UJI POTENSI ANTIBAKTERI SENYAWA YANG DIHASILKAN BAKTERI DALAM SUSU FERMENTASI YAKULT ®
TERHADAP Escherichia coli DAN Enterococcus faecalis
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)
Program Studi Ilmu Farmasi
Diajukan oleh:
Aquina Alia Retnowati
NIM : 998114072
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA
2007
“Kristus Yesus datang ke dunia untuk menyelamatkan orang berdosa“, dan di antara mereka akulah yang paling berdosa. (1Tim 1:15)
Nothing in the world can take the place of Persistence.
Talent will not; nothing is more common than unsuccessful men with talent. Genius will not; unrewarded genius is almost a proverb.
Education will not; the world is full of educated derelicts. Persistence and determination alone are omnipotent.
The slogan “Press On” has solved and always will solve the problems of the human race.
- Calvin Coolidge
Kupersembahkan untuk:
Mama dan Papaku Adikku, ‘Sahabat’ dan Temanku
PRAKATA
Puji syukur kepada Tuhan yang telah memberikan jalan serta rahmat dalam
penyusunan skripsi ini. Atas berkat-Nya, penulis dapat menyelesaikan skripsi yang
berjudul UJI POTENSI ANTIBAKTERI SENYAWA YANG DIHASILKAN
BAKTERI DALAM SUSU FERMENTASI YAKULT® TERHADAP Escherichia coli DAN Enterococcus faecalis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Farmasi (S.Farm.) di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
Yogyakarta.
Penulis mengucapkan terimakasih kepada pihak-pihak yang telah membantu
dengan memberikan dukungan secara material maupun spiritual:
1. Ibu Rita Suhadi, M.Si., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas
Sanata Dharma Yogyakarta, yang telah memberikan ijin dalam melaksanakan
penelitian ini.
2. Ibu Maria Dwi Budi Jumpowati, S.Si., selaku dosen pembimbing skripsi dan
dosen penguji yang memberikan bimbingan dan pengarahan selama
penelitian hingga penyusunan skripsi ini selesai.
3. Ibu Yustina Sri Hartini, M.Si., Apt, dan Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si.
selaku dosen penguji yang telah memberi masukan.
4. Pak Sarwanto, staf Laboratorium Mikrobiologi yang telah memberikan
pelayanan sebagai laboran selama bekerja di laboratorium.
5. Papa, mama dan adikku yang telah memberikan doa dan dukungan.
6. Rm. Agung, SJ., yang telah membantu meminjamkan kamera digital dan
memberikan saran yang bermanfaat untuk penelitian ini
7. Teman-teman, yang memberikan semangat dan bantuan yang berarti selama
mengerjakan penelitian ini.
8. Seluruh pihak yang telah banyak membantu yang tidak dapat disebutkan satu
persatu.
Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari sempurna karena penulis
menyadari keterbatasan pengetahuan dan pengalaman. Oleh sebab itu penulis
mengharapkan kritik dan saran.
Penulis berharap semoga skripsi in bermanfaat bagi perkembangan ilmu
farmasi.
Yogyakarta, Desember 2007
Penulis
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA
Saya menyatakan dengan sesungguhnya bahwa skripsi yang saya tulis ini
tidak memuat karya atau bagian karya orang lain, kecuali yang telah disebutkan
dalam kutipan dan daftar pustaka, sebagaimana layaknya karya ilmiah.
Yogyakarta, 21 Desember 2007 Penulis,
Aquina Alia Retnowati
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL...i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING...ii
HALAMAN PENGESAHAN...iii
HALAMAN PERSEMBAHAN...iv
LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI...v
PRAKATA...vi
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA...viii
DAFTAR ISI...ix
DAFTAR TABEL...xiii
DAFTAR GAMBAR...xiv
DAFTAR LAMPIRAN...xv
INTISARI...xvii
ABSTRACT...xviii
BAB I PENDAHULUAN...1
A. Latar Belakang ...1
1. Perumusan Masalah...3
2. Keaslian Penelitian ...3
3. Manfaat Penelitian...3
B. Tujuan Penelitian ...4
BAB II PENELAAHAN PUSTAKA...5
A. Susu Fermentasi ...5
B. Susu Fermentasi Yakult®...10
C. Bakteri Asam Laktat (BAL)...11
D. Senyawa Antibakteri dalam Bakteri Asam Laktat (BAL) ...14
E. Bakteri Uji...14
1. Escherichia coli...14
2. Enterococcus faecalis...15
F. Pengujian Potensi Senyawa Antibakteri ...17
1. Metode Difusi...17
2. Metode Dilusi ...18
3. Metode Turbidimetri ...19
G. Keterangan Empiris ...19
BAB III METODOLOGI PENELITIAN...22
A. Jenis dan Rancangan Penelitian ...22
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional...22
1. Variabel Penelitian ...22
2. Definisi Operasional...23
C. Bahan dan Alat...24
1. Bahan Penelitian...24
2. Alat Penelitian ...26
D. Tata Cara Penelitian ...26
1. Isolasi Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® dengan Metode Streak Plate...26
2. Identifikasi dan Determinasi Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi
Yakult®...26
3. Isolasi Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult®...34
4. Pengujian Potensi Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® Terhadap Escherichia coli dan Enterococcus faecalis dengan Metode Difusi Menggunakan Paper Disc...34
E. Analisis Hasil ...35
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN...36
A..Isolasi Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® dengan Metode Streak Plate...36
B. Identifikasi dan Determinasi Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult®...38
1. Morfologi Sel Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult®...38
2. Morfologi Koloni Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult®...46
3. Uji Biokimia Isolat Bakteridalam Susu Fermentasi Yakult®...50
C. Isolasi Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Lactobacillus sp...58
D. Pengujian Potensi Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan Lactobacillus sp. terhadap E.coli dan E. faecalis dengan Metode Difusi Menggunakan Paper Disc...60
1. Pembuatan Suspensi E.coli dan E. faecalis...60
2. Pembiakan E.coli dan E.faecalis Secara Pour Plate...61
3. Pengujian Potensi Antibakteri dengan Metode Difusi Menggunakan
Paper Disc...61
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN...68
A. Kesimpulan ...68
B. Saran ...68
DAFTAR PUSTAKA...69
LAMPIRAN...72
BIOGRAFI PENULIS...90
DAFTAR TABEL
Tabel I. Beberapa ciri produksi dari susu yang difermentasi oleh bakteri
asam laktat... 14
Tabel II. Hasil Pengamatan Morfologi Sel Isolat Bakteri dalam Susu
Fermentasi Yakult®... 46
Tabel III. Hasil Pengamatan Morfologi Koloni Isolat Bakteri dalam Susu
Fermentasi Yakult®... 49
Tabel IV. Hasil Uji Biokimia Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult®.... 57
Tabel V. Hasil Determinasi Isolat Bakteri dalam Fermentasi Susu Yakult®... 58
Tabel VI. Hasil pengukuran diameter zona hambat isolat Lactobacillus sp
dalam susu fermentasi Yakult® terhadap E.coli waktu inkubasi 24
jam ... 63
Tabel VII. Hasil pengukuran diameter zona hambat isolat Lactobacillus sp
dalam susu fermentasi Yakult® terhadap E.faecalis waktu inkubasi
24 jam ... 64
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Skema Kerja Penelitian ... 21
Gambar 2. Hasil Pengecatan Gram Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi
Yakult®... 41
Gambar 3. Hasil Pengecatan Acid Fast Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi
Yakult®... 43
Gambar 4. Hasil Pengecatan Spora Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi
Yakult®... 45
Gambar 5. Hasil Uji Potensi Antibakteri Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan
Lactobacillus dalam Susu Fermentasi Yakult® Terhadap E. coli.... 63
Gambar 6. Hasil Uji Potensi Senyawa Antibakteri Lactobacillus dalam Susu
Fermentasi Yakult® terhadap E. faecalis...64
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Daftar Komposisi Media MRS (Man Rogosa Sharpe) Agar dan
Broth Oxoid... 72
Lampiran 2. Hasil Isolasi Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® dengan
metode streak plate... 74
Lampiran 3. Hasil Pengamatan Pergerakan Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi
Yakult® dengan metode tusukan ... 75
Lampiran 4. Hasil Uji Morfologi Koloni Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi
Yakult® dalam MRS Agar Tegak ... 76
Lampiran 5. Hasil Morfologi Koloni Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi
Yakult®dalam MRS Agar Miring... 77
Lampiran 6. Hasil Morfologi Koloni Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi
Yakult®dalam MRS Cair (Broth) ... 78
Lampiran 7. Hasil Morfologi Koloni Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi
Yakult®dalam MRS Agar Plate... 79
Lampiran 8. Hasil Uji Oksidase Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult®.... 80
Lampiran 9. Hasil Uji O-F dengan ParafinIsolat Bakteridalam Susu Fermentasi
Yakult®... 81
Lampiran 10. Hasil Uji O-F tanpa Parafin Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi
Yakult®...82
Lampiran 11. Hasil Uji Penggunaan Sitrat Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi
Yakult®... 83
Lampiran 12. Hasil Uji Dekarboksilase Lisin Isolat Bakteri dalam Susu
Fermentasi Yakult®...84
Lampiran 13. Hasil Uji Hidrolisis Gelatin Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi
Yakult®... 85
Lampiran 14. Hasil Uji Pembentukan H2S Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi
Yakult®... 86
Lampiran 15. Hasil Uji Indol Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult®... 87
Lampiran 16. Hasil Uji MR (Methyl Red) Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi
Yakult®... 88
Lampiran 17. Hasil Uji VP (Voges Proskauer) Isolat Bakteri dalam Susu
Fermentasi Yakult®... 89
INTISARI
Susu fermentasi merupakan susu yang dihasilkan dari proses fermentasi beberapa jenis bakteri, terutama bakteri asam laktat (BAL). Hasil dari fermentasi tersebut sebagian besar adalah senyawa asam laktat yang mempunyai potensi menghambat pertumbuhan bakteri patogen.
