http://jurnal.fkip.uns.ac.id/index.php/jkpk
ISSN 2503-4154 (online)
157
ISOLASI, IDENTIFIKASI DAN UJI SITOTOKSIK SENYAWA
ALKALOID DARI DAUN JOHAR (Senna siamea)
Ismi Simpang Anggia 1,* ,Dewi Kusrini 1, Enny Fachriyah 1
1,2Jurusan Kimia, Fakultas Sains dan Matematika, Universitas Diponegoro, Semarang,
Indonesia
*
*Keperluan korespondensi, telp: 089651957539, email:
ismisimpanganggia@gmail.com
Received: 28 June 2016 Accepted: December 1, 2016 Online Published: December 30, 2016ABSTRAK
Telah dilakukan penelitian tentang isolasi alkaloid dari daun Johar (Senna siamea) menggunakan metode ekstraksi dengan pelarut etanol 96%. Ekstrak etanol dan serbuk daun Johar diuji penapisan fitokimia. Ekstrak alkaloid dihasilkan dengan cara penggaraman melalui penambahan HCl 2M sampai pH 3 dan diekstraksi dengan etil asetat, lapisan asam yang
didapatkan ditambah NH4OH hingga pH 9-10 dan diekstraksi dengan etil asetat. Pemisahan
alkaloid dengan metode kromatografi lapis tipis preparatif menggunakan fasa diam silika gel
GF254 dan fasa gerak etil asetat:kloroform (8:2) dan uji kemurniannya menggunakan metode
KLT dengan berbagai eluen dan KLT dua dimensi. Isolat alkaloid diuji aktivitas sitotoksisitas dengan metode BSLT (Brine Shrimp Lethality Test), penentuan struktur molekul isolat alkaloid dengan metode spektrometri UV-Vis, FT-IR dan LC-MS. Hasil penapisan fitokimia sampel mengandung senyawa flavonoid, tanin, kuinon, saponin, dan alkaloid. Ekstrak alkaloid diperoleh seberat 1,06 gram (0,645%). Identifikasi isolat alkaloid menggunakan spektrometri UV-Vis menunjukan alkaloid termasuk golongan isokuinolin dengan panjang gelombang 230 nm, 255 nm, dan 335 nm, analisis menggunakan spektrometri FTIR menunjukan isolat alkaloid memiliki
gugus fungsi OH, CH3, C=C, C-N, C=O, C-O eter. Hasil LC-MS diperoleh berat molekul sampel
sebesar 214,25 g/mol. Berdasarkan hasil analisis diduga senyawa yang didapatkan adalah
senyawa cassiarin A. Hasil uji sitotoksisitas ekstrak alkaloid menunjukkan LC50 sebesar 18,383
ppm dapat disimpulkan ekstrak alkaloid bersifat sangat sitotoksik.
Kata Kunci: Senna siamea, Alkaloid, Brine Shrimp Lethality Test
ABSTRACT
Alcaloid from the leaf Johar (Senna siamea) was isolated by extraction method using solvent of 96% ethanol. The ethanol extract and powder of Johar leaf were tested by phytochemical screening. Alcaloid extract was produced by salting method. Methanol-water fraction were added by 2N HCl to pH 3 and extracted with ethyl acetate, acid layer obtained plus NH4OH to pH 9-10 and extracted with ethyl acetate. Alcaloid separation was carried out by preparative thin layer chromatography using silica gel GF254 as stationary phase and ethyl acetate: chloroform (8: 2) as a mobile phase. The purity test was performed by TLC using various of eluent and two-dimensional TLC. Cytotoxicity activity of alcaloid isolates were tested by the BSLT (Brine Shrimp Lethality Test) method and its molecular structure were determined using UV-Vis spectrometry, FT-IR and LC-MS methods. The results of phytochemical screening showed that samples contain flavonoids, tannins, quinones, saponins and alcaloids. Alcaloid extract obtained is 1.06 grams (0.645%). Molecular structure identification of alcaloid isolates showed that alcaloid belonged to isokuinolin with wavelengths of 230 nm, 255 nm, and 335 nm.
of 214.25 g / mol. Based on the results analysis described above, it reveals that the compound
obtained is cassiarin A. Cytotoxicity assay results of alcaloid extract showed LC50 of 18.383
ppm, it can be concluded that the alcaloid extract has highly cytotoxic.
