Semirata 2013 FMIPA Unila |251
Aplikasi Metoda Loop Mediated Isothermal Amplification
(LAMP) Terhadap Gen MPB64 (Rv3036c) Sebagai Diagnosis
Cepat Infeksi M. tuberculosis
Elizabeth Bahar
*,Rahmatini **
Bagian Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Unand* Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran Unand**
Abstrak. Metoda Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) menggunakan taq polymerase yang mempunyai aktivitas strand displacement, misalnya Bst, Pfu, dan Aac polymerase. Metoda ini mampu mengamplifikasi DNA dan RNA secara sederhana, cepat , spesifik dan murah. Reaksi dilakukan dengan temparatur yang konstan (60 - 65°C) dengan lama antara 15 – 60 menit. Produk ampflifikasi mencapai 109-1010 kali. Sejumlah penelitian memperlihatkan metoda ini mempunyai sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi. Penelitian ini bertujuan untuk mengkaji nilai diagnostik LAMP terhadap gen MPB64 M. tuberculosis. Gen MPB64 merupakan gen yang conserved dan spesifik untuk M. tuberculosis complex. Potensi diagnostik LAMP MPB64 dibandingkan dengan metode diagnostik lain seperti PCR dan pewarnaan Basil tahan Asam (BTA).Standar baku emas digunakan kultur pada media Lowenstein Jensen (LJ). Penelitian dilakukan terhadap 117 sampel sputum. Preparasi sputum dilakukan dengan N-Asetil sistein – NAOH – sitrat. Selanjutnya sputum dikultur pada media LowensteinJensen selama 4 – 8 minggu. Isolasi DNA dilakukan 2 kali, yaitu dari sputum (menggunakan QIAamp DNA isolation kit, Qiagen) dan dari kultur (metoda Boiling). Desain primer LAMP terhadap gen MPB 64 dilakukan dengan Primer explorer. Hasil LAMP yang di dapatkan analisis kesesuaian antara PCR dengan LAMP memperlihatkan tingkat yang erat (p = 0.000 dan r = 0.747), sebaliknya tingkat kesesuaian antara LAMP dengan BTA atau PCR dengan BTA berada pada posisi kurang erat (masing-masing r = 0.249 dan r = 0.396).Dari hasil kultur pada LAMP menyebabkan spesifisitas metoda ini menjadi rendah, yaitu 60.0%.
Kata kunci: Tuberculosis, LAMP, MPB64, Diagnosis
LATAR BELAKANG
Tuberkulosis (TB) masih merupakan masalah kesehatan global. Infeksi
Mycobacterium. tuberculosis (M tuberculosis) merupakan penyebab kematian akibat infeksi yang tertinggi dan berperan dalam 8 juta kasus baru dan 2 juta kematian setiap tahunnya. Perkembangan HIV/AIDS dan adanya resisten multi obat
M tuberculosis berperan dalam peningkatan kasus TB di dunia. Diagnosis dini merupakan tahapan yang paling penting
dalam pencegahan penyakit dan
pengembangan metoda diagnosis baru yang lebih baik menjadi suatu hal yang sangat penting.
Dalam segala kelemahannya,
pemeriksaan mikroskopis dengan
pewarnaan Basil tahan Asam (BTA) tetap menjadi pilar utama dalam strategi pengendalian TB. Sensitivitas yang rendah, antara 40 – 60 % dan peningkatan kasus TB di dunia, metoda diagnostik baru yang lebih akurat, ekonomis dan sederhana sangat dibutuhkan. Kultur bakteri M tuberculosis
dalam media spesifik merupakan diagnosis pasti, namun membutuhkan waktu yang lama, sekitar 4 – 8 minggu (van Deun and Portaels, 1998; Shen et al., 2009).
