EFEK PROBIOTIK INDIGENUS PADA PROFIL
IMUNOHISTOKIMIA ANTIOKSIDAN SUPEROKSIDA
DISMUTASE (SOD) DI HATI TIKUS YANG DIPAPAR
ENTEROPATHOGENIC Escherichia coli (EPEC)
FENNY FITRIAN UTAMI
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
Imunohistokimia Antioksidan Superoksida Dismutase (SOD) di Hati Tikus yang Dipapar Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC). Di bawah bimbingan
TUTIK WRESDIYATI
Probiotik merupakan mikroorganisme hidup yang apabila diberikan pada jumlah yang tepat dapat bermanfaat bagi kesehatan saluran pencernaan.
Lactobacillus plantarum dan Lactobacillus fermentum merupakan probiotik yang
telah berhasil diisolasi dari daging sapi peranakan Ongol di beberapa pasar tradisional di daerah Bogor dan telah terbukti secara in vitro bersifat sebagai probiotik.
EPEC merupakan salah satu penyebab utama diare pada anak-anak di Indonesia dengan prevalensi kejadiannya 55% dari jumlah anak penderita diare. Infeksi EPEC di saluran pencernaan membentuk lesio attaching/effacing (A/E lesion) pada epitel usus dan menyebabkan kerusakan struktur sitoskeletal sel serta membentuk formasi yang disebut pedestal actin formation. Formasi sel seperti ini merupakan tanda adanya penyakit dan kerusakan sel. EPEC yang berada di saluran pencernaan dan sel yang rusak akibat perlekatan EPEC, akan difagosit oleh makrofag. Proses fagositosis menghasilkan radikal bebas. Antioksidan merupakan suatu zat yang dapat menetralisir radikal bebas. Enzim copper, zinc-superoksida dismutase (Cu,Zn-SOD) merupakan salah satu enzim antioksidan endogen yang berperan mengkatalis dismutasi radikal bebas anion superoksida (O2-) menjadi radikal yang lebih lemah yaitu hidrogen peroksida (H2O2) dan selanjutnya akan diubah menjadi oksigen (O2) yang lebih stabil dan air (H2O) oleh glutation peroksidase dan katalase.
Sejauh ini belum banyak laporan secara in vivo tentang efek probiotik terhadap status antioksidan tubuh. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan menganalisa pengaruh pemberian probiotik L. plantarum dan L. fermentum terhadap profil imunohistokimia antioksidan superoksida dismutase (Cu,Zn-SOD) di jaringan hati pada tikus yang dipapar bakteri EPEC.
Sebanyak 90 ekor tikus percobaan dibagi dalam 6 kelompok perlakuan,
yaitu: (A) kontrol negatif, (B) perlakuan L. plantarum, (C) perlakuan
L. fermentum, (D) perlakuan L. plantarum + EPEC, (E) perlakuan L. fermentum +
EPEC, dan (F) perlakuan EPEC (kontrol positif). Dosis Lactobacillus yang diberi adalah 108 cfu/ml/hari pada hari ke-1 sampai hari ke-21, sedangkan dosis EPEC yang diberi adalah 106 cfu/ml/hari pada hari ke-8 sampai hari ke-14. Setiap kelompok perlakuan berjumlah 15 ekor tikus yang akan diterminasi pada 3 waktu yang berbeda (hari ke-8, 15, dan 22) masing-masing 5 ekor tikus. Setelah organ hati tikus diperoleh, selanjutnya diproses dan diwarnai dengan pewarnaan imunohistokimia terhadap Cu,Zn-SOD. Hasil pewarnaan imunohistokimia diamati secara kualitatif dan kuantitatif dengan mikroskop cahaya.
Hasil penelitian memperlihatkan bahwa pemberian probiotik L. fermentum selama 2-3 minggu dapat meningkatkan kandungan enzim Cu,Zn-SOD di jaringan hati tikus. Sedangkan pemberian probiotik L. plantarum hanya mampu mempertahankan kandungan enzim antioksidan tersebut seperti pada kondisi kontrol negatif. Pada tikus yang dipapar EPEC, pemberian probiotik L. fermentum
selama 2-3 minggu dapat meningkatkan kandungan enzim Cu,Zn-SOD di jaringan hati tikus. Sedangkan pemberian L. plantarum hanya mampu mempertahankan kandungan enzim antioksidan Cu,Zn-SOD pada minggu kedua, lalu kandungan enzim antioksidan tersebut menurun pada minggu ketiga.
L. fermentum lebih baik dari pada L. plantarum dalam meningkatkan
kandungan enzim Cu,Zn-SOD di jaringan hati tikus, baik pada kelompok yang diberi EPEC maupun tidak.
Immunohistochemical Profile of Antioxidant Superoxide Dismutase (SOD) in Liver of Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) Treated Rats.
Under direction of TUTIK WRESDIYATI
The study was conducted to analyze influence of indigeneous probiotic Lactobacillus plantarum and Lactobacillus fermentum on immunohistochemical profile of antioxidant superoxide dismutase (SOD) in liver of enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) treated rats. A total of 90 male rats (Sprague Dawley) were divided into six groups; (A) negative control, (B) Lactobacillus plantarum treated group, (C) Lactobacillus fermentum treated group, (D) Lactobacillus plantarum and EPEC treated group, (E) Lactobacillus fermentum and EPEC treated group, and (F) EPEC treated group (positive control). The content of antioxidant copper, zinc-superoxide dismutase (Cu,Zn-SOD) was analyzed with immunohistochemical techniques using monoclonal antibody of Cu,Zn-SOD. The result showed that L. fermentum increased the content of Cu,Zn-SOD in rat liver on 2nd and 3rd weeks at both conditions; with and without EPEC treatment. L. plantarum treatment for 1 week until 3 weeks, could maintain the content of Cu,Zn-SOD in rat liver tissue as well as negative control. While, in L. plantarum and EPEC treated group, the content of Cu,Zn-SOD decreased after one week of EPEC treatment. L. fermentum showed better effect in terms increase the content of Cu,Zn-SOD in rat liver tissue.
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi Efek Probiotik Indigenus pada
Profil Imunohistokimia Antioksidan Superoksida Dismutase (SOD) di Hati Tikus yang Dipapar Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) adalah karya
saya dengan arahan dari dosen pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Bogor, Agustus 2011
Fenny Fitrian Utami
© Hak Cipta Milik IPB, tahun 2011
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB
EFEK PROBIOTIK INDIGENUS PADA PROFIL
IMUNOHISTOKIMIA ANTIOKSIDAN SUPEROKSIDA
DISMUTASE (SOD) DI HATI TIKUS YANG DIPAPAR
ENTEROPATHOGENIC Escherichia coli (EPEC)
FENNY FITRIAN UTAMI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Kedokteran Hewan
pada Fakultas Kedokteran Hewan
FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011
Nama : Fenny Fitrian Utami
NIM : B04070038
Program Studi : Kedokteran Hewan
Disetujui, Dosen Pembimbing
Prof. Drh. Tutik Wresdiyati, Ph.D, PAVet NIP. 19640909 199002 2 001
Diketahui,
Wakil Dekan Fakultas Kedokteran Hewan
Dr. Nastiti Kusumorini NIP. 19621205 198703 2 001
PRAKATA
Penulis mengucapkan syukur alhamdulillah kepada Allah SWT atas rahmat dan karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Penelitian dengan judul: Efek Probiotik Indigenus pada Profil Imunohistokimia Antioksidan Superoksida Dismutase (SOD) di Hati Tikus yang Dipapar Enteropathogenic
Escherichia coli (EPEC), merupakan bagian dari proyek penelitian yang didanai
oleh Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi (DIKTI) Kementerian Pendidikan Nasional RI melalui program Hibah Kompetensi dengan nomor kontrak: 409/SP2H/DP2M/VI/2010 atas nama Prof. Dr. Ir. Made Astawan, M.S. Penelitian ini dilaksanakan sejak bulan Juli 2009 sampai Juli 2010 di SEAFAST CENTRE IPB dan Laboratorium Histologi, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.