Key word: Senna siamea, Alcaloid, Brine Shrimp Lethality Test
PENDAHULUAN
Tanaman Johar (Senna siamea) telah digunakan secara tradisional sebagai obat penyakit demam, penyakit kuning, sakit perut, nyeri haid, dan juga digunakan untuk mengurangi tingkat gula dalam darah [1]. Ekstrak daun Johar memiliki sifat sebagai antimalaria, antioksidan [2], anti-bakterial [3] antidiabetes [4]. Salah satu penelitian melaporkan dalam ekstrak meta-nol, etameta-nol, dan etil asetat dari daun Johar terkandung senyawa metabolit sekunder alkaloid, flavonoid, saponin, tannin dan fenol, antrakuinon, antosianin, dan gliko-sida jantung [5].
Penelitian sebelumnya yang
dilakukan oleh [2] telah menguji aktivitas antikanker dari daun Johar. Daun Johar pada penelitian tersebut diekstrak dengan mengunakan berbagai pelarut dan berhasil mengidentifikasi aktivitas antikanker dan senyawa yang berperan adalah antra-kuinon dan biantraantra-kuinon. Alkaloid berhasil diidentifikasi pada daun Johar yang diambil dari Taman Botani Purwodadi, Indonesia [6].Daun Johar pada penelitian tersebut diekstrak dengan metanol dan dan di-garamkan sehingga diperoleh alkaloid hasil analisis adalah cassiarin A dan cassiarin B.
Berdasarkan informasi di atas, penelitian mengenai penentuan alkaloid pada daun Johar dengan penapisan fito-kimia dan uji aktivitasnya telah banyak
dilakukan, namun penelitian untuk meng-identifikasi struktur alkaloid pada daun Johar masih jarang dilakukan. Penelitian ini akan dilakukan isolasi dan identifikasi senyawa golongan alkaloid pada daun Johar. Hasil penelitian ini nantinya diha-rapkan dapat memberikan informasi me-ngenai jenis senyawa alkaloid yang terkan-dung dalam daun Johar (Senna siamea)
dan uji sitotoksiknya.
METODE PENELITIAN
Alat dan bahan: Alat yang
digunakan dalam penelitian ini terdiri dari
rotary evaporator, blender, neraca analitik,
kertas saring, aluminium foil, erlenmeyer, pipet tetes, gelas beker, corong gelas, corong pisah, botol vial, pipa kapiler, tabung reaksi, pengaduk kaca, penangas air, cawan penguap, wadah pengembang,
lampu UV, spektrofotometer UV–Visibel,
FTIR, dan LC-MS.
Bahan: yang diperlukan dalam
penelitian ini yaitu daun Johar (Senna
siamea) diperoleh dari daerah Purworejo,
Jawa Tengah, aquades, etanol 96% teknis, n-heksana teknis, kloroform teknis, etil
asetat teknis, plat KLT silika gel GF254
(Merck), plat KLT Preparatif silika gel GF254
20x20 cm, tebal 2,0 mm (Merck), n-heksana p.a. (Merck), etil asetat p.a. (Merck), asam asetat p.a. (Merck), kloroform p.a. (Merck), metanol p.a. (Merck), asam klorida (Merck),
natrium hidroksida (Merck), pereaksi
Cara Kerja: Ekstraksi senyawa alkaloid: Serbuk daun Johar sebanyak 1kg
dimaserasi dengan pelarut etanol 96% selama 10 x 24 jam. Ekstrak etanol diuap-kan pada kondisi vakum sampai ekstrak pekat. Ekstrak pekat etanol dilarutkan dalam methanol dan ditambahkan aquades de-ngan rasio 1:1 dan didiamkan selama se-malam untuk memisahkan antara klorofil dengan filtrat. Simpilisa dan ekstrak yang didapatkan dilakukan analisis penapisan fitokimia yang meliputi tanin, alkaloid, fla-vonoid, kuinon, saponin, dan steroid/ tri-terpenoid.
