disuspensikan ke dalam Nutrient Broth steril sampai kekeruhannya setara dengan larutan standard Mac Farland II (6 x 108 CFU/ml).
b. Pembiakan bakteri uji secara pour plate.
c. Pengujian potensi antibakteri dengan metode difusi menggunakan paper disc. Supernatan disiapkan sebanyak 10 ml (yang diperoleh pada tahap 3) di dalam tabung reaksi steril. Kemudian paper disc diambil dengan pinset steril dan dicelupkan selama 10 detik ke dalam supernatan tersebut. Paper disc tersebut dikeringanginkan pada gelas arloji steril untuk menghilangkan ekses air selama 1-2 jam. Paper disc ditempatkan di permukaan medium agar yang telah mengandung bakteri uji Escherichia coli dan Enterococcus faecalis. Setelah itu, diinkubasi selama 1-2 hari atau sampai terbentuknya zona jernih di sekitar paper disc pada suhu 37ºC. Perlakuan ini dibuat agar senyawa antibakteri mempunyai waktu untuk berdifusi ke dalam agar yang telah diinokulasi bakteri uji Escherichia coli danEnterococcus faecalis. Setelah itu diameter zona jernih yang terbentuk di sekitar paper disc diukur dengan penggaris.
E. Analisis Hasil
BAB IV
HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
A. Isolasi Bakteridalam Susu Fermentasi Yakult® dengan Metode Streak Plate
Isolasi bakteri berguna untuk memisahkan bakteri dari lingkungannya dan untuk dapat mempelajari sifat biakan, morfologi dan sifat faalinya. Teknik isolasi bakteri yaitu teknik penggoresan agar (streak plate), teknik agar tuang (pour plate) dan teknik agar sebar (spread plate) (Lay, 1994). Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode streak plate yang merupakan teknik penggoresan agar. Dasar metode streak plate adalah menggoreskan suspensi bahan yang mengandung bakteri pada permukaan medium agar yang sesuai dalam petridish. Setelah inkubasi maka pada bekas goresan akan tumbuh koloni-koloni yang terpisah yang mungkin berasal dari satu sel bakteri sehingga dapat diisolasi lebih lanjut (Jutono dkk, 1980). Satu ose Yakult® digoreskan pada permukaan agar dalam cawan petri. Setelah itu
cawan petri diinkubasi terbalik selama 48 jam pada suhu 37°C. Setelah inkubasi akan terlihat koloni yang terpisah-pisah yang merupakan biakan murni. Biakan murni adalah bakteri yang terdiri dari satu spesies dan berasal dari perbanyakan satu sel bakteri (Jutono dkk, 1980). Hasil isolasi akan digunakan untuk tahap penelitian berikutnya.
Media yang digunakan untuk isolasi bakteri asam laktat dalam susu fermentasi Yakult® adalah media MRS (de Man Rogosa Sharpe) karena media ini digunakan untuk pertumbuhan dan identifikasi bakteri asam laktat yang diduga terdapat dalam susu fermentasi Yakult®. MRS (Oxoid) mempunyai komposisi (g/l)
sebagai berikut : peptone 10; “lab-lemco” powder 8; yeast extract 4; glucose 20; sorbitan monooleate (1 ml); dipotassium hydrogen phosphate 2; sodium acetate 3H2O 5; triammonium citrate 2; magnesium sulphate 7H2O 0,2; manganese sulphate 4H2O 0,05 (lampiran 1). Dari komposisinya, media MRS merupakan media yang diperkaya. Menurut Jutono dkk (1980), media yang diperkaya adalah media yang ditambah zat-zat tertentu sehingga dapat digunakan untuk menumbuhkan mikroba heterotrof (memperoleh makanan dan energi dari sumber organik) tertentu. Media merupakan nutrien yang dapat mempengaruhi pertumbuhan mikroba. Pada susu fermentasi Yakult®, media yang digunakan adalah susu dengan komposisi sbb: air (sekitar 87 %), casein /protein (2,5 %), laktosa /karbohidrat (5 %), lemak (4 %), sisanya lactalbumin dan garam elektrolit (Alcamo, 1997). Pada penelitian ini menggunakan media MRS karena media ini mempunyai komponen yang menyerupai komponen susu seperti protein (pepton), karbohidrat (glukosa) dan lemak (lab-lemco powder). Oleh karena itu bakteri dalam susu fermentasi Yakult® dapat tumbuh, diisolasi dan menghasilkan senyawa sebagai hasil fermentasi dengan menggunakan media MRS.