Diagnosis TB berbasis reaksi
(PPD) M. bovis (Fogan et al., 1969). Sensitivitas dan spesivitas metoda ini sangat dipengaruhi oleh adanya riwayat imunisasi BCG (Daniel et al., 1991). Untuk mengantisipasi reaksi silang antigen PPD maka dikembangkan antigen yang spesifik dengan M. tuberculosis, seperti esat-6 dan cfp-10 (Wang et al., 2007)
Pendekatan molekuler, seperti
penggunaan PCR memperlihatkan hasil yang akurat, tetapi metoda ini memerlukan biaya yang besar serta sumber daya yang terlatih (Delavisio et al., 1996). Notomi dkk (2000) mengembangkan metoda Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) yang menggunakan taq polymerase yang mempunyai aktivitas strand displacement, misalnya Bst, Pfu, dan Aac polymerase. Metoda ini mampu mengamplifikasi DNA dan RNA secara sederhana, cepat , spesifik dan murah. Reaksi dilakukan dengan temparatur yang konstan (60 - 65°C) dengan lama antara 15 – 60 menit dengan produk ampflifikasi mencapai 109-1010 kali. LAMP. Identifikasi amplikon dapat dilakukan dengan reaksi turbiditas, perubahan warna setelah penambahan hydroxynaphthol blue (HNB) atau bahan flouresens, seperti SBYR green (Notomi et al., 2000; Vincent et al., 2004).
Berdasarkan kondisi tersebut peneliti telah menganalisis potensi diagnostik LAMP dengan tujuan untuk mengetahui potensi diagnostik LAMP sebagai metoda diagnosis cepat infeksi M. tuberculosis dan
membandingkan dengan metoda
pemeriksaan lain, seperti PCR terhadap gen MPB64.. Pemilihan gen MPB64 atau Rv3036c didasarkan analisis molekuler yang memperlihatkan MPB64 merupakan gen yang sangat conserved dan spesifik untuk M. tuberculosis complex dan M. bovis.
METODOLOGI PENELITIAN
Penelitian ini merupakan uji diagnostik dengan pendekatan cross sectional study.
Penelitian dilakukan selama 6 (enam) bulan di laboratorium Biomedik FK. Unand dan Mikrobiologi FK UGM. Populasi penelitian adalah penderita yang dicurigai dengan infeksi M. tuberculosis
berdasarkan keluhan klinis..Sampel penelitian merupakan populasi teliti yang memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi. Kriteria inklusi meliputi data klinis lengkap dan mengarah pada infeksi M. tuberculosis, kualitas sputum baik dengan jumlah yang mencukupi. Kriteria eksklusi adalah penderita yang telah didiagnosis dengan infeksi saluran nafas non tuberculosis berdasarkan hasil kultur dan radiologis. Besar sampel ditetapkan 155 berdasarkan perhitungan dengan rumus. Sampel dipilih secara konsekutif terhadap sputum yang memenuhi kriteria inklusi dan ekslusi.
Persiapan kerja
Pengumpulan dan preparasi sputum
Subjek penelitian 155 sputum penderita yang dicurigai dengan infeksi M. tuberculosis. dilakukan preparasi sputum dimana sputum yang memenuhi kriteria dipreparasi dengan N-asetil sistein dan NaOH (NAlc – NaOH). Sputum dicampur
Pewarnaan tahan asam
Pewarnaan tahan asam dilakukan terhadap sputum menggunakan metoda Ziehl Neelsen.
Kultur
Semirata 2013 FMIPA Unila |253 Desain Primer
Menggunakan Primer Explorer terhadap gen MPB64 M. tuberculosis. Sebelum desain primer dilakukan, telah dinilai spesifisitas sekuens gen MPB64 dengan Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Hasil analisis mempelihatkan MPB64 merupakan sekuens yang conserved, terdiri dari 683 pasang basa (pb). Gen ini hanya ditemukan pada M. tuberculosis complex
dan M. bovis, namun tidak terdapat pada kelompok M.atipik.