Penyusunan skripsi ini merupakan suatu proses perjalanan panjang yang memberikan pembelajaran tiada henti bagi penulis. Penulis mengucapkan terima kasih yang tak terhingga kepada Prof. Drh. Tutik Wresdiyati, Ph.D, PAVet selaku dosen pembimbing skripsi atas ilmu, arahan, kritik, dan saran yang mendukung terselesaikannya skripsi ini. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Tim Peneliti Hibah Kompetensi DIKTI: Prof. Dr. Ir. Made Astawan, M.S; Prof. Drh. Tutik Wresdiyati, Ph.D, PAVet; dan Dr. Irma Isnafia Arief, S.Pt, M.Si yang telah memberikan arahan dan ilmu selama pelaksanaan penelitian.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Drh. Huda S. Darusman, M.Si dan Dr. Drh. Hera Maheshwari, M.Sc sebagai dosen pembimbing akademik yang telah memberikan bimbingan serta semangat kepada penulis sepanjang perjalanan pendidikan penulis di Fakultas Kedokteran Hewan IPB. Selanjutnya, penulis mengucapkan terima kasih kepada Dr. Drh. Choirun ‘Nisa, M.Si, PAVet selaku dosen penilai seminar, Drh. Wahono Esthi Prasetyaningtiyas, M.Si selaku dosen moderator seminar, Dr. Drh. Elok Budi Retnani, M.S dan Dr. Drh. Wiwin Winarsih, M.Si selaku dosen penguji Ujian Akhir Sarjana Kedokteran Hewan, Dr. Drh. Adi Winarno dan Drh. I Ketut Mudite Adyane, M.Si atas ilmu dan saran yang telah diberikan untuk penyelesaian skripsi ini. Seluruh dosen FKH IPB yang telah memberikan ilmu dan nasehat kepada penulis selama berkuliah dan staf
dan bimbingan yang telah diberikan selama penelitian berlangsung.
Ungkapan rasa hormat, terima kasih, dan sayang penulis sampaikan kepada ayahanda tercinta (Alm.), mama tercinta, dan adik-adik tersayang (Ona, Imam, dan Ade), serta keluarga besar atas kasih sayang yang begitu besar, doa, keceriaan, dan dukungan yang tidak ternilai harganya baik fisik maupun moril yang telah diberikan kepada penulis sepanjang perjalanan hidup penulis. Kepada Anggi Rianto, terima kasih atas semangat yang begitu berharga serta bantuan yang telah diberikan kepada penulis selama penelitian sampai penyelesaian skripsi ini.
Terima kasih penulis ucapkan kepada teman-teman sepenelitian (Kristina Dwi Wulandari, Sri Rahmatul Laila, dan Yeni Setiorini) atas kerja sama, kebersamaan, bantuan, dan waktu untuk bertukar pikiran selama ini. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Kak Sandra dan Kak Angga atas kerjasama dan bantuan yang telah diberikan kepada penulis selama penelitian di Laboratorium Histologi. Kepada sahabat-sahabatku (Sari, Levi, Wulan, Putri, Deni, Ira, Iwan), terima kasih atas motivasi, semangat, keceriaan, persahabatan, dan semua hal indah yang telah dilalui bersama selama ini. Sahabat-sahabat Gianuzzi FKH 44, terima kasih atas kebersamaan, semoga persahabatan tetap terjalin sampai akhir hayat.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Agustus 2011
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Solok pada tanggal 10 November 1989 sebagai anak pertama dari pasangan Yandraweli, SH (Alm.) dan Yulfitri, SP. Penulis menamatkan pendidikan SMA pada tahun 2007 di SMAN 1 Gunung Talang Kabupaten Solok dan pada tahun yang sama diterima di IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) pada Fakultas Kedokteran Hewan.
Selama menempuh pendidikan di IPB, penulis terlibat dalam organisasi Himpunan Minat dan Profesi Satwaliar selama 2 periode yakni sebagai staf Divisi Pendidikan pada periode kepengurusan 2008/2009 dan Sekretaris I pada periode kepengurusan 2009/2010. Penulis juga aktif di Badan Eksekutif Mahasiswa (BEM) Fakultas Kedokteran Hewan periode kepengurusan 2008/2009 sebagai staf Departemen Pengembangan Sumber Daya Mahasiswa (PSDM). Selain itu, penulis aktif di organisasi mahasiswa daerah Ikatan Pelajar dan Mahasiswa Minang (IPMM) Bogor pada periode kepengurusan 2008-2009 sebagai staf Bidang Olahraga. Penulis juga pernah menjadi Sekretaris Umum Kohati pada tahun 2010 dan Ketua Umum Kohati pada tahun 2011 di Himpunan Mahasiswa Islam (HMI) Komisariat FKH IPB Bogor.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi asisten mata kuliah Histologi Veteriner I dan Histologi Veteriner II pada tahun ajaran 2009/2010. Penulis juga mengikuti magang profesi medis veteriner di beberapa instansi, seperti: Taman Marga Satwa Ragunan dan Pusat Penyelamatan Satwa (PPS) Cikananga. Penulis memperoleh beasiswa Peningkatan Prestasi Akademik (PPA) pada semester 4 sampai dengan semester 8. Bersama dengan tim, penulis lolos seleksi Program Kreativitas Mahasiswa bidang Kewirausahaan (PKM-K) yang memperoleh dana hibah dari Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi (DIKTI) pada tahun 2008. Sebagai tugas akhir, penulis melakukan penelitian “Efek Probiotik Indigenus pada Profil Imunohistokimia Antioksidan Superoksida Dismutse (SOD) di Hati Tikus yang Dipapar Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC)” di bawah bimbingan Prof. Drh. Tutik Wresdiyati, Ph.D, PAVet.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ... xii
DAFTAR GAMBAR ... xiii
DAFTAR LAMPIRAN ... xiv
I. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang ... 1
1.2 Tujuan Penelitian ... 4
II. TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Hewan Percobaan... 5
2.2 Hati ... 7
2.3 Enteropathogenic E.coli (EPEC) ... 9
2.4 Bakteri Asam Laktat sebagai Probiotik ... 10
2.5 Radikal Bebas dan Antioksidan Cu-Zn SOD ... 13
2.6 Imunohistokimia ... 15
2.7 Penelitian Pendahuluan ... 16
III. METODE PENELITIAN 3.1 Alat dan Bahan Penelitian ... 18
3.2 Waktu dan Tempat Penelitian ... 18
3.3 Tahapan Penelitian 3.3.1 Hewan Percobaan. ... 19
3.3.2 Kandang dan Perlengkapan ... 20
3.3.3 Ransum ... 20
3.3.4 Perlakuan terhadap Hewan Percobaan ... 20
3.3.5 Pembuatan Preparat Histologi Jaringan Hati Ttikus ... 22
3.3.6 Analisis Kandungan SOD Hati Tikus ... 24
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ... 26
V. SIMPULAN DAN SARAN ... 41
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Komposisi ransum standar tikus ... 20
2 Kelompok tikus percobaan sesuai perlakuan yang diberikan ... 21
3 Kandungan enzim Cu,Zn-SOD pada jaringan hati tikus percobaan ... 27
4 Rata-rata jumlah sel hati pada berbagai tingkatan kandungan enzim
Cu,Zn-SOD pada jaringan hati tikus pada terminasi hari ke-8, hari ke-15, dan hari
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Gambaran hati tikus ... 8
2 Bentuk infeksi EPEC pada epitel usus ... 10
3 Mekanisme pertahanan intestinal oleh probiotik ... 11
4 Prinsip teknik pewarnaan imunohistokimia ... 15
5 Diagram alur penelitian ... 19
6 Fotomikrograf jaringan hati tikus dengan pewarnaan imunohistokimia terhadap Cu,Zn-SOD yang menunjukkan perbedaan intensitas warna coklat yang terbentuk pada jaringan hati ... 29
7 Fotomikrograf jaringan hati tikus dengan pewarnaan imunohistokimia terhadap Cu,Zn-SOD pada terminasi hari ke-8 ... 31
8 Fotomikrograf jaringan hati dengan pewarnaan imunohistokimia terhadap Cu,Zn-SOD tikus pada terminasi hari ke-15 ... 36
9 Fotomikrograf jaringan hati dengan pewarnaan imunohistokimia terhadap Cu,Zn-SOD tikus pada terminasi hari ke-22 ... 38
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Tahapan Sampling dan Pemrosesan Jaringan Hati Tikus ... 48
2 Tahapan Pewarnaan Imunohistokimia untuk Analisis Kandungan Cu, Zn-SOD di Jaringan Hati Tikus ... 50
