Gambar 3. Alur kegiatan penelitian
1. Transformasi Gen Kitinase pada Trichoderma harzianum Kultur T. harzianum
Media yang digunakan untuk kultur T. harzianum yaitu : (1) PDB (Potato Dextrose Broth) dibuat dari 200 g kentang dan 20 g gula yang dilarutkan dalam 1 L dH2O, (2)
media PDA (Potato Dextrose Agar) dibuat dengan bahan yang sama dengan PDB dan ditambah dengan 15 g Bacto agar. Media disterilkan di dalam autoklaf selama 15 menit pada tekanan 1 atm dan suhu 1210C.
Cendawan T. harzianum dikulturkan dalam media PDB yang diinkubasi di atas shaker dengan kecepatan 150 rpm pada suhu ruang. Setelah 5 - 7 hari, miselium dipanen dengan penyaringan, kemudian dibilas dengan Phosphate Buffer Saline (8,00 g NaCl;
A. tumefaciens
T. harzianum DT38
Transformasi
Seleksi dgn higromisin Transforman
Aktivitas enzim kitinase pd transforman -PCR -Southern blot E.coli Gen Kitinase 1,5 Kb trpC gpd
A
A
L
L
U
U
R
R
P
P
E
E
N
N
E
E
L
L
I
I
T
T
I
I
A
A
N
N
0,20 g KCl; 1,44 g Na2HPO4.H2O; 0,24 g KH2PO4 pH 7,4 dan dilarutkan dalam 1 liter
akuades). Miselium disimpan untuk analisis selanjutnya.
Triparental Mating
Bakteri E. coli pembawa konstruk pPK2-Trp-Chi, E. coli helper PRK, dan A. tumefaciens AGLO masing-masing ditumbuhkan pada media LB agar selama semalam. Ketiga bakteri dikulturkan bersama pada media LB agar tanpa antibiotik dengan inokulasi saling timpa dengan jarum ose secara berurutan dimulai dari E. coli pembawa konstruk pPK2-Trp-Chi, E. coli helper PRK dan A. tumefaciens. Hasil mating diinkubasi pada 27oC selama 8 jam, kemudian kultur sebanyak 1 ose dipindahkan ke media LB agar yang mengandung rifampisin 25 µg/mL dan kanamisin 50 µg/mL atau higromisin B 50 µg/mL. Kultur diinkubasi semalam pada 270C (Chaidamsari et al. 1999). Selanjutnya koloni A. tumefaciens hasil seleksi dikonfirmasi dengan metode PCR menggunakan pasangan primer nptII-F : 5’ gca tac ggt tga tcc ggc tac c 3’ dan nptII-R : 5’ tga tat tcg gca agc agg cat 3’. Metode yang digunakan untuk mengamplifikasi fragmen DNA dengan teknik PCR mengikuti cara baku menggunakan kit dari Invitrogen dengan menggunakan pasangan primer nptII-F dan nptII-R. Campuran reaksi terdiri atas 1 koloni tunggal A. tumefaciens disuspensi dalam 17,6 µl ddH2O; 1,5 µl MgCl2 25 mM; 0,5 µl dNTP 10 mM;
0,1 µl (1 unit) enzim Taq DNA polimerase; 2,5 µl buffer 10x PCR; masing-masing 1 µl primer nptII-F dan nptII-R dengan konsentrasi 25 pmol. Volume total 25 µl.
PCR dilakukan menggunakan mesin geneAmp PCR system 2400 dengan program: pradenaturasi 94°C selama 5 menit, denaturasi pada 94°C selama 1 menit, penempelan primer (annealing) pada 55°C selama 1 menit, pemanjangan utas (extension) pada 72°C selama 1.5 menit. Setelah mencapai 35 siklus PCR diakhiri dengan post-extension pada 72°C selama 5 menit. Hasil PCR dielektroforesis pada gel agarose 1 % (b/v) + EtBr dengan buffer TBE 0,5x dan hasil elektroforesis dilihat pada UV transluminator.
Uji konsentrasi antibiotik untuk seleksi transformasi
T. harzianum tipe liar (wildtype) ditumbuhkan pada media PDA. Setelah 2 hari, media PDA yang mengandung berbagai konsentrasi higromisin B dari 0 sampai dengan 400 ug/mL dituangkan di atas kultur. Pengamatan pertumbuhan T. harzianum dilakukan
pada kultur yang berumur 10 hari untuk menetapkan konsentrasi higromisin yang dapat menghambat atau mematikan T. harzianum tipe liar.
Transformasi T. harzianum melalui A. tumefaciens
Konstruk gen kitinase 1.5 kb (chi42) dengan promoter glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase (gpd) dan terminator transkripsi tryptophan synthetase (trpC) dari Aspergillus nidulans telah diklon ke dalam vector biner pPK2. Plasmid ini kemudian digunakan untuk transformasi ke dalam T. harzianum DT38 menggunakan A. tumefaciens strain AGLO.