Penelitian ini bertujuan untuk menguji potensi antibakteri senyawa yang dihasilkan oleh bakteri Lactobacillus sp dalam susu fermentasi Yakult® terhadap bakteri Escherichia coli dan Enterococcus faecalis. Penelitian ini dilakukan dalam beberapa tahap yaitu isolasi bakteri dalam susu fermentasi Yakult® dengan metode
streak plate; isolasi senyawa yang dihasilkan bakteri Lactobacillus sp dalam susu fermentasi Yakult®; pengujian potensi senyawa yang dihasilkan bakteri
Lactobacillus sp dalam susu fermentasi Yakult® dengan metode difusi menggunakan
paper disc. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni dan bersifat eksploratif deskriptif.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa senyawa yang dihasilkan isolat bakteri
Lactobacillus sp dalam susu fermentasi Yakult® mempunyai potensi antibakteri terhadap E.coli tetapi tidak untuk E. faecalis.
Kata kunci: Yakult®, susu fermentasi, E. coli, E. faecalis, potensi antibakteri,
Lactobacillus sp.
ABSTRACT
Fermented milk is milk which produced by bacterial fermentation process, particularly acid lactic bacteria. Most of the fermentation’s result is lactic acid which have potential to inhibit pathogen bacterial growth
This research was aimed to examine antibacterial potential of compounds produced by bacteria Lactobacillus sp within Yakult® fermented milk toward
Escherichia coli and Enterococcus faecalis. This research was done in several stages i.e. isolation of bacteria Lactobacillus sp within Yakult® fermented milk by streak plate method; achievement of compounds produced by bacteria Lactobacillus sp
within Yakult® fermented milk and potential examination of Lactobacillus sp
compounds by paper disc diffusion method. This research was a pure experimental and explorative descriptive research.
The result of research indicated that compounds produced by isolated bacteria Lactobacillus sp within Yakult® fermented milk had antibacterial potential toward E.coli but not with E.faecalis.
Keywords: Yakult®, fermented milk, E.coli, E.faecalis, antibacterial potential,
Lactobacillus sp.
BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang
Susu fermentasi dihasilkan dari susu (air, casein, laktosa, lemak,
lactalbumin dan garam elektrolit (Alcamo, 1997) yang telah difermentasi oleh
beberapa jenis bakteri sehingga menghasilkan senyawa yang dapat memberi
karakteristik rasa, warna dan tekstur tertentu yang berbeda dari susu biasa (Atlas,
1997). Susu fermentasi diketahui mengandung bakteri asam laktat yang
menghasilkan metabolit sekunder yang dapat menekan pertumbuhan bakteri
penyebab penyakit saluran pencernaan (Buckle, Edwards, Fleet & Wootton, 1987).
Yakult® termasuk produk susu fermentasi yang beredar di pasaran yang mengandung bakteri non patogen yang berguna untuk menjaga kesehatan dengan
mempertahankan keseimbangan flora usus di saluran pencernaan. Maksud
mempertahankan keseimbangan flora adalah mempertahankan keadaan dimana
bakteri non patogen menghasilkan efek menguntungkan (contoh: menghasilkan
senyawa antimikroba) bagi usus, dapat menetralkan efek merugikan dari bakteri
patogen dan bakteri pembusuk (sebagai flora yang berpotensi patogen). Hal ini dapat
membantu meningkatkan sistem kekebalan di usus sehingga manusia terhindar dari
penyakit-penyakit yang berhubungan dengan organ tersebut (Anonim, 2006). Produk
ini mengandung bakteri yang merupakan salah satu genus bakteri asam laktat.
Bakteri asam laktat (BAL) adalah bakteri yang menghasilkan asam laktat sebagai
hasil utama dari metabolisme fermentasi karbohidrat (Daeschel, 1989). Senyawa
hasil fermentasi tersebut diketahui dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme
lain (Frazier & Westhoff, 1988).
Asam laktat mengubah kondisi lingkungan menjadi asam (pH sekitar 3,5).
Banyak bakteri patogen dihambat pertumbuhannya oleh kondisi asam tersebut dan
tidak dapat tumbuh pada pH di bawah 4,5 (Nester, Anderson, Roberts, Pearsall &
Nester, 2001), seperti Enterococcus faecalis dan E.coli (Holt, Krieg, Sneath, Stanley
& Williams, 2000).
Dari sekian banyak spesies flora usus manusia, E.coli dan E.faecalis termasuk
salah satu di dalamnya. E.coli dan E.faecalis termasuk bakteri yang berpotensial
patogen di usus (Todar, 2002). Bila terjadi ketidakseimbangan flora, jumlah E.coli
akan meningkat dan eksotoksin yang dihasilkan oleh E.coli juga bertambah.
Eksotoksin ini yang dapat menyebabkan terjadinya diare (Nester et al., 2001). Begitu
juga dengan E.faecalis, ketika tidak terjadi keseimbangan flora usus, populasi
E.faecalis akan meningkat dan menghasilkan cytolysin dalam jumlah yang besar
sehingga mengakibatkan penyakit infeksi enterococcal pada manusia (Koneman,
Allen, Janda, Schreckenbergen, & Winn,1997).
Riana (2001) meneliti potensi senyawa yang dihasilkan oleh proses
fermentasi yang dilakukan bakteri dalam dua produk susu fermentasi yaitu Yakult® dan Kefir® (Yoghurt) terhadap E. coli dan S. aureus dengan metode difusi. Hasil penelitian Riana (2001) menyimpulkan bahwa metabolit sekunder bakteri yang
Berdasarkan latar belakang permasalahan di atas, diuji potensi senyawa yang
dihasilkan oleh bakteri dalam susu fermentasi Yakult®, khususnya terhadap E.coli
dan E. faecalis. Senyawa dari bakteri dalam susu fermentasi Yakult® diharapkan
mempunyai potensi antibakteri terhadap E.coli dan E. faecalis. Uji potensi tersebut
dapat ditunjukkan dengan diameter zona hambat yang terbentuk.
1. Perumusan Masalah
a. Bagaimana identitas isolat bakteri dalam susu fermentasi Yakult® ?
b. Apakah senyawa yang dihasilkan oleh bakteri dalam susu fermentasi Yakult®
menunjukkan potensi antibakteri terhadap Escherichia coli dan Enterococcus
faecalis atau tidak?
2. Keaslian Penelitian
Penelitian berjudul Uji Potensi Antibakteri Senyawa yang dihasilkan oleh
bakteri dalam susu fermentasi Yakult® terhadap Enterococcus faecalis belum pernah dilakukan.
3. Manfaat Penelitian a. Manfaat teoritis
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang potensi
senyawa penghambat yang dihasilkan oleh bakteri dalam susu fermentasi
Yakult® terhadap E.coli dan E.faecalis.
b. Manfaat praktis
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan sumbangan informasi bagi
pengobatan, tentang senyawa yang dihasilkan oleh bakteri dalam susu fermentasi
B. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan:
a. Mengetahui identitas isolat bakteri dari susu fermentasi Yakult®
b. Mengetahui ada tidaknya potensi antibakteri dari senyawa yang dihasilkan
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA A. Susu Fermentasi
Bahan pangan (makanan/minuman) merupakan medium pertumbuhan yang
baik bagi bermacam-macam mikroorganisme. Pertumbuhan dan aktivitas
mikroorganisme di dalam bahan pangan mengakibatkan kualitas pangan menjadi
rusak dan terjadi pembentukan toksin. Bagi yang mengkonsumsinya dapat
mengalami keracunan, bahkan kematian. Tidak semua mikroorganisme merugikan,
ada mikroorganisme yang bersifat menguntungkan (Pelczar & Chan, 1988).
Keuntungannya yaitu dengan menghasilkan produk pangan khusus berupa pangan
fermentasi seperti keju, tempe, tape, bir, anggur, yoghurt dan lain-lain yang dapat
meningkatkan nilai gizi (Tarigan, 1988). Pangan fermentasi adalah pangan yang
dihasilkan dari fermentasi mikroorganisme dengan tekstur dan rasa yang lebih
disukai daripada pangan biasa. Contoh pangan fermentasi yaitu sour cream, yoghurt
dan blue cheese yang menggunakan bakteri sebagai mikroorganismenya dan susu
sebagai media fermentasinya; minuman keras seperti bir dan wine, menggunakan
mikroorganisme fungi dan media fermentasinya adalah air beras dan anggur; bumbu
makanan Asia seperti soy sauce dan miso menggunakan fungi untuk memfermentasi
kedelai (Nester et al, 2001; Frazier & Westhoff, 1988).