Pada permukaan media MRS Agar, digoreskan satu ose Yakult® kemudian
meningkatkan pertumbuhan mikroba secara maksimal sehingga dengan cepat akan terbentuk koloni pada permukaan agar di cawan petri.
Setelah diinkubasi 48 jam, tumbuh koloni-koloni mikroba yang terbentuk sepanjang goresan pada permukaan agar (Lampiran 2). Koloni hasil streak plate berbentuk circular (bulat), permukaannya licin, elevasinya convex (cembung), bentuk tepinya entire (rata), warnanya putih. Isolat bakteri ini akan digunakan untuk identifikasi dan determinasi serta pengujian potensi antibakterinya terhadap Escherichia coli dan Enterococcus faecalis.
B. Identifikasi dan Determinasi Isolat Bakteri dari Susu Fermentasi Yakult® Identifikasi mikroba digunakan untuk mengidentifikasi suatu organisme (genus) di alam dengan menggunakan semua sifat yang berkaitan dengan genus yaitu (1) ukuran, bentuk dan susunan organisme; (2) reaksi pewarnaan gram; (3) tipe flagela; (4) ukuran keseluruhan dan penampilan koloni bakteri; serta (5) informasi biokimia. Determinasi mikroba bertujuan untuk menetapkan genus suatu mikroba yang sudah diidentifikasi dengan menggunakan buku acuan sistem klasifikasi dalam Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology yang merupakan kunci bagi identifikasi dan determinasi mikroba (Volk & Wheeler, 1988).
1. Morfologi SelIsolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult®
spora, kemudian dilakukan pengamatan di bawah mikroskop dengan perbesaran kuat.
Morfologi sel penting dilakukan untuk mengetahui ukuran, bentuk, dan rangkaian selnya; ada tidaknya spora; ada tidaknya flagela; sifat gram dan sifat tahan asam (acid fast) sehingga dapat mengetahui struktur selnya.
a. Pengecatan gram
bakteri gram negatif. Pada bakteri gram positif akan terbentuk persenyawaan kompleks kristal violet yodium ribonukeat yang tidak larut dalam larutan pemucat. Persenyawaan kompleks ini tidak terbentuk pada bakteri gram negatif sehingga diduga adanya perbedaan kandungan asam ribonukleat antara bakteri gram positif dan gram negatif (Lay, 1994). Pada waktu pengecatan, larutan crystal violet menembus sel bakteri gram positif maupun sel bakteri gram negatif. Pada sel bakteri gram positif, zat ini membentuk senyawa yang sukar larut dalam cat peluntur (alkohol). Hal ini tidak terjadi pada sel bakteri gram negatif, akibatnya crystal violet dapat dilunturkan. Pada pemberian cat safranin, sel bakteri gram positif tidak dapat diwarnai, sedangkan sel bakteri gram negatif dapat diwarnai (Jutono dkk, 1980). Pada pengamatan mikroskopik, sel-sel bakteri gram positif tampak berwarna biru/ ungu. Pada bakteri gram negatif, bakteri ini tidak mengikat cat utama (crystal violet) dengan kuat sehingga dapat dilunturkan dengan cat peluntur (alkohol) dan diwarnai oleh cat lawan (safranin). Pada pengamatan mikroskopik sel-sel bakteri gram negatif tampak berwarna merah (Jutono dkk, 1980).
Perbedaan pewarnaan ini disebabkan dinding sel bakteri gram positif berbeda dengan dinding sel bakteri gram negatif; kompleks zat pewarna yodium terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan kompleks zat pewarna yodium dapat disingkirkan dari sel (Volk & Wheller, 1988).
2
1 3
Gambar 2. Hasil Pengecatan Gram Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult®.