Isolasi Alkaloid: Fraksi yang
berupa metanol–air dilakukan partisi
menggunakan n-heksan dan kloroform. Fraksi metanol-air yang didapatkan dila-kukan penggaraman menggunakan HCl 2 M hingga pH 3 lalu ekstraksi dengan pelarut etil asetat sehingga didapatkan lapisan asam, selanjutnya dilakukan penambahan
NH4OH hingga pH 9 kemudian diekstraksi
menggunakan pelarut etil asetat dan diuap-kan sehingga didapatdiuap-kan ekstrak alkaloid. Ekstrak alkaloid dilakukan pemisahan me-nggunakan KLT dengan fase diam berupa
silika gel GF254 dan eluen berupa etil asetat
:kloroform dengan rasio 8:2. Noda yang ter-bentuk dilakukan uji alkaloid dengan pe-reaksi Dragendorf. Noda positif alkaloid dilakukan pemisahan menggunakan KLT Preparatif 20x20 cm dengan fase diam
berupa silika gel GF254 dan eluen berupa etil
asetat :kloroform dengan rasio 8:2.
Uji Kemurnian: Isolat alkaloid
dilakukan uji kemurnian dengan eluen etil asetat : kloroform (9:2), etil asetat: etanol (8:2), dan KLT dua dimensi dengan eluen (1) etil asetat : kloroform (9:1), (2) etil
asetat:etanol (9:1) sehingga diperoleh isolat murni.
Karakterisasi Isolat Alkaloid:
Untuk mengetahui struktur dari senyawa alkaloid murni yang didapatkan, maka isolat alkaloid dianalisis menggunakan spektro-fotometer UV-Vis, FT-IR dan LC-MS.
Uji Aktivitas : Telur Artemia salina
direndam di dalam air garam selama 2 x 24
jam. Suhu penetasan adalah ± 25-300C dan
pH ± 6-7. Telur akan menetas setelah 18–
24 jam dan larvanya disebut nauplii yang siap untuk uji BSLT setelah berumur 2 hari. Sampel dari ekstrak alkaloid diambil 125 mg, dibuat pengenceran dengan konsen-trasi 10, 100, 1000 µg/ml. Pengujian dila-kukan dengan memasukkan 10 ekor larva
Artemia salina ke dalam tabung reaksi yang
telah berisi larutan ekstrak yang telah di-encerkan dengan air garam. Setelah 24 jam, jumlah larva yang mati dihitung dan di-lakukan analisis probit untuk menentukan
aktifitas LC50 [7].
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penapisan fitokimia berfungsi untuk mengetahui keberadaan golongan senyawa metabolit sekunder yang terkandung di dalam simplisia serbuk maupun di dalam ekstrak etanol. Penapisan fitokimia yang dilakukan secara kualitatif dengan meng-identifikasi keberadaan suatu senyawa tanpa menentukan kadarnya. Prinsip pena-pisan fitokimia ialah analisis golongan kimia tumbuhan dengan uji spesifik dengan reagen yang memberikan uji spesifik ter-hadap golongan kimia tertentu. Golongan yang diidentifikasi pada penelitian ini antara lain alkaloid, flavonoid, tanin, saponin, kui-non, steroid dan triterpenoid.
Hasil penapisan fitokimia dapat dili-hat pada tabel 1 yang menunjukkan bahwa penapisan fitokimia pada serbuk dan eks-trak etanol daun Johar mengandung se-nyawa golongan alkaloid, flavonoid, sapo-nin, tasapo-nin, kuinon dan steroid. Hasil pene-litian ini sesuai dengan penepene-litian yang per-nah dilaporkan dalam jurnal sebelumnya [5].
Tabel 1. Hasil uji fitokimia daun Johar
Uji Fitokimia Serbuk Ekstrak
Alkaloid + + Saponin + + Flavanoid + + Tanin + + Kuinon + + Steroid + +
Isolasi senyawa alkaloid dilakukan dengan menambahkan HCl 2M pada ekstrak methanol-air sampai suasana men-jadi asam, sehingga alkaloid akan mem-bentuk garam alkaloid. Garam alkaloid ini kemudian diekstraksi menggunakan etil asetat, sehingga didapatkan dua lapisan. Lapisan atas adalah etil asetat yang me-ngikat senyawa selain alkaloid dan lapisan bawah adalah lapisan asam dan alkaloid terikat pada lapisan ini. Untuk mem-bebaskan alkaloid dari bentuk garamnya, maka ditambahkan ammonium hidroksida sampai suasana menjadi basa, sehingga alkaloid akan terbentuk menjadi basa al-kaloid kembali. Larutan ini kemudian dieks-traksi menggunakan etil asetat sehingga akan terbentuk dua lapisan, lapisan etil asetat yang mengandung alkaloid dan lapi-san basa yang mengandung air, pelarut etil asetat kemudian diuapkan sehingga dipe-roleh ekstrak alkaloid. Untuk mengetahui ekstrak alkaloid yang didapatkan positif
al-kaloid atau tidak maka ditambahkan
pereaksi Dragendorff, terbentuknya enda-pan merah bata berarti positif adanya alkaloid.