Susu termasuk bahan pangan yang bernutrisi tinggi. Bentuknya cair dan
memiliki pH 7,0. Bahan yang terkandung di dalam susu adalah air (sekitar 87 %),
casein (2,5 %), laktosa (5 %), lemak (4 %), sisanya lactalbumin dan garam elektrolit
(Alcamo, 1997). Hal itu berarti susu merupakan media organik yaitu media yang
tersusun dari bahan-bahan organik. Media adalah bahan yang terdiri dari campuran
nutrisi yang dipakai untuk menumbuhkan mikroba. Mikroba dapat tumbuh dengan
baik dalam suatu media jika media tersebut: harus mengandung nutrisi yang mudah
digunakan oleh bakteri, mempunyai pH yang sesuai, dan tidak mengandung zat-zat
penghambat. Ada pula media sintetik yaitu media yang susunan kimianya dapat
diketahui dengan pasti seperti media MRS (de Man Rogosa Sharp) yang digunakan
dalam penelitian ini (Jutono dkk, 1980). MRS (Oxoid) mempunyai komposisi (g/l):
peptone 10; “lab-lemco” powder 8; yeast extract 4; glucose 20; sorbitan monooleate
(1 ml); dipotassium hydrogen phosphate 2; sodium acetate 3H2O 5; triammonium
citrate 2; magnesium sulphate 7H2O 0,2; manganese sulphate 4H2O 0,05. Media
tersebut memenuhi syarat sebagai pengganti susu karena memiliki karbohidrat
(glucose), protein (peptone, yeast extract, lab-lemco), mineral (magnesium, mangan)
dan komponen lain. MRS merupakan media yang mendukung pertumbuhan bakteri
asam laktat sebanyak-banyaknya (Bridson, 1998).
Mikroorganisme memperoleh energi untuk tumbuh dengan memetabolisme
bahan yang terkandung di dalam susu sehingga dapat merusak kualitas susu tersebut.
Bentuk kerusakan yang ditimbulkannya berupa perubahan pada penampilan, susunan
kimia dan cita rasa susu (Fardiaz, 1992). Perubahan ini terjadi disebabkan adanya
pembentukan gas, lendir, dan alkali; pemecahan protein, dan lemak; perubahan
warna dan rasa pada susu. Supaya bisa dikonsumsi, kerusakan susu harus dicegah
dengan meminimalisir mikroorganisme yang hidup di dalam susu dengan proses
pengawetan. Selain mengurangi mikroorganisme, proses ini harus tetap menjaga
proses pemanasan, pendinginan, pengeringan dan fermentasi (Frazier & Westhoff,
1988). Pemanasan susu cara pasteurisasi yaitu proses memanaskan susu yang dapat
merusak bakteri patogen tanpa mengubah rasa dan nutrisi susu. Karena bakteri
patogen terbunuh, susu tidak dapat menyebabkan penyakit, tetapi bakteri berspora
dan bakteri termofil tidak dapat terbunuh dengan cara ini (Tarigan, 1988).
Pendinginan dilakukan untuk menghambat pertumbuhan mikroorganisme di dalam
susu selama proses penyimpanan. Untuk proses pengeringan, susu diubah menjadi
bentuk kering, contohnya susu skim yang tidak ada kandungan air di dalamnya.
Proses pengawetan susu dengan fermentasi, menggunakan fermentasi asam laktat
(fermentasi karbohidrat menjadi asam laktat) sebagai jalan untuk mendapatkan
senyawa (asam laktat) yang dapat menghambat bakteri patogen di dalam susu,
sehingga kultur bakteri yang dibutuhkan untuk fermentasi ini adalah bakteri dari
golongan bakteri asam laktat, karena hanya golongan bakteri ini yang dapat
melakukan fermentasi asam laktat (Frazier & Westhoff, 1988).
Fermentasi merupakan reaksi keseimbangan oksidasi reduksi dimana
beberapa atom energi (donor elektron) direduksi dan yang lain dioksidasi. Pada jalan
fermentasi, senyawa organik merupakan donor elektron (agen pereduksi) dan produk
substrat bertindak sebagai akseptor elektron (agen pengoksidasi) (Atlas, 1984).
Proses fermentasi juga didefinisikan sebagai proses pemecahan karbohidrat dan asam
amino secara anaerobik, yaitu tanpa memerlukan oksigen. Senyawa yang dapat
dipecah dalam proses fermentasi terutama adalah karbohidrat, sedangkan asam
amino hanya dapat difermentasi oleh beberapa jenis bakteri tertentu. Pada bakteri
Embden-Meyerhoff-Parnas (EMP) atau glikolisis ditemukan pada fungi dan
kebanyakan bakteri. Senyawa yang dihasilkan adalah asam laktat (pada BAL),
etanol, dan CO2 (pada khamir) (Fardiaz, 1992). Jalur Entner-Doudoroff (ED) hanya
ditemukan pada beberapa bakteri. Hasil akhir yang diperoleh berupa etanol. Jalur
Heksamonofosfat (HMF) dan Fosfoketolase ditemukan pada bakteri tergolong
laktobasili heterofermentatif. Senyawa akhir yang terbentuk adalah asam laktat,
etanol, dan CO2 (Boyd, 1984). Di antara ketiganya yang berguna sebagai senyawa
penghambat bakteri adalah asam laktat (Prangdimurti, 2006). Untuk fermentasi asam
amino, asam amino difermentasi oleh bakteri berjenis Clostridia menghasilkan
senyawa lain, seperti asam propionat dan asam asetat (Fardiaz, 1992).
Dalam fermentasi pangan, kecepatan pertumbuhan mikroorganisme sangat
penting karena mempengaruhi hasil fermentasi. Kecepatan pertumbuhan itu
ditentukan oleh kondisi lingkungan. Untuk mendapatkan hasil fermentasi yang
diinginkan, kondisi lingkungan perlu dijaga. Kondisi secara natural yang ada di
dalam pangan seperti kelembaban, keasaman, dan nutrien disebut faktor intrinsik.
Kondisi lingkungan seperti temperatur dan atmosfer (ada/tidaknya oksigen)
penyimpanan pangan disebut faktor ekstrinsik (Nester et al., 2001).
1. Kelembaban.
Produk pangan berubah secara drastis ketika air dapat diambil oleh
mikroorganisme untuk tumbuh. Daging segar dan susu adalah contoh bahan pangan
yang mempunyai banyak air dan dapat mendukung pertumbuhan mikroorganisme.
Roti, kacang, dan makanan kering mempunyai lingkungan yang kering. Beberapa
tidak dapat digunakan oleh mikroorganisme karena air tersebut berinteraksi secara
kimiawi dengan gula. Makanan yang mengandung garam tinggi mempunyai
kelembaban yang sedikit (Nester et al., 2001).
Water activity (aw) digunakan untuk memperkirakan jumlah air dalam
makanan. Air murni ber- aw: 1.0. Makanan segar ber-aw: 0.98, ham ber-aw: 0.91, selai
ber- aw: 0.85, dan kue ber- aw: 0.7. Bakteri biasanya membutuhkan aw sekitar 0.9
untuk tumbuh, yang menjelaskan mengapa pangan yang kelembabannya tinggi dapat
membusuk lebih cepat daripada makanan kering, bergula, atau makanan bergaram
(Nester et al, 2001).
2. pH
pH pangan juga penting untuk menentukan mikroorganisme yang bisa
bertahan dan hidup dalam pH tersebut. Banyak bakteri termasuk yang patogen
dihambat pertumbuhannya oleh kondisi asam dan tidak dapat tumbuh pada pH di
bawah 4,5. Pengecualian untuk bakteri asam laktat yang dapat tumbuh pada pH
rendah 3,5 dan digunakan untuk produksi pangan fermentasi seperti yoghurt dan
sauerkraut. Grup bakteri ini memproduksi asam laktat sebagai hasil metabolisme
fermentasi. Meskipun mereka berguna dalam produksi pangan yaitu tumbuh dan
memproduksi asam, tapi mereka juga penyebab utama pembusukan susu yang tidak
dipasteurisasi dan bahan pangan lain (Nester et al, 2001).
3. Nutrien
Nutrien ada dalam makanan seperti faktor intrinsik lainnya yaitu menentukan
jenis mikroorganisme yang dapat tumbuh di dalamnya. Mikroorganisme yang
Kemampuan mikroba dalam mensintesis vitamin, dapat tumbuh jika kondisi lainnya
baik (Nester et al, 2001).