Tahapan Kerja
Isolasi DNA
Isolasi DNA dilakukan 2 kali, yaitu dari sputum yang telah dipreparasi dan dari hasil
kultur. Isolasi DNA dari kultur
menggunakan metoda pemanasan (Boiling). 1 koloni M. tuberculosis ditambahkan dengan 2 ml TE buffer dan dipanaskan pada 95°C selama 10 menit. Disentrifus pada kecepatan maksimal semalam 5 – 10 menit. Isolasi DNA dari sputum menggunakan QIAamp DNA Isolation kit (Qiagen).
Amplifikasi LAMP MPB64
Amplifikasi menggunakan metoda
LAMP menggunakan 1 tabung dan
dilakukan dengan sejumlah tahapan optimasi. Optimasi dilakukan terhadap konsentrasi primer, Bst polimerase dan suhu. Hasil amplifikasi dideteksi dengan penambahan SBYR green 1 : 10.
Amplifikasi PCR untuk deteksi MPB64
Amplifikasi PCR juga dilakukan 2 kali tiap sampel, yaitu dari DNA sputum dan kultur.. Amplifikasi PCR menggunakan taq master mix (Qiagen).. Hasil dianalisis dengan elektroforesis gel agarose 1% dan diwarnai dengan SYBR Green.
Analisis Data
Data disusun dalam bentuk
gambar/grafik dan tabel. Analisis dilakukan untuk mengidentifikasi nilai diagnostik
metoda uji dengan kultur sebagai standar baku emas. Nilai diagnostik dilakukan dengan software excell for Windows (sensitvitas, spesivisitas, Nilai prediksi positif dan nilai prediksi negatif). Keeratan hubungan (nilai Kappa) diuji menggunakan software SPSS for Windows versi 16.0.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pada penelitian ini dilakukan kultur terhadap 117 sampel dengan pengamatan antara 2 – 8 minggu. Rerata masa pertumbuhan koloni adalah 4.-6 minggu, dengan variasi antara 3 – 6 minggu. Hasil
kultur memperlihatkan adanya
pertumbuhan pada 67 sampel (57.3%) dan 50 sampel (42.7%) tidak ada pertumbuhan.
PCR
Gambar 2. Hasil elektroforesis sampel DNA menggunakan agarose 0.8%
Isolasi DNA menggunakan metoda boom pada produk hasil preparasi sputum. Hasil isolasi dideteksi menggunakan gel agarose 0.8%.
Hasil amplifikasi produk PCR
memperlihatkan daerah dengan ukuran 240 bp. Produk dianalisis dengan gel elektroforesis 1% dan gel red (biotium). Visualisasi menggunakan gel dock. Hasil penelitian memperlihatkan 75 sampel (64.1%) positif dan sisanya 42 sampel (35.9%) negatif,
Gambar 3. Hasil elektroforesis gel agarose 1% terhadap gen MPB64 dengan daerah amplifikasi 240 bp
Gambar 4. Distribusi hasil PCR terhadap 117 sampel.
LAMP
Produk LAMP dianalisis menggunakan SYBR green dengan volume 1 : 10. Produks positif akan memperlihatkan warna kehijauan sedangkan hasil negatif tetap berwarna orange. Pada penelitian ini didapatkan 84 sampel (71.8%) positif sedangkan 33 sampel (28.2%) negative. Suhu optimal LAMP yang didapatkan adalah 58°C.
Semirata 2013 FMIPA Unila |255
Gambar 6. Distribusi hasil LAMP terhadap 117 sampel sputum
Uji diagnostik
Uji diagnostic didasarkan pada empat variabel, yaitu sensitivitas, spesifisitas, nilai prediksi positif (NPP) dan nilai prediksi negatif (NPN). Standar baku emas yang dijadikan sebagai acuan adalah hasil kultur. Kesesuaian hasil antara metoda uji dengan
kultur dinilai menggunakan uji
kappa.Tingkat kesesuaian pada uji kappa didasarkan atas nilai koefisiennya (r), yang dibagi atas 5 katagori, yaitu sangat erat (0.8-1), erat (0.6-0.8), sedang (0.4-0.6), kurang erat (0.2-0.4) dan sangat kurang (0.0 – 0.2).