3 Uji statistik (Anova) dengan SPSS untuk jumlah inti sel hati tikus pada terminasi hari ke-8 dengan intensitas kandungan Cu,Zn-SOD positif kuat (+++) ... 52
4 Uji statistik (Anova) dengan SPSS untuk jumlah inti sel hati tikus pada terminasi hari ke-8 dengan intensitas kandungan Cu,Zn-SOD positif sedang (++) ... 53
5 Uji statistik (Anova) dengan SPSS untuk jumlah inti sel hati tikus pada terminasi hari ke-8 dengan intensitas kandungan Cu,Zn-SOD positif lemah(+)... 54
6 Uji statistik (Anova) dengan SPSS untuk jumlah inti sel hati tikus pada
terminasi hari ke-8 dengan intensitas kandungan Cu,Zn-SOD negatif (-) ... 55
7 Uji statistik (Anova) dengan SPSS untuk jumlah inti sel hati tikus pada terminasi hari ke-15 dengan intensitas kandungan Cu,Zn-SOD positif kuat (+++) ... 56
8 Uji statistik (Anova) dengan SPSS untuk jumlah inti sel hati tikus pada terminasi hari ke-15 dengan intensitas kandungan Cu,Zn-SOD positif sedang (++) ... 57
9 Uji statistik (Anova) dengan SPSS untuk jumlah inti sel hati tikus pada terminasi hari ke-15 dengan intensitas kandungan Cu,Zn-SOD positif lemah (+) ... 58
10 Uji statistik (Anova) dengan SPSS untuk jumlah inti sel hati tikus pada
terminasi hari ke-15 dengan intensitas kandungan Cu,Zn-SOD negatif (-) ... 59
11 Uji statistik (Anova) dengan SPSS untuk jumlah inti sel hati tikus pada terminasi hari ke-22 dengan intensitas kandungan Cu,Zn-SOD positif kuat (+++) ... 60
12 Uji statistik (Anova) dengan SPSS untuk jumlah inti sel hati tikus pada terminasi hari ke-22 dengan intensitas kandungan Cu,Zn-SOD positif sedang (++) ... 61
13 Uji statistik (Anova) dengan SPSS untuk jumlah inti sel hati tikus pada terminasi hari ke-22 dengan intensitas kandungan Cu,Zn-SOD positif lemah (+) ... 62
14 Uji statistik (Anova) dengan SPSS untuk jumlah inti sel hati tikus pada terminasi hari ke-22 dengan intensitas kandungan Cu,Zn-SOD negatif (-) ... 63
I. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Tingginya prevalensi penyakit diare terutama pada anak-anak terjadi hampir di seluruh negara, termasuk Indonesia. Data dari Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan (LITBANGKES) Departemen Kesehatan Republik Indonesia, menunjukkan bahwa secara umum kejadian diare di Indonesia rata-rata setiap tahun adalah sebesar 2.5% dari semua kelompok umur. Tingginya kejadian penyakit tersebut antara lain disebabkan oleh buruknya higiene makanan dan buruknya sanitasi lingkungan.
Paparan agen patogen di saluran pencernaan dapat menyebabkan berbagai jenis penyakit, salah satunya diare (Schiller dan Sellin 2006). Diare merupakan salah satu penyakit gastroenteritis. Diare juga merupakan salah satu penyakit menular berbasis lingkungan yang penting di Indonesia (LITBANGKES 2008). Salah satu penyebab utama diare pada anak-anak di Indonesia adalah enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) dengan prevalensi kejadiannya 55% dari jumlah anak penderita diare (Budiarti 1997).
Mikroflora saluran pencernaan mempunyai peran dalam kesehatan dan penyakit. Saluran pencernaan manusia ataupun hewan diperkirakan mengandung flora normal sampai 1012 bakteri per gram isi saluran pencernaan dan setidaknya terdiri atas 500 spesies yang sebagian besar merupakan bakteri asam laktat (Gobarch 2001).
Dewasa ini, bakteri asam laktat (BAL) telah banyak dimanfaatkan oleh industri pangan dalam menciptakan produk pangan fungsional untuk memelihara kesehatan saluran pencernaan manusia, misalnya sebagai probiotik. Probiotik adalah mikroorganisme hidup yang apabila diberikan pada jumlah yang tepat dapat bermanfaat bagi kesehatan saluran pencernaan (Reid et al. 2003). Probiotik telah banyak dimanfaatkan dalam penanggulangan berbagai penyakit infeksi saluran pencernaan di negara-negara maju, seperti menanggulangi diare pada anak-anak.
Arief et al. (2008) telah berhasil mengisolasi 10 bakteri asam laktat isolat lokal yang diambil dari daging sapi peranakan Ongol yang dijual di beberapa
pasar tradisional di daerah Bogor, Jawa Barat. Sebanyak 10 bakteri asam laktat ini telah diuji secara in vitro mempunyai sifat sebagai probiotik. Selanjutnya, hasil penelitian Astawan et al. (2009) telah menemukan dua bakteri terbaik di antara 10 bakteri asam laktat tersebut, yaitu Lactobacillus plantarum dan Lactobacillus
fermentum. Penemuan bakteri asam laktat isolat lokal sangat penting bagi
Indonesia untuk menghasilkan pangan fungsional dan pakan hewan yang sesuai dengan kondisi lingkungan Indonesia.
Penelitian lebih lanjut terhadap isolat lokal ini diperlukan untuk menguji potensi BAL ini sebagai antidiare pada kondisi usus halus yang dipapar enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) serta melihat efektivitas probiotik ini dalam meningkatkan kandungan enzim antioksidan intraseluler pada jaringan akibat terbentuknya radikal bebas sebagai konsekuensi terjadinya diare.
Kegagalan sistem pertahanan mukosa usus dalam memproduksi musin (sebagai pelumas, barier, dan menghasilkan senyawa antibakteri) dan membentuk mikrovili (yang mendorong musin dan bakteri keluar dari membran mukosa) dalam mencegah adhesi EPEC akan mengawali infeksi EPEC. Kegagalan mekanisme pertahanan tersebut menyebabkan perlekatan bakteri pada permukaan sel usus inang. Bakteri EPEC melekatkan diri pada mukosa usus halus dan membentuk koloni pada permukaan sel epitel usus yang terpapar, kemudian melakukan invasi menembus sel mukosa usus halus. Perlekatan kuat antara sel bakteri dan sel epitel usus inang akan menyebabkan kerusakan pada aktin dan mikrovili sel-sel mukosa inang, sehingga kemampuan mukosa untuk
mengabsorbsi air hilang. Hal tersebut menyebabkan terjadinya diare (Khutton
et al. 1989).
Lesio yang terjadi pada sel epitel usus yang terinfeksi mengakibatkan kerusakan struktur sitoskeletal sel dan membentuk formasi yang dikenal dengan
pedestal actin formation di bawah perlekatan EPEC pada epitel usus (Campellone
2003; Smith et al. 2010). Sel epitel yang rusak dan EPEC akan difagosit oleh makrofag (Tizard 2000). Makrofag merupakan salah satu sel radang yang berperan dalam proses fagositosis di jaringan (Nishikawa et al. 2000; Forman dan Martine 2001). Makrofag menghasilkan dan melepaskan molekul mikrobisidal berupa radikal bebas dalam peristiwa fagositosis (Roitt 2002). Radikal bebas yang
3
terbentuk ini terakumulasi dan saat antioksidan tidak mampu menetralisir, maka terjadilah kondisi stres oksidatif (Halliwell dan Gutteridge 1999).
Stres oksidatif adalah suatu kondisi terjadinya ketidakseimbangan antara radikal bebas yang terdapat dalam tubuh, dimana keberadaan radikal-radikal bebas dalam tubuh melampaui kapasitas antioksidan tubuh. Radikal bebas (free
radical) didefinisikan sebagai molekul yang mempunyai satu atau lebih elektron
tanpa pasangan pada orbit terluarnya. Antioksidan merupakan suatu zat yang dapat menetralisir radikal bebas. Antioksidan dibedakan atas antioksidan eksogen yang diperoleh dari bahan makanan seperti askorbat, tokoferol, karoten, dan lain-lain serta antioksidan endogen yang terdiri dari enzim-enzim yang disintesis tubuh seperti superoksida dismutase (SOD), katalase, dan glutation peroksidase (Devasagayam et al. 2004). Superoksida dismutase (SOD) merupakan enzim antioksidan endogen yang menjadi lini pertahanan pertama antioksidan tubuh dalam melindungi sel dari radikal bebas (Fridovich 1995).