Kegiatan transformasi dimulai dengan menumbuhkan T. harzianum DT38 pada media PDA 2 % selama 4 - 5 hari. Spora yang telah tumbuh dengan baik tanpa kontaminasi dipanen dengan spatula steril. Spora disuspensi dengan dH2O steril dan
disentrifugasi, kemudian diresuspensi dalam dH2O sampai konsentrasi 106-107 spora/mL.
Bakteri A. tumefaciens dikulturkan 2 hari sebelum kegiatan transformasi dilakukan. Satu koloni dari stok bakteri pada media agar diambil dan dikulturkan dalam media LB + kanamisin 50 µg/mL dan diinkubasi pada suhu 28°C dalam shaker dengan kecepatan 150 rpm selama sehari semalam. Kultur yang tumbuh disentrifugasi dan pellet sel bakteri diresuspensi dengan media induksi bakteri. Kultur ini diinkubasi dalam shaker lagi selama 3 jam.
Suspensi spora dicampur dengan volume yang sama dengan kultur A. tumefaciens. Selanjutnya sebanyak 400 uL campuran ditebar di atas kertas filter, kemudian diletakkan pada media induksi agar. Setelah dua hari di atas kertas filter, dituangkan media PDA yang mengandung 300 µg/mL cefotaxim untuk membunuh A. tumefaciens dan 300 µg/mL higromisin B untuk seleksi (Purwantara 2003). Transforman dapat diamati setelah diinkubasi 7 - 10 hari, dan selanjutnya dapat dipindahkan pada media PDA baru sebagai koleksi transforman.
2. Analisis Transforman Isolasi DNA Genomik
Isolasi DNA genomik T. harzianum dilakukan dengan metode Orosco-Castillo (1994). Sebanyak 0,2 g miselium digerus dengan mortar dan menambahkan Polyvinylpirolidone (PVP) sebanyak 20 mg dan N2 cair. Serbuk halus dimasukkan ke
dalam tabung Eppendorf 2 mL, kemudian ditambah 750 µl buffer ekstraksi N-Cetyl-N,N,N-trimethyl-ammonium bromide (CTAB) yang telah dipanaskan dan diberi 1% merkaptoetanol. Komposisi beberapa pereaksi dapat dilihat pada Lampiran 1. Campuran dibalik beberapa kali dan diinkubasi 30 menit pada suhu 65oC dalam water bath. Setelah itu didinginkan dan ditambah 1 ml larutan khloroform : isoamil alkohol (24:1) dan dibalik beberapa kali. Campuran disentrifugasi pada kecepatan 11.000 rpm selama 10 menit kemudian diambil supernatannya dan dipindahkan ke dalam tabung baru. Perlakuan dengan kloroform+isoamilalkohol diulang sebanyak 2 kali.
Supernatan ditambah isopropanol 1 x volume dan dikocok perlahan hingga homogen kemudian disimpan dalam freezer selama 30 menit, dan disentrifugasi pada kecepatan 11.000 rpm selama 10 menit. Cairan dibuang dan pellet DNA dikeringkan kemudian dilarutkan dalam 200 µl buffer TE dan ditambahkan CH3COONa 3M, pH 5,2
sebanyak 1/10 volume serta etanol absolut dingin 2,5 volume. Campuran dikocok hingga homogen dan disimpan dalam freezer selama 30 menit. Campuran disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit. Supernatan dibuang dan pellet DNA dicuci dengan 200 µl etanol dingin 70% kemudian disentrifugasi pada kecepatan 5.000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang dan pellet DNA dikeringkan dengan speed vacuum. DNA kering dilarutkan dalam 100 µl buffer TE/dH2O.
Pelaksanaan PCR
Hasil isolasi DNA genomik transforman digunakan sebagai template untuk PCR. PCR menggunakan primer spesifik yang dirancang pada daerah sekuen penyandi resistensi higromisin (hph) dalam konstruk gen chi (pPK2-Trp-Chi) terintroduksi. Urutan nukleotida primer hphF : 5’ act atc ggc gag tac ttc tac ac dan hphR : 5’ gta tca ctg gca aac tgt gat g 3’. Metode yang digunakan untuk mengamplifikasi fragmen DNA dengan
teknik PCR mengikuti cara baku menggunakan kit dari Invitrogen dengan menggunakan pasangan primer hphF dan hphR. Campuran reaksi terdiri atas 1 µl DNA sampel, 17,6 µl ddH2O; 1,5 µl MgCl2 25 mM; 0,5 µl dNTP 10 mM; 0,1 µl (1 unit) enzim Taq DNA
polimerase; 2,5 µl buffer 10x PCR; masing-masing 1 µl primer hphF dan hphR konsentrasi 25 pmol. Volume total 25 µl.