Berdasarkan data penelitian diketahui LAMP mempunyai sensitivitas dan nilai duga negatif tertinggi, masing-masing
95.5% dan 90.%, sebaliknya BTA
merupakan metoda yang mempunyai nilai prediksi positif terttinggi, yaitu 97.7% namun mempunyai sensitivitas terendah, yaitu 62.7%. Data dari uji kappa memperlihatkan kesesuaian hasil antara LAMP dan BTA dengan kultur berada pada
katagori sedang, sebaliknya PCR
memperlihatkan kesesuaian hasil dengan katagori erat dengan kultur ( r = 0.608).
Tabel 1. Nilai Diagnostik PCR, LAMP dan BTA menggunakan kultur sebagai standar baku emas
Metoda Sensiti vitas
Spesif isitas
NPN NPP Uji Kappa
BTA 62.7 98.0 66.2 97.7 57.2
PCR 89.6 70.0 83.3 80.0 0.580
LAMP 95.5 60.0 90.9 76.2 0.608
Analisis kesesuaian antara PCR dengan LAMP memperlihatkan tingkat yang erat (p = 0.000 dan r = 0.747), sebaliknya tingkat kesesuaian antara LAMP dengan BTA atau PCR dengan BTA berada pada posisi kurang erat (masing-masing r = 0.249 dan r = 0.396).
PEMBAHASAN
Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) merupakan metoda amplifikasi DNA dan RNA yang sederhana, cepat, spesifik dan murah dan menggunakan taq polymerase yang mempunyai aktivitas strand displacement, misalnya Bst, Pfu, dan Aac polymerase. Metoda ini merupakan pengembangan dari SD pertama kali dikembangkan oleh Eiken Chemical Co., Ltd menggunakan 4 primer yang mengenal 6 daerah yang berbeda tahun 2000 melalui publikasi Notomi dkk (Notomi et al., 2000). Reaksi dilakukan dengan temparatur yang konstan (60 - 65°C) dengan lama antara 15 – 60 menit. Produk ampflifikasi mencapai 109-1010 kali. LAMP. Pada beberapa penelitian ditambahkan Helikase untuk mempercepat reaksi (Vincent et al., 2004). Adanya produk amplifikasi menunjukkan adanya gen target. Identifikasi amplikon dapat dilakukan dengan reaksi turbiditas, perubahan warna setelah penambahan hydroxynaphthol blue (HNB) atau bahan flouresens, seperti SBYR green.
waktu optimal 45 menit. Penelitian ini mendesain lima variasi suhu, yaitu 56, 58, 60, 62 dan 64 serta lima variasi waktu, 25, 35, 45, 60, 75 menit. Hasil penelitian memperlihatkan pada suhu 58°C pemisahan
double stranded DNA, penempelan primer, aktivitas enzim bst polimerase berlangsung secara optimal.
Dari 117 subjek teliti ditemukan 67 sampel (57.3%) positif TB berdasarkan pemeriksaan kultur. Namun demikian, pemeriksaan BTA , PCR dan LAMP memperlihatkan hasil positif yang bervariasi, masing-masing 43, 75 dan 84 kasus. Hasil positif yang lebih banyak dibandingkan dengan kultur pada LAMP menyebabkan spesifisitas metoda ini menjadi rendah, yaitu 60.0%. Kondisi ini diduga disebabkan adanya kontaminasi tanpa sengaja pada sampel DNA karena sampel DNA berasal dari sputum bukan kultur M. tuberculosis. Kontaminasi dapat terjadi melalui 3 cara, yaitu :
Kontaminasi terjadi dari satu bahan
pemeiksaan ke bahan pemeriksaan
berikutnya (sering terjadi dalam masalah diagnostik).
Potensi amplifikasi dari materi yang menkontaminasi waktu LAMP dimulai.
Kontaminasi yang terjadi pada tahap analisis dari pemeriksaan. Upaya yang
dilakukan untuk menanggulangi
kontaminasi adalah menyiapkan reagen steril dan secara aseptik dimasukan kedalam wadah steril untuk sekali pakai, specimen ditangani dengan sangat aseptik menggunakan aspirator dan wadah sekali pakai.