Oleh karena itu, menjaga keseimbangan mikroflora usus sangat penting. Mengonsumsi probiotik melalui produk-produk pangan merupakan salah satu cara ideal menjaga keseimbangan mikroflora usus, dan lebih baik lagi jika mikroba probiotik tersebut berasal dari wilayah lokal atau bersifat indigenus yang lebih adaptif dengan lingkungan. Saat keseimbangan mikroflora usus terganggu, keseimbangan antara radikal bebas dan antioksidan juga akan terganggu dan dampaknya adalah terjadi stress oksidatif.
Sejauh ini belum banyak laporan secara in vivo tentang efek probiotik terhadap status antioksidan tubuh. Penelitian ini difokuskan pada pengamatan kandungan enzim antioksidan superoksida dismutase (Cu,Zn-SOD) pada jaringan hati tikus percobaan yang diberi perlakuan probiotik Lactobacillus plantarum dan
Lactobacillus fermentum serta intervensi enteropathogenic Escherichia coli
(EPEC). Organ hati dipilih sebagai tempat diamatinya perubahan kandungan Cu,Zn-SOD karena kandungan enzim ini di hati lebih tinggi 10 kali lipat per gram
berat basah dibandingkan keberadaannya pada organ lain di dalam tubuh (Slot
1.2 Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan menganalisa efek pemberian probiotik bakteri asam laktat (Lactobacillus plantarum dan Lactobacillus fermentum) pada profil imunohistokimia antioksidan copper, zinc-superoksida dismutase (Cu,Zn-SOD) pada jaringan hati tikus yang dipapar bakteri enteropathogenic E. coli (EPEC).
II. TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Hewan Percobaan
Hewan percobaan atau hewan laboratorium memainkan peranan penting dalam perkembangan dan kemajuan ilmu biomedis. Hewan percobaan adalah hewan yang sengaja dipelihara dan diternakkan untuk dipakai sebagai hewan model guna mempelajari dan mengembangkan berbagai macam bidang ilmu dalam skala penelitian atau pengamatan laboratorik. Penggunaan hewan percobaan untuk penelitian banyak dilakukan di bidang fisiologi, farmakologi, biokimia, patologi, komperatif zoologi, dan ekologi dalam arti luas. Di bidang ilmu kedokteran selain untuk penelitian, hewan percobaan juga sering digunakan untuk keperluan diagnostik (Malole dan Pramono 1989). Jenis-jenis hewan percobaan meliputi hewan percobaan kecil, misalnya: mencit, tikus, marmut, dan kelinci; serta hewan percobaan lain, seperti: ayam, itik, babi, satwa primata, domba, dan kambing (Smith dan Mangkoewidjojo 1988).
Pemilihan hewan percobaan untuk penelitian mempertimbangkan beberapa faktor, terutama tujuan dari penelitian itu sendiri. Misalnya, kelinci merupakan hewan percobaan yang cocok dan paling sering digunakan untuk penelitian tentang hiperkolesterolemia, karena kelinci memiliki cadangan lemak tubuh yang banyak (Sirois 2005) dan peka terhadap kolesterol (Muliasari 2009). Berbeda dengan anjing, kucing, dan tikus yang resisten terhadap pakan kolesterol.
Satwa primata merupakan hewan yang sangat cocok digunakan dalam penelitian ilmiah yang ada kaitannya dengan manusia, karena satwa primata erat hubungannya dengan manusia misalnya fisiologi dan patologinya. Tetapi banyak faktor yang harus dipertimbangkan secara matang sebelum memutuskan hewan percobaan ini digunakan dalam penelitian, seperti sulitnya pengadaan hewan (satwa langka), biaya yang tinggi dan pemeliharaan yang rumit, pertimbangan kemampuan dan keselamatan pekerja dalam hal meng-handling hewan percobaan, dan resiko tertularnya pekerja laboratorium dari penyakit menular karena satwa primata dapat membawa organisme penyebab penyakit menular, terlebih virus-virus yang tidak begitu patogenik terhadap hewan tersebut tetapi sangat berbahaya terhadap manusia (Sirois 2005).
Penggunaan hewan percobaan untuk pengujian secara in vivo biasanya menunjukkan hasil deviasi yang besar dibandingkan dengan pengujian in vitro, karena adanya variasi individu. Supaya variasi tersebut minimal, hewan-hewan yang mempunyai spesies yang sama atau strain yang sama, usia yang sama, dan jenis kelamin yang sama, dipelihara pada kondisi yang sama pula (Malole dan Pramono 1989).
Hewan percobaan yang umum digunakan dalam penelitian ilmiah adalah tikus. Tikus merupakan spesies pertama mamalia yang didomestikasi untuk tujuan ilmiah karena memiliki daya adaptasi yang baik. Tikus yang diproduksi sebagai hewan percobaan dan hewan peliharaan adalah tikus putih (Rattus norvegicus).
Rattus norvegicus merupakan salah satu hewan percobaan yang paling sering
digunakan dalam penelitian, karena memiliki karakter fungsional yang baik sebagai model bagi hewan mamalia (Hedrich 2000).
Rattus norvegicus memiliki ciri-ciri panjang tubuh total 440 mm, panjang
ekor 205 mm, bobot badan 140-500 g dengan rataan 400 g (Myers dan Armitage 2004). Tikus disapih hingga usia 21 hari dan memasuki masa dewasa pada usia 40-60 hari (Smith dan Mangkoewidjojo 1988). Rattus norvegicus memiliki beberapa keunggulan, antara lain: penanganan dan pemeliharaan yang mudah karena tubuhnya kecil, kemampuan reproduksi yang tinggi dengan masa kebuntingan yang singkat, sehat, bersih, dan cocok untuk berbagai macam penelitian (Malole dan Pramono 1989). Penelitian yang telah pernah dilakukan menggunakan Rattus norvegicus adalah penelitian tentang hipertensi, diabetes insipidus, katarak, obesitas, diabetes melitus, dan lain-lain (Sirois 2005).
Sistem klasifikasi tikus Rattus norvegicus menurut Myers dan Armitage (2004) adalah sebagai berikut:
Kingdom : Animalia Filum : Chordata Kelas : Mammalia Ordo : Rodentia Famili : Muridae Genus : Rattus
7
Terdapat tiga galur atau varietas tikus Rattus norvegicus yang biasa digunakan sebagai hewan percobaan yaitu galur Sprague Dawley yang memiliki kepala kecil, berwarna albino putih, dan ekornya lebih panjang dari badannya. Galur Wistar, memiliki kepala besar, berwarna putih, dan ekor yang lebih pendek. Galur Long Evans, lebih kecil dari tikus putih dan memiliki warna hitam pada kepala hingga tubuh bagian depan serta warna putih pada tubuh bagian belakang (Malole dan Pramono 1989).
Penelitian ini juga menggunakan tikus sebagai hewan percobaan. Tikus yang digunakan dalam penelitian ini adalah spesies Rattus norvegicus (Albino
Norway Rats) galur Sprague Dawley. Rattus norvegicus dipakai karena tergolong
omnivora seperti halnya manusia, dan kebutuhan asam amino esensialnya menyamai kebutuhan manusia, khususnya anak-anak. Tikus putih dalam keadaan sehat dapat hidup 2-3 tahun. Satu minggu umur tikus putih ekuivalen dengan 30 minggu umur manusia, sehingga pengaruh zat gizi terhadap pertumbuhan dapat dipelajari dengan cepat pada tikus putih (Nio 1985).