Pada umumnya nutrien harus disediakan hal-hal berikut ini: (1) donor
hidrogen dan penerima hidrogen kira-kira 2 g/L; (2) sumber karbon kira-kira 1 g/L;
(3) sumber nitrogen kira-kira 1 g/L; (4) mineral-mineral belerang dan fosfor,
masing-masing kira-kira 50 mg/L; unsur-unsur lain masing-masing-masing-masing 0,1-1 mg/L; (5)
faktor-faktor pertumbuhan : asam amino, purin, pirimidin, masin-masing kira-kira 50 mg/L;
vitamin-vitamin, masing-masing 0,1-1 mg/L. Untuk mempelajari metabolisme
mikroba biasanya perlu dibuat media yang seluruhnya sintetik, sehingga sifat dan
konsentrasi tiap bahan diketahui secara tepat. Dalam keadaan biasa, lebih murah dan
sederhana bila digunakan bahan alami seperti ekstrak ragi, sari protein atau zat-zat
sejenis. Untuk banyak organisme, satu senyawa (seperti asam amino) dapat berlaku
sebagai sumber energi, sumber karbon, dan sumber nitrogen; mikroorganisme lain
memerlukan senyawa yang berbeda untuk tiap sumber (Jawetzdkk, 1996)
4. Temperatur Penyimpanan
Temperatur ini mempengaruhi kecepatan pertumbuhan mikroorganisme
dalam makanan. Di bawah titik beku, air menjadi kristal dan tidak dapat diperoleh,
pertumbuhan mikroba pun terhenti karena membutuhkan kelembaban. Pada suhu
yang rendah, banyak reaksi enzim berjalan dengan lambat sehingga mikroorganisme
tidak dapat tumbuh. Hal ini dapat mengurangi kecepatan pertumbuhan (Nester et al.,
5. Atmosfer
Ada atau tidaknya oksigen mempengaruhi populasi mikroorganisme yang
tumbuh di dalam pangan. Contohnya Pseudomonas yang merupakan aerob obligat
dan bakteri ini tidak dapat tumbuh dalam pangan yang disimpan pada kondisi tanpa
oksigen. Tidak adanya oksigen dalam pangan memungkinkan pertumbuhan bakteri
lain seperti anaerob obligat Clostridium botulinum (Nester et al., 2001).
B. Yakult
Yakult® adalah minuman susu fermentasi, yang dibuat dengan cara
memfermentasi susu bubuk skim yang mengandung bakteri asam laktat hidup. Pada
tahun 1930, Dr. Minoru Shirota, seorang dokter dan peneliti di bidang mikrobiologi,
telah berhasil mengkulturkan berbagai jenis bakteri asam laktat dan memilih satu
jenis bakteri yang bersifat paling tahan terhadap cairan pencernaan. (Anonim, 2006).
Bahan-bahan Yakult® terdiri dari bakteri, susu bubuk skim, sukrosa,
glukosa, aroma, dan air. Kandungan gizi di dalam Yakult® (kalori 48 kcal) adalah
protein 0,8 g; lemak 0,0 g; karbohidrat 11,3 g; kolesterol tidak terdeteksi; Kalsium
28,0 g; Natrium 7,8 mg; Kalium 31,2 mg; Indeks glycaemic 46 (rendah) (Anonim,
2006).
Yakult® harus selalu disimpan pada suhu di bawah 10°C supaya
kualitasnya terjaga. Warna Yakult® coklat muda dan volume per botolnya 65 ml.
(Anonim, 2006).
Manfaat Yakult® terletak pada bakterinya yang mampu hidup sampai usus
pencernaan, meningkatkan daya tahan tubuh, meningkatkan jumlah bakteri berguna
dalam usus, mengurangi racun dalam usus, membatasi jumlah bakteri yang
merugikan usus (Anonim, 2006).
Yakult® mulai diproduksi dan dipasarkan di Taiwan pada tahun 1964,
kemudian diikuti dengan hal yang sama di negara-negara lainnya di Asia, Australia
dan dipasarkan di Eropa tahun 1990-an. Saat ini jaringan global Yakult® berkembang
meliputi 22 negara dan dikonsumsi sebanyak 15 juta botol perhari (Anonim, 2006).
Susu Fermentasi Yakult® pernah diteliti Riana (2001) dengan menguji daya
hambat senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh bakteri dalam susu fermentasi
tersebut terhadap E. coli dan S. aureus. Menurutnya dengan metode difusi sebagai
salah satu metode pengujian antibakteri menunjukkan bahwa senyawa antibakteri
tersebut tidak memiliki aktivitas antibakteri terhadap E. coli dan S. aureus.
C. Bakteri Asam Laktat (BAL)
Bakteri asam laktat (BAL) adalah bakteri golongan gram positif, tidak
berspora dan mempunyai kemampuan dalam memfermentasi gula menjadi asam
laktat (Singleton & Sainsbury, 2001). Kebanyakan BAL tidak sensitif oleh O2 dan
dapat tumbuh saat ada O2 sama baiknya dengan tidak ada O2. BAL termasuk anaerob
aerotoleran. Yang termasuk bakteri asam laktat adalah famili Lactobacillaceae yaitu
Lactobacillus dan famili Streptococaceae terutama Leuconostoc, Streptococcus dan
Pediococcus. Bakteri ini sering digunakan dalam pembuatan produk-produk
fermentasi seperti fermentasi sayuran, fermentasi susu dan fermentasi ikan (Fardiaz,
Fermentasi asam laktat merupakan salah satu tipe fermentasi karbohidrat
yang dilakukan oleh bakteri asam laktat dengan menghasilkan asam laktat
seluruhnya, disebut fermentasi homolaktat, sedangkan bila menghasilkan asam laktat
dan senyawa lain seperti etanol dan CO2 disebut fermentasi heterolaktat (Singleton &
Sainsbury, 2001). Bakteri asam laktat memetabolisme karbohidrat untuk
memperoleh energi dan biasanya terbatas pada lingkungan yang mengandung
karbohidrat (Madigan, Martinko & Parker, 2000).
Metabolisme pada BAL (Bakteri Asam Laktat) melalui dua jalur yang
berbeda yang digunakan untuk menggolongkan BAL homofermentatif dan
heterofermentatif. Golongan homofermentatif memproduksi asam laktat dari glukosa
lebih dari 85 % melalui jalur Embden-Meyerhoff-Parnas (EMP), sedang golongan
heterofermentatif melalui jalur Fosfoketolase memproduksi asam laktat 50% dan
menghasilkan produk lain yaitu asam asetat, etanol dan CO2 melalui jalur Heksosa
Monofosfat Shunt (HMS). Perbedaan jalur tersebut disebabkan oleh enzim-enzim
yang dimiliki berbeda (Ray & Sandine, 1992).
Dalam industri, susu yang difermentasi dihasilkan dengan cara menginokulasi
susu yang telah dipasteurisasi dengan suatu biakan mikoorganisme yang disebut
biakan pemula (starter culture). Biakan pemula tersebut digunakan untuk
menghasilkan fermentasi yang dikehendaki, sehingga menjamin dihasilkannya
produk yang baik dan seragam (Pelczar & Chan, 1988). Fermentasi di dalam susu
biasa dilakukan oleh bakteri asam laktat dengan memetabolisme laktosa susu melalui
jalan fermentasi asam laktat. Terkumpulnya asam laktat sebagai produk akhir
et al., 2001). Bakteri asam laktat sebagai starter culture (biakan pemula) yang
berbeda-beda dengan fraksi susu sebagai starting substrate, menghasilkan produk
susu fermentasi yang berbeda-beda pula. Sour cream contohnya, menggunakan
Streptococcus cremoris atau Lactobacillus lactis untuk menghasilkan asam laktat dan
Leuconostoc cremoris untuk menghasilkan rasa yang khas. Contoh lain, Bulgarian
buttermilk dibuat oleh Lactobacillus bulgaricus sehingga menghasilkan asam laktat
dan rasa yang khas (Atlas, 1997).
Tabel I. Beberapa ciri produksi dari susu yang difermentasi oleh bakteri asam laktat (Pelczar & Chan, 1988).
Produk Fermentasi Mikroorganisme Utama Yang Melakukan Fermentasi
Streptokokus, Leukonostok.
Asam dan rasa/ aroma
Susu bulgaria Lactobacillus bulgaricus Asam dan rasa/ aroma
Susu acidofilus L. acidophillus Asam dan rasa/ aroma
Yogurt Streptococcus termophilus L. bulgaricus
Kumiss Sama dengan yang dijumpai pada kefir
Asam dan rasa/ aroma
D. Senyawa Antibakteri dalam Bakteri Asam Laktat (BAL)
Senyawa antibakteri dalam bakteri asam laktat (BAL) yang paling banyak
ditemukan adalah asam laktat. Bakteri asam laktat menghasilkan sejumlah besar
asam laktat sebagai hasil akhir dari metabolisme karbohidrat. Asam yang dihasilkan
asam. Hal ini akan menghambat pertumbuhan dari beberapa jenis mikroba patogen
lainnya (Buckle dkk, 1987). Ray & Sandine (1992) melaporkan bahwa efek
antibakteri dari asam laktat sangat kecil. Asam laktat mengubah kondisi lingkungan
menjadi asam (pH sekitar 3,5). Banyak bakteri patogen dihambat pertumbuhannya
oleh kondisi asam tersebut dan tidak dapat tumbuh pada pH di bawah 4,5 (Nester et
al, 2001).