PCR dilakukan menggunakan mesin geneAmp PCR system 2400 dengan program: pradenaturasi 94°C selama 5 menit, denaturasi pada 94°C selama 1 menit, penempelan primer (annealing) pada 55°C selama 1 menit, pemanjangan utas (extension) pada 72°C selama 1.5 menit. Setelah mencapai 35 siklus PCR diakhiri dengan post-extension pada 72°C selama 5 menit. Hasil PCR dielektroforesis pada gel agarose 1 % (w/v) + EtBr dengan buffer TBE 0,5x dan hasil elektroforesis dilihat pada UV transluminator.
Southern blot
Pada sintesis probe digunakan fragmen gen chi dalam pTOPO sebagai template. Sebelumnya DNA pTOPO-chi dipotong menggunakan enzim EcoR1 sehingga diperoleh DNA vektor pTOPO dan DNA sisipan (gen chi). Campuran reaksi digesti adalah DNA pTOPO-chi sebanyak 100 uL, buffer H sebanyak 15 uL, BSA sebanyak 15 uL, enzim EcoR1 sebanyak 5 uL dan ditambahkan ddH2O sampai volume total 140 uL. Campuran
reaksi diinkubasi pada 37°C selama 3 jam. Hasil reaksi digesti dielektroforesis pada gel agarose 0,8 %. DNA sisipan yang terpisah dari DNA vektor kemudian dipotong dari gel agarose menggunakan pisau skapel untuk dielusi. Elusi dari gel agarose menggunakan kit dari Qiagen (Kit QIA-Quick Gel Extraction) sesuai prosedur sebagai berikut : potongan fragmen DNA dari gel agarose dimasukkan ke dalam tabung dan ditambahkan 3 volume Buffer QG (100 mg ≈100 µL). Gel diinkubasi pada suhu 50oC selama 10 menit, dengan pengocokan tabung setiap 2-3 menit, sampai gel larut sempurna (berwarna kuning seperti Buffer QG). Jika warna larutan orange atau violet, sebanyak 10 µl sodium asetat 3M pH 5,0 ditambahkan dan tabung dikocok sampai warna larutan kembali menjadi kuning. Spin kolom dipasangkan ke dalam tabung 2 ml. Sampel secara bertahap dimasukkan ke dalam kolom kemudian disentrifugasi 13.000 rpm selama 1 menit. Setelah semua sampel dilewatkan pada kolom, supernatan dibuang dan kolom ditempatkan kembali ke dalam tabung yang sama. Sebanyak 0,5 ml Buffer QG
ditambahkan ke dalam kolom dan disentrifugasi kembali selama 1 menit. Kolom dicuci dengan 0,75 ml Buffer PE dan disentrifugasi 1 menit. Supernatan dibuang dan kolom disentrifugasi kembali untuk menghilangkan buffer yang tersisa. Kolom ditempatkan ke dalam tabung 1,5 ml yang baru. Buffer elusi sebanyak 50 µl dimasukkan ke dalam kolom dan disentrifugasi 13.000 rpm selama 1 menit untuk mengelusi DNA yang terikat di dalamnya. Hasil elusi dicek dengan elektroforesis pada gel agarose 1 %.
Sintesis Probe
Probe disintesis menggunakan DIG High Prime DNA Labelling and Detection Starter Kit I dari Roche. Sebanyak 1 µg template DNA chi (5 µl) ditambah ddH2O steril
hingga volume menjadi 16 µL. DNA didenaturasi dengan mendidihkannya selama 10 menit dan langsung didinginkan di dalam es. DIG High Prime (vial 1) sebanyak 4 µl ditambahkan ke dalam campuran reaksi dan disentrifugasi sebentar untuk menghomogenkan. Campuran reaksi diinkubasi semalam pada 37oC. Reaksi pelabelan
probe dihentikan dengan menambahkan 2 µl 0,2 M EDTA pH 8,0.