Ada dua sifat utama yang membedakan tikus dengan hewan percobaan lain, yaitu tikus tidak dapat muntah karena struktur anatomi yang tidak lazim pada tempat bermuara esofagus ke dalam lambung sehingga mempermudah proses pencekokan perlakuan menggunakan sonde lambung, dan tidak mempunyai kantong empedu (Smith dan Mangkoewidjojo 1988). Selain itu, tikus hanya mempunyai kelenjar keringat di telapak kaki. Ekor tikus menjadi bagian badan yang paling penting untuk mengurangi panas tubuh. Mekanisme perlindungan lain adalah tikus akan mengeluarkan banyak ludah dan menutupi bulunya dengan ludah tersebut (Sirois 2005).
2.2 Hati
Hati merupakan kelenjar sekaligus organ parenkimatis terbesar di dalam tubuh. Hati tikus terdiri atas 4 lobus (Gambar 1), yaitu lobus medial yang terbagi menjadi sublobus kanan dan kiri oleh bifurcatio, lobus lateral kanan yang terbagi menjadi bagian anterior dan posterior, lobus kiri (lobus yang paling besar), dan lobus kaudatus yang terdiri atas dua sublobus seperti daun di dorsal dan ventral esofagus pada bagian kurvatura minor lambung (Suckow et al. 2006). Unit
fungsional dasar hati adalah lobulus hati, yang berbentuk silindris dengan panjang beberapa milimeter dan berdiameter 0.8 sampai 2 milimeter. Lobulus hati terbentuk mengelilingi vena centralis yang mengalir ke vena hepatica dan kemudian ke vena cava (Guyton dan Hall 1997). Hati mempunyai beberapa komponen sel, yaitu hepatosit (sel parenkim), sel sinusoidal (endotel, sel Kupffer, dan sel lemak), sel haematopoesis, sel saraf, saluran limfatik, dan pembuluh darah (Maronpot 1999).
Gambar 1 Gambaran hati tikus yang terdiri dari empat lobus; LL = lobus kiri; ML = lobus medial; RL = lobus kanan; CL = lobus kaudatus.
Sumber : http://www.fibrogenesis.com/content/1/1/6/figure/F2
Komponen struktural utama dari hati adalah sel hati atau hepatosit. Secara histologis, bentuk hepatosit serupa pada setiap spesies yaitu berbentuk polihedral dan memiliki satu atau dua inti. Hepatosit bersifat metabolik aktif dan memiliki banyak mitokondria, ribosom, rough endoplasmic reticulum, dan badan golgi. Peroksisom, smooth endoplasmic reticulum, dan lisosom juga terdapat pada sitoplasma. Hepatosit berderet secara radier dalam lobulus hati. Mereka membentuk lapisan setebal 1 atau 2 sel. Lempeng ini mengarah dari tepian lobulus ke pusat dan beranastomosis secara bebas. Antara lobulus ini dipisahkan oleh sinusoid hati (Samuelson 2007).
Sinusoid hati merupakan kapiler yang menghubungkan pembuluh darah interlobularis, arteri hepatica, dan vena porta ke vena centralis. Sinusoid terdiri dari 2 tipe sel, yaitu sel endotel (sinusoidal endothelial cells) dan sel Kupffer yang merupakan makrofag jaringan yang dapat memfagosit bakteri dan benda asing di aliran darah hati. Di antara sel endotel dan sel hati terdapat ruang sempit yang
LL
ML
RL
9
disebut ruang Disse yang menghubungkan pembuluh limfe di dalam septum interlobularis. Sel Kupffer mempunyai complement dan reseptor Fc yang dapat menghilangkan benda asing seperti sel debris dan sisa hasil perombakan sel darah merah. Selain sel endotel dan sel Kupffer juga terdapat komponen yang disebut Sel Ito (Ito Cells). Sel tersebut menyimpan banyak retinoid hati dalam droplet lemak yang banyak terlibat dalam dinamika retinol dalam tubuh (Samuelson 2007).
Fungsi dasar hati dapat dibagi menjadi: (1) fungsi detoksifikasi, (2) fungsi metabolisme yang berhubungan dengan sebagian besar sistem metabolisme tubuh yakni metabolisme karbohidrat, lemak, dan protein, (3) fungsi sekresi dan ekskresi yang berperan membentuk empedu dan mengalirkan empedu ke saluran pencernaan (Guyton dan Hall 1997).
Aktivitas SOD tertinggi terdapat dalam hati, kemudian dalam kelenjar adrenal, ginjal, darah, limpa, pankreas, otak, paru-paru, lambung, usus, ovarium, timus, dan lemak (Chow 1988). Jurczuk et al. (2004) menyebutkan bahwa sistem pertahanan antioksidan di hati lebih efektif dibandingkan dengan organ lain. Hati berperan sebagai komponen utama pertahanan tubuh inang serta menginduksi toleransi terhadap antigen (Kleinman al. 2008).
2.3 Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC)
Escherichia coli merupakan bakteri Gram negatif yang berbentuk batang,
tidak berspora, dan bersifat fakultatif anaerobik. E. coli merupakan bakteri yang normal terdapat di dalam usus besar manusia dan hewan berdarah panas dan dikenal sebagai bakteri yang tidak berbahaya, sehingga sering ditemukan pada feses.
Bakteri enteropahtogenic E. coli (EPEC) didefinisikan sebagai bakteri yang
memiliki karakteristik berikut: (1) kemampuan menimbulkan diare, (2) kemampuan memproduksi sebuah bentukan histologi pada epitel usus yang
dikenal sebagai lesio attaching and effacing (A/E lesion), dan (3) ketidakmampuan memproduksi Shiga-like toxin (verocytotoxin). Karakteristik
yang kedua merupakan pembeda antara EPEC dengan strain E. coli penyebab diare lainnya, yang meliputi enterotoxigenic E. coli (ETEC), enteroaggregative
E. coli (EAEC), dan enteroinvasive E. coli (EIEC). Karakteristik yang ketiga
merupakan pembeda EPEC dengan E. coli penghasil Shiga-like toxin (STEC dan VTEC) dan enterohemorrhagic E. coli (EHEC) (Kaper et al. 2004).
Proses patogenitas EPEC diawali dengan perlekatan bakteri pada sel epitel usus inang dan membentuk lesi attaching and effacing A/E (Gambar 2). Perlekatan awal EPEC pada sel epitel usus inang diperantarai oleh bundle-forming
pilus (BFP) diikuti sekresi faktor virulen yang dikenal dengan “molecular syringe” berupa sistem sekresi tipe III. Salah satu faktor yang disuntikkan adalah
Tir (translicated intimin receptor) yang berfungsi sebagai reseptor membran plasma untuk perlekatan EPEC. EPEC kemudian mengikat Tir melalui protein membran luar, intimin. Sinyal transduksi terjadi dalam sel inang, termasuk aktivasi protein kinase C (PKC), inositol triphosphate (IP3), dan pelepasan Ca2+. Beberapa protein sitoskeletal termasuk aktin, menjadi tempat melekatnya EPEC. Pada akhirnya, terjadi penyusunan kembali sitoskeletal setelah Tir-intimin berikatan, dan menghasilkan formasi pedestal-like structure (Lu dan Walker 2001).
Gambar 2 Bentuk infeksi EPEC pada epitel usus. Sumber : Lu dan Walker (2001)
2.4 Bakteri Asam Laktat sebagai Probiotik
Probiotik adalah mikroorganisme hidup yang biasanya ditambahkan ke dalam pangan dalam jumlah yang tepat sehingga dapat bermanfaat bagi kesehatan saluran pencernaan (Zubillaga et al. 2001). Naidu (1999) juga menyebutkan bahwa mikroba probiotik mempunyai hubungan dekat dengan kesehatan saluran pencernaan inang karena berperan mencegah kolonisasi dan proliferasi mikroba
11
patogen di usus. Definisi FAO/WHO (2002) tentang probiotik adalah mikroorganisme hidup yang saat dikonsumsi dengan jumlah yang cukup akan tetap hidup sampai mencapai saluran gastrointenstinal (GI tract) serta memberikan manfaat kesehatan.
Mekanisme pertahanan intestinal oleh probiotik sebagaimana dikutip dalam Lu dan Walker (2001) adalah meningkatkan pertahanan inang dengan menduduki usus, sehingga: (1) mencegah kolonisasi patogen di usus, (2) memproduksi senyawa antimikroba, volatile fatty acids, dan modifikasi asam empedu yang pada gilirannya menciptakan lingkungan lumen yang kurang baik untuk pertumbuhan patogen, dan (3) merangsang respon sel imun dan mengaktivasi respon kekebalan dan inflamasi. Penyakit pada usus akan terjadi apabila ada faktor yang mengganggu integritas pertahanan epitel usus.