E. Bakteri Uji 1. Escherichia coli
E.coli merupakan bakteri gram negatif, berbentuk batang lurus, fakultatif
anaerob, fermentasi dan respirasi sebagai metabolismenya (Holt, et al, 2000). E. coli
adalah anggota flora normal usus besar dan termasuk bakteri enterik. Bakteri enterik
pada umumnya tidak menyebabkan penyakit dalam usus, tetapi berperan terhadap
fungsi dan nutrisi normal. Ketika terjadi infeksi yang penting secara klinik biasanya
disebabkan oleh E. coli. Tempat paling sering terkena infeksi adalah saluran kemih,
saluran empedu, dan tempat lain di rongga perut. Ketika pertahanan normal inang
menjadi tidak memadai yaitu pada bayi / lanjut usia, pada pasien stadium akhir, pada
pasien pengguna obat imunosupressan, saat pemasangan kateter uretra/ infus vena,
bakteri dapat bersifat patogen. Sifat patogennya dapat menyebabkan perempuan
mengalami infeksi saluran kemih juga menyebabkan infeksi pada saluran intestinal
karena E.coli mengeluarkan enterotoksin, menginvasi dan mengkolonisasi usus; juga
E. coli penyebab yang lazim dari infeksi saluran kemih dan merupakan
penyebab infeksi saluran kemih pertama pada kira-kira 90% wanita muda. E. coli
sangat sering menyebabkan diare dan ditemukan di seluruh dunia khususnya pada
bayi di negara berkembang (Jawetz dkk, 1996).
2. Enterococcus faecalis
E.faecalis merupakan bakteri yang mempunyai sel berbentuk cocci, berantai
pendek, tidak membentuk endospora, gram positif, termasuk fakultatif anaerob dan
memfermentasi laktosa (Holt et al., 2000)
E.faecalis yang bergenus Enterococcus merupakan flora normal dari
gastrointestinal dan saluran kemih. Bakteri ini biasanya dapat menjadi penyebab
penyakit pada manusia, dan penyakit tersebut dapat menjadi parah karena resisten
terhadap antimikroba (Koneman et al., 1997). E.faecalis sering menyebabkan
85-90% infeksi nokosomial. Tempat infeksi yang paling sering adalah saluran kemih,
luka tusuk, saluran empedu dan darah (Jawetzdkk, 1996). Beberapa strain E.faecalis
menghasilkan sitolisin (cytolysin) yang bertindak sebagai hemolisin yang menyerang
eritrosit manusia. E.faecalis lebih sering diisolasi dari spesimen klinis manusia dan
dari saluran gastrointestinal manusia. Bakteri ini lebih sering diisolasi yang
menghubungkan dengan 80%-90% infeksi enterokokal manusia (Koneman et al.,
F. Pengujian Potensi Senyawa Antibakteri
Pengujian potensi senyawa antibakteri dapat dilakukan dengan metode:
1. Metode difusi
Metode difusi merupakan suatu metode yang digunakan untuk mengukur
daya hambat obat terhadap bakteri dengan cara mencampurkan biakan ke dalam agar
cair dan membiarkannya hingga padat (Jawetz & Melnick, 1986)
a) Metode Kirby Bouwer : Suspensi bakteri dengan konsentrasi tertentu dioleskan
pada permukaan media hingga rata. Di atas media diletakkan paper disc yang
mengandung bahan uji, kemudian diinkubasi pada 37 °C selama 18-24 jam dan
hasil dibaca dengan mengukur zona hambatan (Hugo & Russel, 1987; Anonim,
1992).
b) Metode Sumuran : Penyiapan dilakukan seperti metode Kirby Bouwer. Setelah
biakan siap, dibuat sumuran dengan diameter tertentu dan tegak lurus permukaan
media. Ke dalam sumuran diteteskan larutan uji, lalu inkubasi 18-24 jam pada
suhu 37 °C. Cara pembacaan hasil sama dengan cara Kirby (Hugo & Russel,
1987). Pengujian senyawa antibakteri dalam bentuk polimer sukar dan lambat
berdifusi ke dalam agar (Hurst & Hoover, 1993). Menurut penelitian Riana
(2001) pengujian daya hambat metabolit sekunder bakteri di dalam Susu
Fermentasi Yakult® dan Kefir® (Yoghurt) terhadap E. coli dan S. aureus dengan metode difusi kurang efektif karena menurutnya metabolit sekunder bakteri
terebut sukar berdifusi ke dalam media agar.
c) Metode Paper Disc: Mula-mula 1 ml suspensi bakteri dicampur dengan 4 ml agar
dan dibiarkan membeku. Setelah itu letakkan disk dengan bahan uji di atasnya
kemudian inkubasi pada suhu 37°C selama 18-24 jam. Hasil dibaca seperti cara
Kirby Bouwer (Trihendrokesowo, 1986).
2. Metode dilusi
Metode ini merupakan metode di mana sejumlah obat sebagai antibakteri
dicampur dalam pembenihan mikrobia uji dalam bentuk cair/padat. Pada dilusi cair,
masing-masing konsentrasi obat ditambahkan suspensi mikrobia uji. Pada dilusi
padat, setiap konsentrasi obat dicampurkan ke dalam media agar, setelah menjadi
padat baru ditanami mikrobia uji dan setelah itu diinkubasi (Hugo & Russel,1987).
Obat dibuat dalam berbagai konsentrasi kemudian ditambahkan pada media
yang mengandung bakteri uji sehingga hasil yang diperoleh adalah kekeruhan.
Kekeruhan menunjukkan adanya daya hambat obat pada konsentrasi tersebut. Oleh
karena itu, pada metode ini Minimum Inhibitory Concentration (MIC) dari obat
tersebut dapat ditentukan. Ada tiga macam cara metode dilusi :
a) Macro Broth Dilution. Obat dibuat dalam berbagai konsentrasi pada 10 tabung
kemudian ditambahkan ke dalam media cair yang telah diinokulasi dengan
bakteri. Kemudian suspensi ini diinkubasi selama 15-16 jam pada suhu 35°C.
Hasilnya dilihat dengan membaca kekeruhan pada masing-masing konsentrasi
sehingga bisa menentukan MIC (Koneman et al, 1997).
b) Micro Broth Dilution. Cara kerja yang digunakan sama dengan metode Macro
Broth Dilution hanya tabung yang digunakan berbeda (Koneman et al, 1997).
c) Agar Dilusi. Menggunakan satu seri plate agar, masing-masing mengandung
terapeutik. Pembacaan hasil sama dengan metode Macro Broth Dilution
(Koneman et al, 1997).
3. Metode turbidimetri
Metode ini mengidentikkan pertumbuhan bakteri dengan kekeruhan yang
diukur dengan spektrofotometer. Turbidimetri merupakan metode yang sangat cocok
untuk mengevaluasi pengaruh senyawa antibakteri pada saat pertumbuhan.
Kelemahan metode ini adalah hanya populasi yang terkecil (106 CFU/ml) yang dapat
terdeteksi oleh spektrofotometer secara akurat. Oleh karena itu, metode turbidimetri
tidak dapat digunakan untuk mendeteksi jumlah bakteri dan perubahan jumlah
populasi bakteri yang rendah. Pengukuran jumlah bakteri yang kurang dari 106
CFU/ml dengan spektrofotometer tidak memberikan perubahan nilai Optical Density
(OD) (Davidson & Parish, 1989)
G. Keterangan Empiris
Susu fermentasi diketahui mengandung bakteri asam laktat (BAL) yang dapat
menekan pertumbuhan bakteri penyebab penyakit saluran pencernaan. Salah satu
produk susu fermentasi yang sudah beredar di Indonesia bahkan mancanegara adalah
Yakult®. Produk ini mengandung bakteri asam laktat. Bakteri asam laktat dapat
menghambat bakteri patogen dan bakteri pembusuk (flora normal yang berpotensi
patogen), seperti E.coli dan E.faecalis, yang mempunyai habitat di usus besar dan
urogenital manusia.
Untuk mengetahui potensi antibakteri dan daya hambat dari senyawa yang
maka perlu dilakukan pengujian potensi antibakteri senyawa tersebut dengan metode
difusi paper disc dan diukur diameter zona hambat yang terbentuk. Tetapi sebelum
itu, bakteri dalam susu fermentasi Yakult® diisolasi dan diidentifikasi terlebih
dahulu.