Kemungkinan lain kemampuan LAMP dalam mendeteksi kuman dapat dipengaruhi oleh bebeapa faktor yaitu terdapat inhibitor internal dalam specimen, efisiensi lisis sel kuman, kondisi yang digunakan untuk amplifikasi dan deteksi DNA tidak optimal.
Primer LAMP yang digunakan dalam penelitian ini spesifik untuk MPB64 seharusnya hasil sensitiviti dan spesivisitas
cukup tinggi, namun belum tentu
disebabkan oleh kuman M tuberculosis.
Pada kompleks M tuberculosis pemeriksaan
DNA tidak dapat membedakan M
tuberculosis, M bovis, M bovis BCG, M aficanum dan M microti memiliki kultural, biokimia dan epidemiologi yang jelas berbeda akan tetapi dilihat dari basis DNA masih dianggap sebagai saru species yaitu
M tuberculosis (Lima et al, 2005).
Perbedaan kuman ini dapat dilihat waktu pertumbuhan, produksi niasin, bentuk koloni, reduksi nitrat dan zat yang ada dalam media.
Notomi dkk (2000) menyatakan bahwa kontaminasi merupakan masalah utama pada LAMP, karena SYBR green yang digunakan bersifat tidak spesifik. Namun demikian, hasil ini hampir sama dengan yang ditemukan oleh Parida dkk (2004) atau Mori & Notomi (2009).
Hasil penelitian terhadap LAMP memperlihatkan bahwa metoda ini sangat sensitif, akurat, mudah dan efisien Dari aspek ekonomi terlihat bahwa LAMP lebih murah dibanding PCR konvensional namun tetap lebih mahal dibanding pewarnaan BTA (Mori et al., 2009). Moslemi dkk
(2009) melaporkan bahwa LAMP
mempunyai kesesuain yang tinggi dengan PCR untuk diagnosis Virus Hepatitis B (VHB). Parida dkk memperlihatkan tingkat kesesuaian LAMP untuk deteksi Japanese
Encephalitis Virus dengan RT-PCR
mencapai 85%. Sentivitas dan Spesifisitas metoda ini adalah 100% dan 86%.
Dibandingkan dengan PCR dan BTA, kesesuaian hasil LAMP dengan kultur memperlihatkan nilai yang hampir sama. Hasil uji kappa untuk menilai kesesuaian menunjukkan nilai yang tidak berbeda antara BTA, PCR dan LAMP,
masing-masing 57.2%, 58.0% dan 60.8%.
Berdasarkan katagori terlihat tingkat kesesuaian tersebut berada pada tingkatan sedang.
Semirata 2013 FMIPA Unila |257
lebih akurat. Dalam hal ini peneliti ingin melanjutkan penelitian ini ke tahap berikut dengan menggunakan Gold Nano Partikel
(Au-NP) untuk meningkatkan nilai
diagnostik LAMP dengan pencapaian spesivisitas tinggi.
KESIMPULAN
Berdasarkan data penelitian diketahui 67 sampel positif kultur dan 43 sampel positif berdasarkan hasil BTA
Analisis molekuler memperlihatkan 75 kasus TB berdasarkan hasil PCR dan 84 kasus berdasarkan hasil LAMP
Uji diagnostic memperlihatkan LAMP merupakan metoda yang sangat sensitif namun tidak spesifik
Tidak ada perbedaan tingkat kesesuaian hasil antara LAMP dengan PCR dan BTA menggunakan kultur sebagai standart baku emas.
SARAN
Berdasarkan data penelitian ini, disarankan hal berikut :
Perlu dkembangkan probe spesifik terhadap daerah target amplifikasi LAMP, sehingga spesivisitas LAMP lebih baik. Perlu diketahui konsentrasi minimal bakteri yang dapat dideteksi menggunakan metoda LAMP.