Gambar 3 Mekanisme pertahanan intestinal oleh probiotik. Sumber : Lu dan Walker (2001)
Beberapa dekade terakhir, probiotik sudah dikembangkan dan digunakan sebagai terapi alternatif untuk penyakit diare. Bakteri probiotik yang umum digunakan untuk kepentingan ini adalah bakteri asam laktat (BAL), namun sebenarnya mikroba probiotik dapat berupa bakteri Gram positif, bakteri Gram negatif, khamir, dan fungi (Rolfe 2000). Bakteri asam laktat yang umum digunakan dan telah terbukti mempunyai efek probiotik pada manusia berasal dari
genus Lactobacillus dan Bifidobacterium, antara lain L. achidophilus, L. casei,
L. fermentum, L. plantarum, L. reuteri, B. infantis, B. breve, B. animalis, B. adolescentis, dan B. longum. Bakteri–bakteri tersebut termasuk bakteri Gram
positif, fakultatif yang normal terdapat dalam usus besar manusia dan sebagian besar merupakan mikroflora anaerobik (Liong 2007). Efek protektif probiotik terhadap infeksi usus yang diperlihatkan pada hewan model adalah mekanisme memproduksi asam, zat antimikroba, hidrogen peroksida, kompetisi nutrisi atau reseptor adhesi/penempelan, tindakan antitoksin, dan stimulasi sistem kekebalan tubuh (Marteau et al. 2001).
Kullisaar et al. (2003) telah membuktikan bahwa beberapa strains bakteri asam laktat tersebut memiliki aktivitas antioksidan dan mampu menurunkan akumulasi reactive oxygen spesies (ROS)/radikal bebas pada inang, sehingga berpotensi menurunkan stess oksidatif. Selain itu, Kullisaar et al. (2002)
melaporkan pula bahwa mengkonsumsi susu fermentasi yang mengandung
L. fermentum ME-3 menunjukkan efek antioksidatif dan antiatherogenik.
Bakteri asam laktat (BAL) merupakan bakteri yang telah dikenal sebagai probiotik. BAL adalah bakteri Gram positif yang bersifat mikroaerofilik, tidak berspora, dan mampu memfermentasi karbohidrat menjadi asam laktat. Bakteri asam laktat termasuk mikroorganisme yang aman jika ditambahkan dalam pangan karena sifatnya tidak toksik dan tidak menghasilkan toksin, maka disebut food
grade microorganism atau dikenal sebagai mikroorganisme yang Generally Recognized As Safe (GRAS) yaitu mikroorganisme yang tidak beresiko terhadap
kesehatan, bahkan beberapa jenis bakteri tersebut berguna bagi kesehatan.
Bakteri probiotik umumnya dimasukkan ke dalam pangan fermentasi berbasis susu. Untuk dapat dikatakan sebagai probiotik, maka BAL harus memenuhi syarat antara lain: (1) tahan terhadap asam lambung (pH 1.5-5.0), (2) stabil terhadap asam empedu dan mampu bertahan hidup selama berada dalam usus kecil, (3) mampu bertahan (survive) dan berkolonisasi di saluran pencernaan, (4) mampu mempertahankan suatu keseimbangan mikroflora usus melalui kompetisi dan inhibisi terhadap kuman-kuman patogen, seperti memproduksi senyawa antimikroba seperti asam laktat, hidrogen peroksida, dan bakteriosin,
13
(5) tidak patogen dan tidak toksik, (6) stabil selama penyiapan sampai dengan penggunaan agar dapat disediakan massal dalam industri pangan (Lisal 2005).
2.5 Radikal Bebas dan Antioksidan Cu,Zn-SOD
Radikal bebas (free radical), oksidan (oxidant) yang berupa reactive
nitrogen species (RNS) atau reactive oxygen species (ROS) merupakan molekul
yang mempunyai satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan (unpaired
electron) pada orbital luarnya. Elektron yang tidak berpasangan ini akan menjadi
sangat reaktif dalam upaya memperoleh pasangan dengan cara menarik elektron dari biomakromolekul disekitarnya, seperti protein, asam nukleat, dan asam deoksiribonukleat (DNA). Oksidasi dan degradasi makromolekul yang merupakan komponen sel akan mengakibatkan kerusakan pada sel tersebut (Halliwell dan Gutteridge 1999).
Pada kondisi fisiologis normal, sel memproduksi radikal bebas sebagai konsekuensi logis terhadap reaksi biokimia dalam kehidupan aerobik. Senyawa radikal bebas yang terlibat dalam berbagai proses patologik berasal dari berbagai sumber di antaranya sebagai reaksi reduksi oksidasi (redoks) biokimia yang melibatkan senyawa oksigen. Reaksi ini terjadi pada sebagian besar proses metabolisme tubuh normal, tetapi oleh suatu sebab senyawa tersebut terdapat dalam jumlah yang berlebihan. Senyawa yang dihasilkan dari reaksi ini disebut senyawa oksigen reaktif yang sebagian berbentuk radikal seperti hidroksil dan superoksida serta sebagian lagi berbentuk non radikal seperti asam hipokrit, singlet oksigen, dan hidrogen peroksida (Jhonson dan Giulivi 2005).
Awal terbentuknya radikal bebas adalah dari proses reduksi molekul oksigen dalam rangkaian transpor elektron dalam mitokondria atau dalam proses-proses lain yang terjadi secara acak dari berbagai proses-proses kimiawi dalam tubuh yang melibatkan senyawa organik maupun inorganik. Radikal bebas yang terbentuk mempunyai masa paruh yang sangat pendek, tetapi tetap mempunyai potensi besar yang dapat merusak sel. Bila reaksi terus berlanjut maka terjadi suatu reaksi berantai (chain reaction) sampai radikal bebas itu dihilangkan oleh sistem antioksidan tubuh. Naiknya level radikal bebas atau kurangnya antioksidan tubuh menyebabkan stress oksidatif. Telah dilaporkan oleh Wresdiyati et al.
(2002) dan Wresdiyati et al. (2003), bahwa keadaan stress oksidatif menimbulkan penurunan kandungan antioksidan copper, zinc-superoksida dismutase (Cu,Zn-SOD) pada hati dan ginjal tikus.
Antioksidan adalah senyawa atau bahan bioaktif yang berfungsi mencegah, menurunkan reaksi oksidasi, memutus, menghambat, menghentikan, dan menstabilkan radikal bebas (Margaill 2005). Enzim antioksidan intraseluler terdiri atas enzim katalase, glutation peroksidase, dan superoksida dismutase (SOD).
Superoksida dismutase terdiri atas 3 isoform, yakni Cu, Zn-SOD, Mn-SOD, dan Fe-SOD (Valko et al. 2007).
Superoksida dismutase pertama kali ditemukan oleh Mann dan Keillis pada tahun 1938 pada saat mengisolasi protein yang berwarna biru dari eritrosit sapi. Protein tersebut selanjutnya diketahui mengandung Cu. Pada tahun 1968, McCord dan Fridovich berhasil menemukan adanya aktivitas katalitik dismutase radikal superoksida pada protein tersebut dan selanjutnya protein yang berhasil diidentifikasi aktivitas katalitiknya ini dinamai superoksida dismutase (SOD). Selanjutnya pada tahun 1972, Fridovich juga menemukan Cu,Zn-SOD pada berbagai tingkatan organisme, seperti yeast atau ragi, Neurospora crassa, bayam, benih gandum, hati ikan, dan hati ayam. Oleh banyak peneliti selanjutnya protein ini ditetapkan sebagai antioksidan enzimatis endogen (Fridovich 1995).
Antioksidan superoksida dismutase bekerja mengkatalisis dismutasi anion superoksida (O2-) yang merupakan oksigen reaktif menjadi hidrogen peroksida (H2O2) dan oksigen (O2). Dalam tubuh hewan mamalia, SOD mempunyai berbagai macam jenis dan lokasi, antara lain Mn-SOD yang terdapat dalam mitokondria, SOD ekstraseluler, dan Cu,Zn-SOD terdapat pada sitosol dan inti sel (Yon et al. 2008).