Perbesaran kuat. Keterangan gambar:
1. Sel berwarna biru (sifat gram positif) 2. Sel berbentuk batang panjang (bacill) 3. Rangkaian sel berantai pendek
Pada hasil pengecatan gram, bakteri yang terdapat dalam susu fermentasi Yakult® bersifat gram positif. Hal ini dapat dilihat dengan terbentuknya warna biru pada pengecatan gram tersebut. Jadi bakteri ini memiliki afinitas terhadap crystal violet pada dinding selnya sehingga bakteri tidak dapat didekolorisasi dengan alkohol dan tidak dapat diwarnai oleh safranin.
b. Pengecatan acid fast
1
Gambar 3. Hasil Pengecatan Acid Fast Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult®.
Perbesaran kuat. Keterangan gambar:
1. Bakteri berwarna biru (sifat non acid fast)
c. Pengecatan spora
Adanya spora dapat ditunjukkan dengan pengecatan spora. Dengan pengecatan tersebut bagian terluar spora tampak seperti cincin kecil berwarna hijau. Tidak semua bakteri membentuk spora. Bakteri dapat membentuk satu spora dalam sel vegetatifnya. Diameter spora dapat lebih kecil atau lebih besar daripada sel vegetatifnya. Letak spora bakteri dapat sentral (di tengah sel), terminal (pada ujung sel) atau sub terminal (parasentral) jika spora terletak di antara tengah-tengah dari ujung sel (Jutono dkk, 1980).
1
Gambar 4. Hasil Pengecatan Spora Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult®
Perbesaran kuat. Keterangan gambar:
1. Sel vegetatif berwarna merah yang menunjukkan bahwa bakteri tidak berspora
d. Uji pergerakan bakteri
Uji pergerakan bakteri ini bertujuan untuk menentukan apakah suatu organisme motil atau tidak. Organisme yang motil biasa disebut organisme yang berflagella. Bakteri yang non motil tidak memiliki flagella. Pada uji pergerakan bakteri ini menggunakan metode tusukan pada media semi solid agar. Media semi solid agar mengandung agar 0,3 %. Kandungan agar 0,2-0,4 % bertujuan supaya tidak mengganggu pergerakan bakteri. Hasil positif akan menunjukkan jika organisme tumbuh menyeluruh dalam media dan media tampak lebih keruh karena terjadi pergerakan bakteri mengarah keluar dari garis inokulasi, sedangkan hasil negatif menunjukkan adanya pertumbuhan hanya pada garis inokulasi saja dan pertumbuhannya tampak jelas. Pada penelitian terhadap isolat bakteri dari susu fermentasi menunjukkan tidak adanya pergerakan bakteri (non motil). Jadi bakteri ini tidak mempunyai flagella untuk bergerak (Lampiran 3 ).
Tabel II. Hasil Morfologi Sel Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult®
Morfologi Sel Hasil Percobaan
Sifat Gram Gram Positif
Sifat Acid-Fast Non Acid Fast
Ada Tidaknya Spora Non spora
Bentuk sel & Rangkaian sel Batang panjang & Berantai pendek
Motilitas Non Motil
2. Morfologi Koloni Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult®
Menurut Bridson (1998) MRS merupakan media yang digunakan untuk penanaman dan pertumbuhan bakteri asam laktat.
a. Penanaman pada medium MRS (Man Rogosa Sharpe) agar tegak
Medium agar tegak diinokulasi secara aseptik dengan biakan murni bakteri menggunakan jarum inokulasi secara tusukan ke dalam tabung, diinkubasi pada suhu 37º C selama 48 jam. Pertumbuhan diamati pada bagian permukaan dan bagian dasar, juga bentuk pertumbuhan pada bekas tusukan (Jutono dkk, 1980).