Penentuan efisiensi pelabelan
Untuk memperoleh hasil deteksi dengan probe yang telah dibuat, terlebih dahulu dilakukan penentuan konsentrasi probe yang ditambahkan. Probe dan kontrol probe sebanyak 1 µl diteteskan (di-dot blot) pada membran dengan berbagai konsentrasi. Membran difiksasi dalam oven 120oC selama 30 menit. Membran ditransfer ke dalam kontainer plastik dan direndam dengan 20 ml Buffer Maleic Acid selama 2 menit sambil digoyang. Selanjutnya berturut-turut pereaksi diganti dengan inkubasi 30 menit dalam 10 ml Blocking Solution, inkubasi 30 menit dalam 10 ml Antibody Solution dan dilakukan pencucian 2 x 15 menit dalam Washing Buffer. Membran dideteksi dalam 10 ml Detection Buffer selama 2 - 5 menit dan diwarnai dengan 2 ml Color Substrate Solution yang baru dibuat (fresh) dan diinkubasi di tempat gelap selama 15-30 menit. Reaksi pewarnaan dihentikan jika spot sudah nampak berwarna dengan mencuci membran dalam 50 ml ddH2O steril atau buffer TE. Selanjutnya membran dikeringanginkan dan dapat
Digesti DNA genomik dan blotting ke dalam membran
DNA genomik T. harzianum transforman dan non transforman didigesti dengan enzim EcoRI. Komposisi campuran reaksi digesti yaitu : sebanyak 10 µl DNA sampel, 2,0 µl enzim EcoRI, 4,0 µl Buffer digesti, 4,0 µl BSA dengan total volume 20 µl. Campuran reaksi tersebut diinkubasi dalam water bath pada suhu 37oC selama semalam. Hasil digesti diteteskan sebanyak 10 uL pada membran dan difiksasi dalam oven pada suhu 120°C selama 30 menit. Membran dapat langsung dihibridisasi ataupun disimpan terlebih dahulu.
Hibridisasi
Larutan DIG Easy Hyb dipanaskan terlebih dahulu pada temperatur hibridisasi (40oC). Pre hibridisasi membran yang telah di-dot blot dengan DNA genomik hasil pemotongan dengan enzim EcoR1, selama 30 menit dengan pengocokan konstan pada suhu 40oC. Probe DNA chi didenaturasi dalam air mendidih selama 5 menit dan langsung didinginkan di dalam es selama 2 menit. Probe DNA chi sebanyak 15 µl dimasukkan ke dalam larutan hibridisasi. Kemudian membran dihibridisasi pada suhu 40oC semalam
dengan pengocokan konstan. Membran dicuci dalam 2x SSC + 0,1 % SDS pada suhu 15 – 25oC selama 2 x 5 menit sambil dikocok konstan. Selanjutnya membran dicuci dalam 0,5x SSC + 0,1 % SDS pada suhu 68oC selama 2 x 15 menit sambil dikocok konstan. Membran siap untuk dideteksi dan diwarnai seperti prosedur pada efisiensi pelabelan.
Ekstraksi enzim kitinase
Sebanyak 1 g miselium T. harzianum ditambah nitrogen cair dan digerus dengan mortar sampai halus. Selanjutnya serbuk dimasukkan ke tabung yang mengandung 1 ml buffer fosfat 50 mM pH 6,5 (1,36 g KH2PO4; 2,28 g K2HPO4) dan 1% merkaptoetanol.
Sentrifugasi dilakukan pada kecepatan 5.000 rpm selama 10 menit kemudian supernatan diambil untuk diuji protein totalnya menggunakan metode Lowry dan untuk menetapkan aktivitas kitinasenya (Siswanto 2002).
Uji aktivitas kitinase dengan cara sebagai berikut : sebanyak 25 – 100 µl larutan enzim kasar ditambah 10 µl substrat p-nitrophenyl-N-acetyl-ß-D-glucosaminide (pNP-GlcNAc) 5 mM dan buffer fosfat 50 mM pH 6,5 sampai volume totalnya 250 uL.
Campuran diinkubasi selama 0 dan 3 jam pada suhu 37oC, dan reaksi dihentikan dengan menambahkan 125 µl TCA 20 %. Supernatan dipisahkan dengan cara sentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit. Sebanyak 0,3 mL supernatan ditambah 0,7 mL NaOH 0,5 M dan setelah 30 menit diukur absorbansinya pada λ 405 nm. Aktivitas kitinase ditentukan berdasarkan kurva standar pengukuran aktivitas enzim kitinase murni (Sigma) dengan kondisi pengukuran yang sama (Siswanto 2002).
Pengukuran kadar protein dengan metode Lowry menggunakan pereaksi A
(Na-2CO3 6% dalam 0,2 M NaOH), pereaksi B (1,5% CuSO4 dalam 3% sodium sitrat),
pereaksi C = campuran pereaksi A : pereaksi B sebanyak 50 : 1, pereaksi D = pereaksi Folin Ciocalteus : aquades = 3 : 1. Sampel sebanyak 10 - 50 uL dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan buffer fosfat hingga volume total 1.6 mL. Pereaksi C dimasukkan ke masing-masing tabung sebanyak 600 uL, divortex dan didiamkan selama 10 menit. Setelah itu pereaksi D dimasukkan sebanyak 200 uL, divortex dan didiamkan selama 30 menit. Pengukuran absorbansi dilakukan pada λ 750 nm dan konsentrasi ditentukan berdasarkan kurva standar.