Enzim antioksidan Cu,Zn-SOD merupakan protein enzimatis yang memiliki berat molekul 32.000 Dalton dan tersusun atas dua subunit identik yang mengandung sekelompok logam aktif, yaitu atom tembaga (Cu) dan seng (Zn). Atom Cu pada Cu,Zn-SOD berperan dalam aktivitas enzimatis, sedangkan Zn berfungsi sebagai stabilisator (Fridovich 1995). Antioksidan Cu,Zn-SOD merupakan salah satu SOD paling stabil karena setiap subunit tergabung oleh ikatan non-kovalen dan terangkai oleh ikatan disulfida. Enzim ini mempunyai
15
peranan penting dalam pertahanan tubuh melawan radikal-radikal bebas anion superoksida atau yang merupakan produk metabolisme parsial oksigen (Wresdiyati dan Astawan 2004).
2.6 Imunohistokimia
Imunohistokimia adalah metode pewarnaan jaringan yang merupakan gabungan dari tiga cabang ilmu pengetahuan, yaitu: (1) imunologi, karena prinsip pewarnaan ini adalah ikatan antigen dan antibodi, (2) histologi, menyangkut penggunaan preparat dengan ketebalan mikro yang pengamatannya dengan mikroskop cahaya, dan (3) kimia, karena pewarnaan yang dilakukan berdasarkan reaksi kimia (Ramos-Vara 2005).
Teknik imunohistokimia yang ditemukan AH Coons pada tahun 1941 adalah teknik identifikasi unsur pokok jaringan secara in situ melalui reaksi antigen-antibodi spesifik dan diberi label agar terlihat dengan mikroskop. Ikatan antigen-antibodi sangat spesifik ibarat ikatan kunci dan gembok (lock and key). Teknik ini menggunakan dua antibodi, yaitu antibodi primer dan antibodi sekunder (Ramos-Vara 2005). Antibodi primer yang digunakan pada penelitian ini adalah antibodi monoklonal terhadap Cu,Zn-SOD dan antibodi sekunder (anti-antibodi primer) yang digunakan adalah (anti-antibodi yang sudah terkonjugasi dengan peroksidase (Dako envision peroxidase system atau DEPS). Antibodi sekunder yang digunakan dapat bereaksi beberapa jenis antibodi monoklonal yang dibuat dari beberapa jenis hewan.
Prinsip pewarnaan imunohistokimia dapat dilihat pada Gambar 4.
Gambar 4 Prinsip teknik pewarnaan imunohistokimia. Jaringan hati Antibodi sekunder (K1491) Antibodi primer SIGMA S2147 Antigen (Cu,Zn-SOD) Peroksidase
Enzim antioksidan Cu,Zn-SOD di jaringan hati dikenali sebagai antigen oleh antibodi primer (antibodi monoklonal terhadap Cu,Zn-SOD). Antigen akan diikat oleh antibodi primer. Selanjutnya, antibodi primer akan berikatan dengan antibodi sekunder yang telah dikonjugasikan dengan peroksidase (DEPS). sehingga keberadaan peroksidase ini melambangkan adanya kompleks antigen-antibodi. Peroksidase berfungsi mengkatalisis reaksi antara kromogen (diamino
benzidine atau DAB ) dan hidrogen peroksida (H2O2), sehingga terbentuk endapan berwarna coklat yang menunjukkan keberadaan SOD. Semakin tua intensitas warna coklatnya berarti semakin banyak kandungan SOD-nya.
2.7 Penelitian Pendahuluan
Arief et al. (2008) telah melakukan isolasi bakteri asam laktat (BAL) golongan Lactobacillus, Lactococcus, dan Streptococcus dari daging sapi bangsa peranakan Ongol yang dijual di berbagai pasar tradisional di daerah Bogor. Bakteri asam laktat tersebut selanjutnya diuji kemampuannya bertahan pada kondisi sesuai dengan kondisi saluran pencernaan manusia, antara lain pH, garam empedu, serta aktivitas antimikrobanya terhadap bakteri patogen.
Hasil penelitian pendahuluan tersebut menunjukkan bahwa terdapat 10 bakteri asam laktat isolat indigenus yang mempunyai kemampuan bertahan pada pH asam lambung yaitu pH 2 dan pH usus 7.2, serta pada kondisi garam empedu 0.5% sesuai dengan kondisi saluran pencernaan. Kesepuluh BAL tersebut adalah dari spesies Lactobacillus spp., Lactococcus spp., dan Streptococcus spp. BAL tersebut memiliki kemampuan bakterisidal terhadap mikroba patogen karena mampu menghasilkan senyawa bioaktif asam laktat, asam asetat, serta senyawa bakteriosin. Selain itu, bakteri asam laktat tersebut juga mempunyai kemampuan penghambat yang baik terhadap tiga jenis bakteri patogen, yaitu enterotoxigenic
E. coli (ETEC), Salmonella Thypimurium, dan Staphylococcus aureus. Mengacu
pada kriteria probiotik yang dikeluarkan oleh FAO/WHO (2002), kesepuluh isolat bakteri asam laktat ini layak dikatakan sebagai probiotik.
Sifat fungsional lainnya telah diteliti oleh Astawan et al. (2009) yaitu mengenai kemampuan bakterisidal dari 10 isolat BAL terhadap bakteri
17
yang mempunyai kemampuan terbaik sebagai probiotik, yaitu Lactobacillus
plantarum dan Lactobacillus fermentum. Kedua bakteri asam laktat inilah yang
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada bulan Juli-Agustus 2009 (sampling sampai dengan embedding), Februari 2010 (sectioning), dan bulan Juli 2010 (pewarnaan), bertempat di SEAFAST CENTRE IPB dan Laboratorium Histologi Departemen Anatomi Fisiologi dan Farmakologi Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor.
3.2 Alat dan Bahan Penelitian
Alat yang digunakan terdiri atas seperangkat alat bedah (gunting, pinset, alas bedah), pisau silet, gelas piala, Erlenmeyer, botol sampel, kapas, kertas tissue, benang, aluminium foil, tissue basket, exhause fan, pipet tetes, pipet mohr, mikropipet, gelas ukur, cup untuk embedding, gelas objek, cover glass, inkubator,
waterbath, mikrotom putar (rotatory microtom), tabung Eppendorf, kotak
preparat, pensil, dan kamera.
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah tikus putih Albino
Norway Rats (Rattus norvegicus) galur Sprague Dawley umur 5-6 minggu
sebanyak 90 ekor berjenis kelamin jantan dengan berat badan berkisar antara 140-240 g, bakteri asam laktat (BAL) indigenus isolat lokal yaitu Lactobacillus
plantarum dan Lactobacillus fermentum, kultur bakteri enteropathogenic E. coli
(EPEC), ransum tikus percobaan, (kasein, minyak jagung, mineral mix,
carboximethylcellulose, dan maizena), eter, NaCl fisiologis 0.9%, larutan fiksatif
Bouin (asam pikrat jenuh, formalin, dan asam asetat glasial dengan perbandingan 15:5:1), alkohol 70%, 80%, 90%, 95%, dan 100%, xylol, parafin, akuades, pewarna hematoksilin, entelan, neophren in toluene 2%, phosphate buffered
saline (PBS), metanol, H2O2, serum normal, antibodi primer/monoklonal Cu,Zn-SOD (SIGMA S2147), antibodi sekunder Dako envision peroksidase system (K1491), larutan kromogen diamino benzidine (DAB), air bebas ion (MilliQ), kertas film, dan label.
19
Alur penelitian yang dilakukan dapat dilihat pada skema dibawah ini.
Gambar 5 Diagram alur penelitian.
3.3 Tahapan Perlakuan 3.3.1 Hewan Percobaan
Hewan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah 90 ekor tikus putih Albino Norway Rats (Rattus norvegicus) galur Sprague Dawley yang berumur 5-6 minggu dengan berat badan berkisar 140-240 g dan berjenis kelamin jantan hasil perkembangbiakkan dari Badan POM RI.