Pertumbuhan bakteri dalam medium MRS agar tegak mengikuti arah tusukan dengan pertumbuhan yang lebat dari permukaan tabung sampai dasar tabung dan berbentuk filliform (merata pada bekas inokulasi), serta bagian permukaannya melebar (Lampiran 4).
b. Penanaman pada Medium MRS agar miring
Medium agar miring diinokulasi secara aseptik dengan biakan murni bakteri menggunakan jarum inokulasi secara goresan yang lurus, diinkubasi pada suhu 37º C selama 48 jam. Yang diamati adalah pertumbuhannya, bentuk pertumbuhan pada bekas goresan, elevasi, konsistensi dan warna medium. (Jutono dkk, 1980).
c. Penanaman pada medium MRS broth
Medium cair diinokulasi secara aseptik dengan biakan murni bakteri menggunakan ose, diinkubasi pada suhu 37º C selama 48 jam. Pengamatannya meliputi : pertumbuhan pada permukaan, kekeruhan dan endapan (Jutono dkk, 1980). Pada medium cair yang diinokulasi bakteri dapat digunakan untuk mengetahui kebutuhan oksigen bakteri. Bakteri yang tumbuh pada permukaan medium disebut bakteri aerob; kalau tumbuh keseluruhan antara permukaan dan dasar medium cair disebut bakteri fakultatif anaerob; kalau pertumbuhan bakteri hanya terdapat pada dasar medium saja disebut bakteri anaerob (Berkey, 1994).
Pada pengamatan bakteri pada medium MRS Cair terlihat bakteri tumbuh pada permukaan, tidak membentuk selaput, sangat keruh, dan banyak endapannya seperti butiran halus. Berdasarkan kebutuhan terhadap oksigen, bakteri tersebut termasuk bakteri yang bersifat fakultatif anaerob (Lampiran 6).
d. Penanaman pada medium MRS agar plate
Lactobacillus pada media agar plate biasanya berukuran 2-5 mm, konveks (cembung), entire (rata), opaque (tidak dapat ditembus cahaya), dan tanpa pigmen.
Pada hasil pengamatan diketahui bahwa permukaan medium MRS agar plate terdapat koloni bakteri (hasil isolasi dari susu fermentasi Yakult®) yang berbentuk circular (bulat/ lingkaran), permukaannya licin, elevasi convex (cembung), bentuk tepi entire (rata), dan bentuk struktur dalamnya opaque (tidak dapat tembus cahaya) (Lampiran 7).
Tabel III.Hasil Pengamatan Morfologi Koloni Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult®
Medium Pertumbuhan Koloni Sifat Morfologi Koloni yang diamati Morfologi Koloni Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® Morfologi Koloni Lactobacillus sp.
menurut Holt et al
(2000)
Pertumbuhan Merata -
Medium MRS
Agar Tegak Bentuk pertumbuhan pada bekas tusukan Filiform (pertumbuhan sepanjang bekas inokulasi merata) -
Pertumbuhan Lebat -
Bentuk pertumbuhan
pada bekas goresan
Filiform
Elevasi Convex (cembung) -
Kilat (luster) Tidak mengkilat - Topografi Licin tidak teratur - Medium MRS
Agar Miring
Ciri-ciri optik Opaque (tidak dapat ditembus cahaya) - Pertumbuhan pada permukaan Tidak membentuk selaput -
Kekeruhan Sangat keruh -
Medium MRS Cair
Endapan Banyak, butiran
halus
Pertumbuhan Tumbuh koloni di permukaan
- Bentuk koloni Circular (bulat) -
Permukaannya Smooth (licin) -
Elevasi Convex Convex
Bentuk tepi Entire (rata) Entire (rata) Medium MRS
Agar Plate
Bentuk struktur dalam
Opaque Opaque
3. Uji biokimia isolat bakteridalam susu fermentasi Yakult®
Uji biokimia bertujuan untuk mengidentifikasi bakteri berdasarkan sifat biokimianya yaitu : kemampuan bakteri untuk menghasilkan enzim yang dapat dideteksi dengan reagen sederhana, kemampuan bakteri untuk memetabolisme gula atau melakukan reaksi fermentasi, dan kemampuan bakteri untuk menggunakan substrat (glukosa, laktosa, sukrosa) untuk pertumbuhan.