Data yang diperoleh dari identifikasi isolat bakteri dalam susu fermentasi
Yakult® berupa data morfologi koloni, morfologi sel dan sifat biokimia. Data uji
potensi dan identifikasi dianalisis secara deskriptif dan dilengkapi dengan gambar
mikrofotografi dan foto. Determinasi dilakukan dengan mencocokkan data hasil
identifikasi (morfologi koloni, morfologi sel, uji biokimia) dengan menggunakan
Isolasi bakteri dalam susu fermentasi Yakult® dengan metode streak plate
Isolat biakan murni bakteri dalam susu fermentasi Yakult®
Identifikasi Isolat bakteri dalam susu fermentasi Yakult®
Morfologi sel :
6. test hidrolisis gelatin 7. test pembentukan H2S 8. test Indol
9. test MR 10. test VP
Determinasi isolat bakteri berdasarkan buku panduan determinasi bakteri (Holt et al., 2000)
Genus isolat bakteri dalam susu fermentasi Yakult®
Isolasi senyawa yang dihasilkan bakteri dalam susu fermentasi Yakult®
Pengujian potensi antibakteri senyawa yang dihasilkan bakteri dalam susu fermentasi Yakult® terhadap
Escherichia coli dan Enterococcus faecalis dengan metode difusi paper disk
BAB III
METODOLOGI PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental murni dan bersifat
eksploratif deskriptif. Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas
Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 1. Variabel penelitian
a. Variabel bebas : Senyawa yang dihasilkan oleh bakteri dalam susu fermentasi
Yakult®.
b. Variabel tergantung : Diameter zona hambat yang terbentuk.
c. Variabel pengacau terkendali : Media penanaman dan identifikasi isolat bakteri
dalam susu fermentasi Yakult® yaitu MRS (de Man Rogosa Sharpe), media penanaman dan identifikasi Escherichia coli dan Enterococcus faecalis yaitu
Nutrien Agar dan Nutrien Broth, suhu inkubasi 37°C, waktu inkubasi 24 jam,
kepadatan suspensi bakteri uji setara dengan larutan standar Mac Farland II (6
x 108 CFU/ml), diameter paper disc 6 mm, volume suspensi bakteri uji (1 ml),
volume senyawa yang dihasilkan oleh bakteri dalam susu fermentasi Yakult® yang diujikan pada bakteri uji E. coli dan E. faecalis (10 ml).
2. Definisi operasional
a. Potensi antibakteri adalah kemampuan senyawa yang dihasilkan oleh bakteri
dalam susu fermentasi Yakult® dalam menghambat pertumbuhan atau membunuh bakteri uji E. coli dan E. faecalis dengan menunjukkan diameter
zona hambat yang lebih besar daripada diameter zona hambat kontrol negatif
b. Yakult® adalah suatu produk susu fermentasi yang mengandung bakteri asam laktat, sukrosa dan susu skim. Konsistensinya berbentuk cair dan dikemas di
dalam botol plastik bervolume 75 ml. Produk ini berasal dari Jepang dan telah
diproduksi dan dipasarkan di banyak negara termasuk Indonesia.
c. Escherichia coli ATCC 25922 diperoleh dari Balai Kesehatan Departemen
Kesehatan Yogyakarta.
d. Enterococcus faecalis ATCC 33816 diperoleh dari Balai Kesehatan
Departemen Kesehatan Yogyakarta.
e. Senyawa antibakteri adalah senyawa yang dihasilkan oleh bakteri asam laktat
yang dapat membunuh atau menghambat pertumbuhan bakteri uji E. coli dan
E. faecalis.
f. Zona hambat adalah zona jernih bakteri uji yaitu E. coli dan E. faecalis di
sekitar paper disc yang telah diinokulasi senyawa yang dihasilkan oleh bakteri
asam laktat.
g. Media MRS (de Man Rogosa Sharpe) (Oxoid) adalah media untuk memacu
pertumbuhan dan mengidentifikasi bakteri asam laktat yaitu bakteri yang
menghasilkan produk akhir berupa asam laktat dari hasil metabolisme
C. Bahan dan Alat 1. Bahan penelitian
a. Yakult® (produksi PT Yakult Indonesia Persada Sukabumi),
b. Media pertumbuhan dan identifikasi isolat bakteri dalam susu fermentasi
Yakult® adalah MRS (de Man Rogosa Sharpe) (Oxoid) dengan komposisi (g/l) : peptone 10; “lab-lemco” powder 8; yeast extract 4; glucose 20; sorbitan
monooleate (1 ml); dipotassium hydrogen phosphate 2; sodium acetate 3H2O
5; triammonium citrate 2; magnesium sulphate 7H2O 0,2; manganese sulphate
4H2O 0,05.
c. Biakan murni bakteri uji : Escherichia coli dari Laboratorium Mikrobiologi
Fakultas Farmasi USD dan Enterococcus faecalis ATCC 33816 dari Balai
Kesehatan Yogyakarta.
d. Media pertumbuhan dan identifikasi biakan murni bakteri uji adalah NA
(Nutrient Agar) (Oxoid) dengan takaran 28 g/L dengan komposisi (g/l) :
“lab-lemco” powder 1; yeast extract 2; peptone 10; sodium chloride 5; agar 15 dan
NB (Nutrient Broth) dengan takaran 37 g/L dengan komposisi (g/l) :
“lab-lemco” powder 1; yeast extract 2; peptone 10; sodium chloride 5.
e. Bahan untuk uji identifikasi morfologi sel :
1) Gerakan bakteri metode tusukan : media agar semi solid (0,2-0,4 % agar)
2) Pengecatan
a) Pengecatan gram : kristal violet (gram A), iodine (gram B), alcohol
b) Pengecatan acid fast : Ziehl Neelson carbolfuchsin, methylen blue,
alcohol 96 %,
c) Pengecatan spora : malachite green 5%, safranin
f. Bahan untuk uji identifikasi morfologi koloni:
1) Medium Cair : MRS (de Man Rogosa Sharpe) Broth (Oxoid)
2) Medium Agar : MRS (de Man Rogosa Sharpe) Agar (Oxoid)
g. Bahan untuk tes biokimia :
1) Uji oksidase : reagens tetramethyl-paraphenyldiamine
2) Uji katalase : reagens hidrogen peroksida
3) Uji fermentasi karbohidrat : medium O-F (Difco)
4) Uji sitrat : medium Simmon’s citrate (Difco)
5) Uji dekarboksilase lisin : medium LIA (Lysin Iron Agar) (Oxoid)
6) Uji hidrolisis gelatin : Nutrient Broth (Oxoid ) dan 12 % gelatin
7) Uji hidrogen sulfida : medium TSIA (Triple Sugar Iron Agar) (Oxoid)
8) Uji indol : medium triptone water dengan reagen Kovac
9) Uji MRVP : medium MR-VP (Methyl Red – Voges Proskauer) (Oxoid),
methyl red, larutan nafto 5 % dan KOH 40 %
h. Larutan standar Mc Farland II (6 x 108 CFU/ml)
i. Aquadest steril
j. Kontrol positif : Penicillin (paper disc)
k. Kontrol negatif : Nutrient Broth tanpa inokulasi bakteri
2. Alat penelitian
Autoklaf (ALP Co.Ltd), Microbiological Safety Cabinet, Centrifuge
(Heraust Christ), Filter bakteri 0,2 μm (Millipore), Jangka sorong, Mikropipet
(Nichiryo 5000 DG), Inkubator (WTB Binder, Memert), Oven (WTC Binder),
Mikroskop cahaya (Olympus Type CH 30), Shaker (Stuart Scientific), Jarum ose,
Jarum inokulasi, Alat-alat gelas (Pyrex).
D. Tata Cara Penelitian
1. Isolasi Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® dengan Metode Streak Plate Isolasi bakteridari susu fermentasi Yakult® dilakukan dengan metode streak
plate. Satu ose Yakult® digoreskan pada permukaan agar dalam cawan petri. Setelah itu cawan petri diinkubasi terbalik selama 2 hari pada suhu 37°C. Setelah inkubasi, akan terlihat koloni yang terpisah-pisah. Tiap koloni diharapkan berasal dari satu sel
bakteri dan terdiri dari satu spesies bakteri. Hasil isolasi akan digunakan untuk tahap
penelitian berikutnya.
2. Identifikasi dan Determinasi Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® Bakteri dari susu fermentasi Yakult® diidentifikasi dengan pengamatan
morfologi sel, morfologi koloni dan uji biokimia.
a. Pengamatan morfologi sel meliputi pergerakan bakteri dengan metode tusukan,
dan pengecatan bakteri yaitu pengecatan gram, pengecatan acid fast, pengecatan
spora, dan pengecatan dinding sel.
Biakan bakteri diinokulasikan pada media agar semi solid (0,2-0,4 %
agar) yang telah steril dengan menggunakan jarum inokulasi secara tusukan.
Kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 48 jam.
2) Pengecatan bakteri
a) Pengecatan gram
Membuat pulasan isolat bakteridari susu fermentasi Yakult® di atas
obyek gelas, lalu difiksasi dengan api. Pulasan tersebut ditetesi kristal
violet dan didiamkan selama 1 menit. Setelah itu dicuci dengan air
mengalir untuk membuang sisa cat. Larutan iodin diteteskan ke atas
pulasan tersebut dan didiamkan selama 1 menit. Kemudian dicuci
dengan air mengalir dan ditambahkan alkohol sebagai larutan peluntur.
Pulasan tersebut dicuci dengan air mengalir lagi dan diberi larutan
safranin. Langkah berikutnya pulasan yang telah diberi safranin tersebut
dicuci dengan air mengalir dan dibiarkan mengering. Setelah itu diamati
di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000X menggunakan minyak
emersi. Pada pengamatan sifat gram, apabila warna sel adalah violet,
menunjukkan bahwa bakteri tersebut termasuk bakteri gram positif.