Ekstrak alkaloid selanjutnya dianali-sis menggunakan kromatografi lapis tipis
dengan fasa diam silika gel 60 GF254 dan
eluen campuran eluen etil asetat:kloroform (8:2) untuk mengetahui jumlah komponen-nya. Hasil KLT ada 4 noda yang terbentuk
berwarna biru dengan nilai Rf1 (0,08), Rf2
(0,26), Rf3 (0,43), Rf4 (0,65), dan Rf5 (0,75).
Hasil KLT, warna noda dan nilai Rf, dapat dilihat pada gambar 1a. Hasil KLT setelah
disemprot pereaksi Dragendorf
meng-hasilkan satu noda pada Rf (0,42) yang berwarna jingga, berarti hanya satu noda yang positif alkaloid. Hasil KLT setelah disemprot pereaksi Dragendorf dapat dilihat pada gambar 1b.
A B Gambar 1. (A) Hasil KLT ekstrak alkaloid
dengan eluen etil asetat : kloroform (8:2) pada panjang gelombang 365 nm dan (B) KLT setelah disemprot perekasi Dragendorf
Pemisahan senyawa-senyawa alka-loid dengan KLT preparatif menggunakan eluen etil asetat:kloroform (8:2), sehinga menghasilkan pita-pita dan yang positif alkaloid dikerok lalu dilarutkan dalam pelarut etil asetat, kemudian dipisahkan dan dipe-roleh isolat alkaloid.
Gambar 2. Hasil KLT preparative ekstrak
alkaloid dengan eluen etil
asetat:kloroform (8:2) pada lampu UV λ 365 nm
Selanjutnya isolat alkaloid dilakukan uji kemurnian dengan metode KLT me-nggunakan berbagai campuran eluen dan KLT dua dimensi. Hasil KLT menunjukkan satu noda, diduga isolat alkaloid telah mur-ni. Hasil KLT uji kemurnian dapat dilihat pada gambar 3.
A B C
Gambar 3. Hasil uji kemurnian dengan eluen (A) etil asetat : kloroform (9:2), (B) etil asetat: etanol (8:2), dan (C) KLT dua dimensi dengan eluen (1) etil asetat : kloroform (9:1), (2) etil asetat:etanol (9:1) pada lampu UV λ365 nm
Isolat alkaloid murni kemudian analisis dengan spektrofotometer UV-Vis di-dapatkan serapan pada panjang gelombang 230 nm, 255 nm, 335 nm merupakan se-rapan dari ikatan rangkap aromatik yang
ter-konjugasi dan diduga serapan alkaloid yang mempunyai kerangka dasar isokuinolin, menurut jurnal alkaloid yang mengandung kerangka dasar isokuinolin mempunyai pan-jang gelombang pada daerah 230 nm, 266 nm, 351 nm [8]. Hasil analisis dengan spek-trofotometer UV-Vis dapat dilihat pada
gambar 4.
Gambar 4. Spektra UV Vis isolat alkaloid daun Johar
Kerangka dasar alkaloid isokuinolin adalah sebagai berikut:
N
Gambar 5. Spektra FTIR isolat alkaloid
daun Johar
Hasil analisis FTIR pada gambar 5 menunjukkan serapan pada panjang
gelom-bang 3658 cm-1 (vibrasi ulur gugus OH),
2926,6 dan 2857,5 cm-1 (Vibrasi ulur CH
alifatik), 1739,82 cm-1 (vibrasi ulur C=O),
1655,36 cm-1 (Vibrasi ulur C=C aromatic),
tekuk CH alifatik), 1266,28 cm-1 (vibrasi ulur
C-N), 1166,92 cm-1 (gugus C-O eter).
Gambar 6. Kromatogram isolat alkaloid daun Johar
Hasil kromatogram dari LC-MS senyawa alkaloid pada gambar 6 menun-jukkan bahwa isolat alkaloid murni memiliki satu puncak dengan waktu retensi 0,96 menit, sehingga dapat disimpulkan bahwa isolat alkaloid murni.