a. Uji katalase
Uji ini dilakukan untuk mengetahui apakah bakteri mempunyai enzim katalase atau tidak. Enzim katalase dapat mereduksi H2O2 menjadi H2O dan O2. Uji katalase dilakukan dengan menambahkan 1 tetes pereaksi H2O2 pada tabung reaksi yang berisi medium NB (Nutrien Broth) yang telah diinokulasi dengan bakteri. Uji ini akan bersifat positif bila terbentuk gelembung gas O2 pada medium yang mengandung bakteri tersebut setelah didiamkan beberapa detik (Jutono dkk, 1980 ). Mekanisme reaksi dari uji katalase adalah: (Lay, 1994)
enzim katalase
Dari hasil uji katalase terhadap bakteri dalam susu fermentasi Yakult®, bakteri tidak membentuk gelembung gas. Hal ini menandakan bahwa uji katalase bakteri bersifat negatif yang berarti bakteri tidak dapat menghasilkan enzim katalase yang mampu mengkatalisis penguraian H2O2 menjadi H2O dan O2.
b. Uji oksidase
Uji ini dilakukan dengan menambahkan larutan tetramethyl-paraphenyldiamine pada kultur bakteri yang digoreskan pada kertas saring. Hal ini bertujuan untuk mengetahui apakah bakteri memiliki enzim oksidase sitokrom yang dapat mengoksidasi larutan reagens membentuk indofenol ungu. Apabila timbul perubahan warna menjadi ungu tua setelah didiamkan selama 10 menit berarti reaksi tersebut positif (Lay, 1994).
Pada hasil pengamatan terhadap isolat bakteri dalam susu fermentasi Yakult®, hasil menunjukkan terbentuknya warna ungu tua pada permukaan kertas saring yang berisi bakteri dan reagen tetramethyl paraphenyldiamin yang berarti isolat bakteri bereaksi positif terhadap uji oksidase. Hal ini menandakan bahwa bakteri memiliki enzim oksidase sitokrom yang dapat mengoksidasi larutan reagens sehingga membentuk indofenol ungu (Lampiran 8).
Tujuan uji ini untuk mengetahui kemampuan bakteri dalam menguraikan karbohidrat secara fermentatif dan atau secara oksidatif. Bakteri disebut fermentatif kalau pada media yang ditutup parafin terjadi perubahan dari warna hijau menjadi kuning, sebaliknya bila pada media yang tidak ditutup parafin warna hijau medianya berubah menjadi kuning maka bakteri bersifat oksidatif. Perubahan warna ini terjadi karena ada pembentukan asam yang dihasilkan dari fermentasi ataupun oksidasi glukosa. Asam yang terbentuk ini akan menurunkan pH media dan mengubah warna indikator menjadi kuning. Jika bakteri tidak dapat memfermentasi atau mengoksidasi glukosa maka warna indikator tidak berubah (Lay, 1994).
Hasil pengamatan pada media OF dan glukosa yang diinokulasi bakteri tanpa parafin adalah berwarna kuning sedangkan media yang ditutup parafin juga berwarna kuning. Jadi bakteri dapat mengoksidasi dan memfermentasi glukosa sehingga hal ini menunjukkan bahwa bakteri tersebut bersifat fakultatif anaerob (Lampiran 9 dan 10).
d. Uji sitrat
bahwa bakteri mampu menggunakan sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon (Lay, 1994).
Pada pengamatan uji ini, isolat bakteri dalam susu fermentasi Yakult® tidak mampu menggunakan sitrat sebagai satu-satumya sumber karbon, ditunjukkan dengan tidak terjadi perubahan warna media dari hijau menjadi biru (Lampiran 11).
e. Uji dekarboksilase lisin
Uji ini mempunyai tujuan untuk mengetahui apakah bakteri dapat mendekarboksilase asam amino menghasilkan CO2. Proses dekarboksilasi asam amino lazimnya menghasilkan CO2 dan dapat menetralisasikan lingkungan asam. Hal ini disebabkan enzim dekarboksilase menghilangkan gugus asam dari asam amino dan menghasilkan amina yang membuat media bersifat basa. Proses perubahan warna akan bersifat positif bila terjadi perubahan warna media ungu menjadi kuning dan menjadi ungu kembali akibat pembentukan basa amin (Lay, 1994).
Pada pengamatan menunjukkan bahwa bakteri tidak dapat mendekarboksilase asam amino, dapat dilihat dari hasil yaitu terjadi perubahan warna dari ungu menjadi warna kuning dan setelah itu tidak kembali menjadi warna ungu (Lampiran 12).
f. Uji hidrolisis gelatin
Gambar
Dokumen terkait