Comparison of the amplified
Mycobacterium tuberculosis (MTB) direct test, amplicor MTB PCR, and IS6110-PCR for detection of MTB in respiratory specimens. Clin. Infect. Dis . 23: 1099–1106.
Das, S., Paramasivan, C.N., Lewis, D.B., Prabhakar, R., Narayanan, P.R., 1995. IS 6110 restriction fragment length polymorphism typing of clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis from patients with pulmonary tuberculosis in Madras, south India. Tuberc Lung Dis. 76 : 550-4
van Deun, A and Portaels, F., 1998. Limitations and requirements for quality control of sputum smear microscopy for acid-fast bacilli. Int. J.Tuberc. Lung Dis. 2:756–765
Dinh, D.T,Le, M.T.Q., Vuong, C.D, 2011. An Update Loop mediated isothermal amplification for rapid diagnosis H5N1 Avian Influenza Viruses. Medicine and Health. 39:3-7
Fogan, L. 1969. PPD antigens and the diagnosis of mycobacterial diseases. Arch. Intern. Med. 124:49–54.
Gennaro, M.L., 2000. Immunologic
Diagnosis of Tuberculosis. Clin. Infect. Dis. 30 : S243 – 6.
Hong, T. C. T., Q. L. Mai, D. V. Cuong, M. M. Parida, M. Harumi, M. Tsugunori, F.
Hasebe, and K. Morita. 2004.
Development and evaluation of a novel loop-mediated isothermal amplification method for rapid detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus. J. Clin. Microbiol. 42: 1956–1961
Lalvani, A., Pathan, A.A., McShane, H., Wilkinson, R.J., Latif, M., Conlon, C.P., 2001. Rapid detection of Mycobacterium tuberculosis infection by enumeration of antigen-specific T cells. Am J Respir Crit Care Med.163:824–8
Lima DM. Bollela VR, Jacome BJT,
Fonseca BAL. Identifikasi of
Mycobacterium
Mori, Y. and Notomi, T., 2009. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious diseases. J. Inf. Chemother. 15 : 62–69
Moslemi, E., Javadi, G., Praivar, K., Sattari, T.N. and Amini, H.K., 2009. Loop mediated isothermal amplification (LAMP) for rapid detection of HBV in Iran. African Journal of Microbiology Research. 3 : 439-445.
Nicol MP, Pienaar D, Wood K, Eley B, Wilkinson RJ, Henderson H, 2005.
Enzyme-linked immunospot assay
responses to early secretory antigenic target 6, culture filtrate protein 10, and purified protein derivative among children with tuberculosis: implications for diagnosis and monitoring of therapy. Clin Infect Dis. 40:1301–8.
Notomi, T., Okayama, H., Masubuchi, H., Yonekawa, T., Watanabe, K. . Amino, N and Hase, T., 2000. Loop mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acid research. 28 : e63.
Parida, M. M., P. Guillermo, S. Inoue, F. Hasebe, and K. Morita., 2004. Real-time reverse transcription loop mediated isothermal amplification for rapid detection of West Nile virus. J. Clin. Microbiol. 42:257–263
Parida, M.M., Santhosh, S.R., Dash, P.K., Tripathi, N.K., Saxena, P., Ambuj, S., Sahni, A.K., Rao, L. and Morita, K. 2006. Development and Evaluation of Reverse Transcription–Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for Rapid and Real-Time Detection of Japanese Encephalitis Virus. J. Clinn Microbiol. 44 : 4172 – 4178.
Piersimoni, C and, Scarparo, C., 2003. Relevance of commercial amplification methods for direct detection of
Mycobacterium tuberculosis complex in clinical samples. J Clin Microbiol. 41:5355–65
Shen, G., Bahera, D., Bhalla, M., Nadas, A and Laal, S., 2009. Peptide-Based Antibody Detection for Tuberculosis Diagnosis. Clin.Vacc. Immunol. 16 : 49 – 54.
Vincent, M., Xu, Y. and Kong, H. 2004. Helicase-dependent isothermal DNA
amplification. EMBO Rep. 5: 795–800.