Gambar 7. Spektrogram massa isolat alkaloid daun Johar
Spektrogram pada gambar 7 mun-cul puncak dengan protonasi ion molekular
[M+Na]+ 237,27 dari (m/z) [M+23], [M+H]+
215,25 dari (m/z) [M+1] sehingga dapat disimpulkan bahwa berat molekul isolat yaitu 214,25 g/mol.
Dari analisis dengan spektrofoto-meter UV-Vis, FT-IR dan LC-MS diduga se-nyawa alkaloid merupakan sese-nyawa cassi-arin A. Struktur senyawa cassicassi-arin A adalah sebagai berikut: HO N O CH3 CH3
Gambar 8. Struktur senyawa cassiarin
Hasil uji aktifitas sitotoksik ekstrak alkaloid daun Johar menggunakan metode
BSLT diperoleh harga LC50 18,383 ppm. Ini
berarti bahwa ekstrak alkaloid bersifat sangat sitotoksik. Hasil uji sitotoksik ekstrak alkaloid daun Johar dapat dilihat pada table 2.
Tabel 2. Uji Sitotoksik Ekstrak Alkaloid Daun Johar
KESIMPULAN
1. Berdasarkan hasil analisis diduga
didapatkan senyawa alkaloid adalah casiarin A.
2. Uji aktivitas sitotoksik ekstrak alkaloid daun Johar diketahui bahwa bersifat
sangat sitotoksik dengan LC50 sebesar
18,383 ppm.
1. Dr. Dwi Hudiyanti, M.Sc selaku Ketua Jurusan Kimia Fakultas Sains dan Matematika Universitas Diponegoro.
2.
Seluruh Dosen Laboratorium organikyang telah memberikan kritik dan saran dalam penyusunan Publikasi ini.
3. Seluruh staff laboratorium Jurusan Kimia Fakultas Sains dan Matematika Universitas Diponegoro yang telah membantu penulis.
4. Bapak, ibu dan adik yang selalu memberikan motivasi dan semangat
DAFTAR RUJUKAN
[1] Majji, L. N., Battu, G. R., Jangiti, R.
K., Talluri, M. R., 2013, Evaluation of in-vitro antibacterial activity of
Cassia siamea, International
Journal of Pharmacy and
Pharmaceutical Science, India
[2] Kamagaté, M., Koffi Camille.,
Kouamé, N. M., Akoubet, A., Yao, N. A. R., Die-Kakou, H. M., 2014,
Ethnobotany, phytochemistry,
pharmacology and toxicology
profiles of Cassia siamea Lam, The
Journal of Phytopharmacology,
3(1): 57-76, Côte d'Ivoir
[3] Povendran, P., Ramanathan, N.,
Prabhu, N., 2014, Evaluation of the
Antibacterial activity of Aegle
marmelos and Cassia siamea
Extracts Against Biofilm and
Extended Spectrum β-Lactamase
Producing Uropathogenic
Escerichia coli, International Journal
of Microbiological Reserach 5(3):
217-221, India
[4] Kumar, S., Kumar, V., Prakash, O.,
2010, Antidiabetic and anti-lipemic effects of Cassia siamea leaves extract in streptozotocic induced diabetic rats, Asian Pacific Journal
of Tropical Medicine: 871-873, India
[5] Veerachari, U., Bopaiah, DR. A. K.,
2012, Phytochemical Investigation of the Ethanol. Methanol, and Ethyl Acetate Leaf Extracts of Six Cassia Species, International Journal of
Pharma and Bio Sciences,
Bangalore
[6] Moshi, M.J., Innocent, E.,
Magadula, J.J., Otieno, D.F., dan Weisheit, A., 2010, Brine shrimp
toxicity of some plants used as traditional medicines in Kagera Region, North Weste
[7] Meyer, B.N., Ferigni, N.R., Putnam,
J.E., Ja Cobsen, L.B., Nichols, D.E.,
Melaughlin, J.L., 1982, Brine
Shrimp, A Convonient General
Bioassay for Activee Plant
Constituent, Planta
MedikaTanzania, Tanzania journal
of Health Research, 12 (1): 1-6
[8] Cordell, A., 1981, Introduction to
Alkaloids a Biogenetic Approach,