Namun, sebaliknya bila warna merah yang terjadi, berarti bakteri
tersebut merupakan bakteri gram negatif.
b) Pengecatan acid fast
Membuat pulasan isolat bakteridari susu fermentasi Yakult® di atas
obyek gelas dan memfiksasinya di atas pembakar spiritus. Kemudian
ditambahkan di atasnya. Setelah itu, dipanaskan di atas api spiritus
dengan nyala kecil dan didiamkan selama 5 menit. Setelah 5 menit,
obyek gelas didinginkan, dicuci dengan air mengalir dan
diangin-anginkan. Dicuci dengan alkohol 96 % sambil digoyang-goyangkan
sampai seluruhnya tidak tampak. Sesudah itu, dicuci dengan air mengalir
dan diangin-anginkan. Methylen biru dibubuhkan di atas obyek gelas
dan didiamkan selama 20-30 detik. Dicuci, dikeringkan dan diamati di
bawah mikroskop dengan perbesaran kuat sampai 1000X menggunakan
minyak emersi. Bakteri yang bersifat acid fast tampak berwarna merah,
sedangkan yang non acid fast berwarna biru.
c) Pengecatan spora
Pulasan isolat bakteri dari susu fermentasi Yakult® dibuat di atas
obyek gelas dan difiksasi dengan api. Setelah itu, malachite green
diteteskan ke atas pulasan tersebut dan dipanaskan kembali selama 1
menit. Kemudian dicuci dengan air mengalir dan diberi cat safranin
selama 30-40 detik. Berikutnya dicuci dengan air mengalir kembali dan
diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000X. Sel vegetatif
berwarna merah dan spora berwarna hijau.
b. Pengamatan morfologi koloni.
1) Penanaman pada medium MRS agar tegak
Medium MRS agar tegak diinokulasi secara aseptik dengan biakan
bakteri menggunakan jarum inokulasi secara tusukan sampai ke dasar
itu, dilakukan pengamatan pertumbuhan pada bagian permukaan dan bagian
dasar, juga bentuk pertumbuhan pada bekas tusukan.
2) Penanaman pada medium MRS agar miring
Medium MRS agar miring diinokulasi secara aseptik dengan biakan
bakteri menggunakan jarum inokulasi secara goresan lurus. Lalu diinkubasi
selama 48 jam pada suhu 37°C. Yang diamati adalah pertumbuhannya, bentuk pertumbuhan pada bekas goresan, elevasi, topografi, warna
chromogenesis, bau, konsistensi dan warna medium.
3) Penanaman pada medium MRS cair
Medium MRS cair diinokulasi secara aseptik dengan biakan bakteri
menggunakan ose. Inkubasi dilakukan pada suhu 37°C selama 48 jam. Pengamatannya meliputi : pertumbuhan pada permukaan, kekeruhan, bau
dan endapan.
4) Penanaman pada medium MRS agar
Medium MRS agar pada cawan petri diinokulasi secara goresan
dengan biakan bakteri menggunakan jarum ose. Sesudah itu, diinkubasi
selama 48 jam pada temperatur 37°C selama 48 jam. Pertumbuhan, bentuk
koloni, permukaan, elevasi, bentuk tepi dan struktur dalamnya akan diamati
c. Uji biokimia
1) Uji katalase
Satu atau dua ose isolat bakteri dari susu fermentasi Yakult®
diinokulasikan ke dalam tabung reaksi yang berisi media Nutrien Broth
sebanyak 5 ml lalu H2O2 3% diteteskan ke dalamnya. Bila terbentuk
gelembung gas O2 berarti katalase positif, sedangkan sebaliknya bila tidak
ada gelembung atau buih berarti katalase negatif.
2) Uji oksidase
Larutan tetramethyl-paraphenyldiamine diteteskan pada kertas saring.
Satu ose dari kultur bakteri diletakkan pada kertas saring tersebut, kemudian
diamati hasilnya. Reaksi positif terjadi apabila timbul perubahan warna
menjadi ungu tua setelah didiamkan selama 10 menit. Hal ini berarti bakteri
tersebut memiliki enzim oksidase sitokrom. Sebaliknya bila tidak terjadi
perubahan warna, berarti sebagai reaksi negatif.
3) Uji oksidasi fermentasi (O-F)
Medium O-F yang mengandung glukosa diisikan ke dalam 4 tabung
reaksi. Dua di antaranya diinokulasi dengan kultur isolat bakteri umur 24
jam menggunakan jarum inokulasi secara tusukan. Sedangkan dua yang lain
berfungsi sebagai kontrol (tanpa inokulasi isolat bakteridari susu fermentasi
Yakult®) Salah satu dari 2 tabung yang sudah diinokulasi tersebut ditetesi
parafin, sedangkan yang lain tidak. Lalu keempat tabung itu diinkubasi pada
suhu 37°C selama 48 jam. Setelah 48 jam, hasilnya diamati dengan melihat
dan bila medium yang ditutupi parafin berubah warna menjadi kuning
berarti bakteri tersebut memetabolisme karbohidrat secara fermentatif,
sedangkan untuk yang tidak ditutupi parafin bila mediumnya berubah warna
menjadi kuning berarti bakteri dapat memetabolisme karbohidrat secara
oksidatif
4) Uji sitrat
Satu tabung medium Simmon’s citrate yang berbentuk agar miring
diinokulasi dengan satu ose kultur bakteri secara goresan. Untuk kontrol
disiapkan juga satu tabung medium Simmon’s citrate tanpa inokulasi
bakteri. Kemudian keduanya diinkubasi pada suhu 37°C selama 48 jam.
Hasil yang diperoleh bila terjadi perubahan warna dari hijau menjadi biru
menunjukkan bahwa bakteri menggunakan sitrat sebagai satu-satunya
sumber karbon.
5) Uji dekarboksilase lisin
Tabung berisi medium LIA (Lysin Iron Agar) diinokulasi dengan kultur
isolat bakteri secara tusukan dan juga dibuat kontrol (medium Lysin Iron
Agar tanpa inokulasi bakteri) dibuat juga sebagai pembanding. Setelah itu,
kedua tabung diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam dan 48 jam. Bila
terjadi perubahan warna dari ungu menjadi kuning pada umur 24 jam dan
setelah 48 jam berwarna ungu kembali, berarti reaksi tersebut positf.
Perubahan warna menjadi kuning menandakan bahwa bakteri melakukan
fermentasi dan berwarna ungu kembali berarti lisin mengalami
6) Uji hidrolisis gelatin
Kultur bakteri diinokulasikan secara tusukan pada media dengan
komposisi nutrient broth 13 g/L, gelatin 12 % dan agar 0,3 %. Kontrol yang
berisi medium tanpa inokulasi bakteri juga dibuat untuk pembanding. Lalu
diinkubasi selama 72 jam pada suhu 37°C. Pada saat pengamatan, tabung
dimasukkan ke dalam lemari es selama 30 menit. Terjadinya pencairan
gelatin dibandingkan dengan kontrol membuktikan bahwa bakteri mampu
menghasilkan eksoenzim gelatinase.
7) Uji pembentukan H2S
Kultur isolat bakteri dari susu fermentasi Yakult® diinokulasikan ke
dalam medium TSIA (Triple Sugar Iron Agar) miring secara goresan dan
tusukan. Untuk kontrol adalah medium TSIA tanpa inokulasi bakteri. Empat
puluh delapan jam dan 37°C sebagai waktu dan suhu inkubasi uji tersebut.
Terbentuknya endapan hitam pada bekas inokulasi menunjukkan bahwa
bakteri mampu menghasilkan senyawa desulfurase. Bila bagian slant
berwarna kuning dan butt berwarna merah, menunjukkan bahwa glukosa
difermentasikan, sedangkan bila seluruh medium (slant dan butt) berwarna
kuning, maka artinya laktosa atau sukrosa atau keduanya difermentasikan.
Kalau ada pembentukan gas pada bagian butt dan medium kadangkala
terpecah, berarti ada pembentukan gas H2 dan CO2. Sebaliknya, apabila
glukosa, laktosa dan sukrosa tidak difermentasikan, pada bagian slant dan
8) Uji pembentukan indol
Satu ose kultur bakteri diinokulasikan ke dalam satu tabung medium
tripton water dan kemudian diinkubasi selama 48 jam dan suhu 37°C. Satu
tabung medium pepton water yang lain digunakan untuk kontrol (tanpa
inokulasi bakteri). Inkubasi dilakukan selama 48 jam pada suhu 37°C.
Reagen Kovac ditambahkan ke dalamnya setelah inkubasi. Bila terbentuk
cincin merah yang tidak larut pada permukaan medium maka itu berarti
hasilnya positif. Reaksi ini menunjukkan bahwa bakteri mampu
menghasilkan enzim triptofanase yang bisa mengkatalisasi penguraian
gugus indol dari triptofan sehingga indol akan menumpuk dalam medium
biakan sebagai produk buangan.
9) Uji MR-VP (Methyl Red-Voges Proskauer)
Kultur isolat bakteri diinokulasi dengan jarum inokulasi pada dua
tabung yang berisi medium MR-VP. Dua tabung berisi medium yang sama
untuk kontrol. Lalu diinkubasi selama 48 jam dan pada temperatur 37°C.
Kemudian ditambah reagen methyl red pada dua tabung medium MR-VP
(yang satu kontrol), sedangkan dua tabung yang lain (satunya kontrol)
ditambah 40% KOH dan 5% larutan α-naphtol. Hasil yang terjadi bila ada
perubahan warna menjadi kuning pada uji MR, bakteri tersebut tidak dapat
memfermentasikan glukosa. Sebaliknya bila tetap berwarna merah, terjadi
fermentasi glukosa. Sedangkan bila ada perubahan warna menjadi merah
muda pada uji VR, menandakan bahwa bakteri mampu memfermentasikan
3.Isolasi Senyawa yang Dihasilkan oleh Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult®
Beberapa ose kultur isolat bakteri dalam susu fermentasi Yakult®
diinokulasi ke dalam medium MRS cair sebanyak 100 ml di dalam erlenmeyer. Lalu
diinkubasi selama 3-4 hari pada suhu 37°C dan dilakukan penggojogan berkecepatan 170 rpm di dalam shaker inkubator. Setelah itu disentrifugasi menggunakan
sentrifuge yang berkecepatan 5000 rpm selama 1 jam supaya ada pemisahan senyawa
penghambat dari biomassa sel yang mengendap. Supernatan disterilisasi dengan filter
bakteri steril diameter 0,2 μm sehingga diperoleh metabolit sekunder yang
dihasilkan Lactobacillus sp.
4. Pengujian Potensi Senyawa yang Dihasilkan oleh Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® terhadap Escherichia coli dan Enterococcus faecalis dengan Metode Difusi Menggunakan Paper Disc
a. Pembuatan suspensi bakteri uji
Bakteri uji diinokulasikan pada medium NB (Nutrient Broth) dan diinkubasi
selama 1-2 hari. Setelah itu, bakteri uji yang tumbuh di medium NB tersebut
disuspensikan ke dalam Nutrient Broth steril sampai kekeruhannya setara
dengan larutan standard Mac Farland II (6 x 108 CFU/ml).
b. Pembiakan bakteri uji secara pour plate.
Nutrien agar steril yang bersuhu 40-50°C masing-masing diinokulasi dengan 1
ml suspensi bakteri uji Escherichia coli dan Enterococcus faecalis umur 24
jam. Kemudian media yang berisi biakan tersebut dituang ke dalam cawan
c. Pengujian potensi antibakteri dengan metode difusi menggunakan paper disc.
Supernatan disiapkan sebanyak 10 ml (yang diperoleh pada tahap 3) di dalam
tabung reaksi steril. Kemudian paper disc diambil dengan pinset steril dan
dicelupkan selama 10 detik ke dalam supernatan tersebut. Paper disc tersebut
dikeringanginkan pada gelas arloji steril untuk menghilangkan ekses air
selama 1-2 jam. Paper disc ditempatkan di permukaan medium agar yang
telah mengandung bakteri uji Escherichia coli dan Enterococcus faecalis.
Setelah itu, diinkubasi selama 1-2 hari atau sampai terbentuknya zona jernih di
sekitar paper disc pada suhu 37ºC. Perlakuan ini dibuat agar senyawa
antibakteri mempunyai waktu untuk berdifusi ke dalam agar yang telah
diinokulasi bakteri uji Escherichia coli dan Enterococcus faecalis. Setelah itu diameter zona jernih yang terbentuk di sekitar paper disc diukur dengan
penggaris.
E. Analisis Hasil
Data uji potensi antibakteri oleh senyawa yang dihasilkan oleh bakteri
diperoleh dengan mengukur diameter zona hambat yang terbentuk di sekitar paper
disc dengan menggunakan penggaris. Selain itu juga mengidentifikasi bakteri dalam
susu fermentasi Yakult® dengan pengamatan morfologi sel, morfologi koloni, dan uji
sifat biokimia. Data identifikasi dicocokkan dengan panduan determinasi bakteri
(Holt et al, 2000). Hasil pengamatan uji potensi dan identifikasi bakteri dalam susu
BAB IV
HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
A. Isolasi Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult® dengan Metode Streak Plate
Isolasi bakteri berguna untuk memisahkan bakteri dari lingkungannya dan
untuk dapat mempelajari sifat biakan, morfologi dan sifat faalinya. Teknik isolasi
bakteri yaitu teknik penggoresan agar (streak plate), teknik agar tuang (pour plate)
dan teknik agar sebar (spread plate) (Lay, 1994). Metode yang digunakan dalam
penelitian ini adalah metode streak plate yang merupakan teknik penggoresan agar.
Dasar metode streak plate adalah menggoreskan suspensi bahan yang mengandung
bakteri pada permukaan medium agar yang sesuai dalam petridish. Setelah inkubasi
maka pada bekas goresan akan tumbuh koloni-koloni yang terpisah yang mungkin
berasal dari satu sel bakteri sehingga dapat diisolasi lebih lanjut (Jutono dkk, 1980).
Satu ose Yakult® digoreskan pada permukaan agar dalam cawan petri. Setelah itu cawan petri diinkubasi terbalik selama 48 jam pada suhu 37°C. Setelah inkubasi akan terlihat koloni yang terpisah-pisah yang merupakan biakan murni. Biakan murni
adalah bakteri yang terdiri dari satu spesies dan berasal dari perbanyakan satu sel
bakteri (Jutono dkk, 1980). Hasil isolasi akan digunakan untuk tahap penelitian
berikutnya.
Media yang digunakan untuk isolasi bakteri asam laktat dalam susu
fermentasi Yakult® adalah media MRS (de Man Rogosa Sharpe) karena media ini digunakan untuk pertumbuhan dan identifikasi bakteri asam laktat yang diduga
terdapat dalam susu fermentasi Yakult®. MRS (Oxoid) mempunyai komposisi (g/l)
sebagai berikut : peptone 10; “lab-lemco” powder 8; yeast extract 4; glucose 20;
sorbitan monooleate (1 ml); dipotassium hydrogen phosphate 2; sodium acetate
3H2O 5; triammonium citrate 2; magnesium sulphate 7H2O 0,2; manganese sulphate
4H2O 0,05 (lampiran 1). Dari komposisinya, media MRS merupakan media yang
diperkaya. Menurut Jutono dkk (1980), media yang diperkaya adalah media yang
ditambah zat-zat tertentu sehingga dapat digunakan untuk menumbuhkan mikroba
heterotrof (memperoleh makanan dan energi dari sumber organik) tertentu. Media
merupakan nutrien yang dapat mempengaruhi pertumbuhan mikroba. Pada susu
fermentasi Yakult®, media yang digunakan adalah susu dengan komposisi sbb: air
(sekitar 87 %), casein /protein (2,5 %), laktosa /karbohidrat (5 %), lemak (4 %),
sisanya lactalbumin dan garam elektrolit (Alcamo, 1997). Pada penelitian ini
menggunakan media MRS karena media ini mempunyai komponen yang menyerupai
komponen susu seperti protein (pepton), karbohidrat (glukosa) dan lemak (lab-lemco
powder). Oleh karena itu bakteri dalam susu fermentasi Yakult® dapat tumbuh,
diisolasi dan menghasilkan senyawa sebagai hasil fermentasi dengan menggunakan
media MRS.
Pada permukaan media MRS Agar, digoreskan satu ose Yakult® kemudian diinkubasi terbalik selama 48 jam pada suhu 37°C. Waktu inkubasi 48 jam dipilih karena waktu tersebut cukup bagi bakteri untuk tumbuh dan membentuk koloni.
Suhu 37°C ditetapkan karena bakteri tersebut berhabitat dalam tubuh manusia (di dalam usus) maka bakteri itu termasuk bakteri mesofil yang mempunyai suhu
meningkatkan pertumbuhan mikroba secara maksimal sehingga dengan cepat akan
terbentuk koloni pada permukaan agar di cawan petri.
Setelah diinkubasi 48 jam, tumbuh koloni-koloni mikroba yang terbentuk
sepanjang goresan pada permukaan agar (Lampiran 2). Koloni hasil streak plate
berbentuk circular (bulat), permukaannya licin, elevasinya convex (cembung),
bentuk tepinya entire (rata), warnanya putih. Isolat bakteri ini akan digunakan untuk
identifikasi dan determinasi serta pengujian potensi antibakterinya terhadap
Escherichia coli dan Enterococcus faecalis.
B. Identifikasi dan Determinasi Isolat Bakteri dari Susu Fermentasi Yakult® Identifikasi mikroba digunakan untuk mengidentifikasi suatu organisme
(genus) di alam dengan menggunakan semua sifat yang berkaitan dengan genus yaitu
(1) ukuran, bentuk dan susunan organisme; (2) reaksi pewarnaan gram; (3) tipe
flagela; (4) ukuran keseluruhan dan penampilan koloni bakteri; serta (5) informasi
biokimia. Determinasi mikroba bertujuan untuk menetapkan genus suatu mikroba
yang sudah diidentifikasi dengan menggunakan buku acuan sistem klasifikasi dalam
Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology yang merupakan kunci bagi
identifikasi dan determinasi mikroba (Volk & Wheeler, 1988).
1. Morfologi Sel Isolat Bakteri dalam Susu Fermentasi Yakult®
Morfologi sel dilakukan dengan cara pengecatan dan pengamatan
motilitas untuk melihat struktur sel mikroba. Ada tiga pengecatan yang dilakukan