Hari Terminasi H0 H8 H15 H22 Kelompok D,E,F : cekok EPEC T1 T2 T3
Analisis kandungan enzim antioksidan intraseluler (SOD)
pada hati
Diketahui satu BAL probiotik terbaik dalam meningkatkan kandungan enzim antioksidan
SOD pada hati tikus
Kelompok B,C,D,E: cekok BAL
Pengujian probiotik sebagai antioksidatif secara in vivo dengan membentuk kelompok tikus percobaan sebagai berikut:
A. Kontrol negatif (ransum standar) B. BAL 1 (Lactobacillus plantarum) C. BAL 1 (Lactobacillus fermentum) D. BAL 2 (Lactobacillus plantarum) + EPEC E. BAL 2 (Lactobacillus fermentum) + EPEC F. Kontrol positif (EPEC)
3.3.2 Kandang dan Perlengkapan
Kandang hewan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah kandang yang berukuran 17.5 x 23.75 x 17.5 cm dan berjumlah sesuai dengan jumlah tikus yang digunakan. Kandang tersebut terbuat dari stainless steel. Kandang tikus berlokasi pada tempat atau ruangan yang bebas dari suara ribut dan terjaga dari asap industri dan polutan lainnya. Ruangan tempat kandang tikus berada mudah dibersihkan dan disanitasi dengan suhu optimum ruangan untuk tikus adalah 22-24 °C, kelembapan udara 50-60%, dan ventilasi yang cukup, namun tidak ada jendela yang terbuka.
3.3.3 Ransum
Komposisi ransum basal disusun berdasarkan standar AOAC (Association
of Official Agricultural Chemists) yaitu mengandung karbohidrat, protein, lemak,
mineral, vitamin, dan air. Semua kelompok tikus percobaan diberi ransum standar.
Tabel 1 Komposisi ransum standar tikus
Sumber : Muchtadi et al. (1992)
3.3.4 Perlakuan terhadap Hewan Percobaan
Sebanyak 90 ekor tikus percobaan dibagi dalam 6 kelompok perlakuan. Setiap kelompok perlakuan terdiri dari 15 ekor tikus yang akan diterminasi pada 3 waktu yang berbeda (hari ke-8, 15, dan 22) masing-masing 5 ekor tikus. Masing-masing kelompok diberi perlakuan seperti pada Tabel 2 dan waktu terminasi dapat dilihat pada Gambar 5.
Komponen Sumber Jumlah Perhitungan
Protein Protein kasein 10% = . ×
%
Lemak Minyak jagung 8% 8 − × %
Mineral Campuran mineral 5% 5 − × %
Vitamin Campuran vitamin 1% 1 %
Serat Carboxymethylcellulose 1% 1 − × %
Air Air 5% 5 − ×%
21
Tabel 2 Kelompok tikus percobaan sesuai perlakuan yang diberikan
Kelompok
Tikus Perlakuan
A Tikus yang diberi ransum standar dan dicekok akuades mulai hari ke-1 sampai hari ke- 21 (kontrol negatif)
B Tikus yang diberi ransum standar dan dicekok BAL 1 (L. plantarum) mulai hari ke-1 sampai hari ke-21
C Tikus yang diberi ransum standar dan dicekok BAL 2 (L. fermentum) mulai hari ke-1 sampai hari ke-21
D Tikus yang diberi ransum standar dan dicekok BAL 1 (L. plantarum) mulai hari ke-1 sampai hari ke-21 serta dicekok
EPEC pada hari-8 sampai hari ke-14
E Tikus yang diberi ransum standar dan dicekok BAL 2 (L. fermentum) mulai hari ke-1 sampai hari ke-21 serta dicekok
EPEC pada hari-8 sampai hari ke-14
F Tikus yang diberi ransum standar dan dicekok akuades mulai hari ke-1 sampai hari ke- 21 serta cekok EPEC pada hari ke-8 sampai hari ke-14 (kontrol positif)
Jumlah BAL yang diberikan sesuai petunjuk Zoumpopolou et al. (2008). Dua buah kultur dari bakteri asam laktat terpilih (L. plantarum dan L. fermentum) berumur satu hari pada media de Man Rogosa Sharpe Broth (MRS Broth) dengan populasi 108 cfu/ml/hari diberikan sesuai dengan perlakuan kepada tikus percobaan. Sedangkan populasi EPEC penyebab diare yang diberikan adalah sebesar 106 cfu/ml/hari, yang didasarkan bahwa dosis infeksi E. coli enteropatogenik adalah minimal 105 cfu/ml menurut Oyetayo (2004). Setelah perlakuan tertentu selesai diaplikasikan pada tikus percobaan, dilakukan terminasi (pengakhiran perlakuan) dengan selang waktu 7 hari. Pembunuhan tikus dilakukan dengan cara dislokatio cervicalis.
3.3.5 Pembuatan Preparat Histologi Jaringan Hati Tikus
Pembuatan preparat histologi meliputi proses pengambilan jaringan (sampling), fiksasi, dehidrasi, penjernihan (clearing), infiltrasi parafin,
embedding, pemotongan (sectioning), dan pewarnaan (staining) (Kiernan 1990).
Pada proses terminasi, organ hati tikus diambil kemudian dicuci dengan NaCl fisiologis 0.9%. Selanjutnya organ dimasukkan ke dalam larutan fiksatif Bouin
yang telah disiapkan kurang lebih satu jam sebelum terminasi. Setelah terfiksasi, organ direndam dalam alkohol 70% (stopping point). Selanjutnya sampel organ hati dipotong kecil-kecil seperti dadu dan dimasukkan ke dalam tissue basket serta diberi label dengan kertas film. Sampel jaringan yang telah berada dalam tissue
basket didehidrasi dengan alkohol bertingkat mulai dari alkohol 70%, 80%, 90%,
dan 95% masing-masing selama 24 jam. Selanjutnya dilakukan dehidrasi dalam alkohol absolut (100%) I, II, III masing-masing selama 1 jam. Setelah itu, dilakukan penjernihan (clearing) dalam xylol I, II, dan III masing-masing selama 1 jam dan dilanjutkan dengan infiltrasi parafin cair I, II, III pada suhu 60 °C selama masing-masing 1 jam.
Tahap selanjutnya adalah embedding, yaitu penanaman jaringan dalam blok parafin (cetakan) sehingga memudahkan pada saat pemotongan/penyayatan dengan mikrotom. Blok parafin tersebut kemudian dipotong dengan mikrotom setebal 4 µm. Proses ini disebut sectioning. Sebelum blok parafin dipasang pada
holder mikrotom, sebaiknya setiap sudut blok diiris sedikit sebagai pembatas
antar potongan sehingga mudah dipisahkan setelah disayat. Hasil potongan direndam dalam akuades suhu ruang. Setelah ditentukan hasil sayatan terbaik, sayatan tersebut dimasukkan ke dalam akuades yang dipanaskan dengan suhu 37°C dalam waterbath. Selanjutnya sayatan jaringan dilekatkan pada gelas objek dan diberi label (untuk pewarnaan imunohistokimia, jaringan dilekatkan pada gelas objek dengan agen perekat neophren in toluene). Setelah itu, sediaan diinkubasi dalam inkubator selama lebih kurang 24 jam.
Proses berikutnya adalah pewarnaan (staining). Pewarnaan diawali dengan deparafinisasi dengan cara merendam gelas preparat dalam xylol III, II, I secara berurutan selama masing-masing 5 menit. Selanjutnya rehidrasi dilakukan dengan merendam preparat dalam alkohol bertingkat mulai dari alkohol absolut III, II, I, 95%, 90%, 80%, 70% selama masing-masing 5 menit, kemudan dilanjutkan dengan perendaman preparat dalam air kran selama 5 menit dan dalam akuades selama 3 menit.
Pewarnaan Imunohistokimia Superoksida Dismutase (Cu,Zn-SOD)
Pewarnaan ini dilakukan untuk mengamati kandungan enzim Cu,Zn-SOD pada jaringan hati tikus percobaan. Dalam pewarnaan imunohistokimia terdapat
23
tahapan awal yang harus dilakukan, yaitu preparasi gelas objek dan pelapisan (coating) gelas objek dengan neofren in tholuene 2%. Setelah prosedur deparafinisasi dan rehidrasi dilakukan, tahap selanjutnya adalah penghilangan peroksidase endogen menggunakan substrat metanol (30 ml) yang dicampur dengan H2O2 (0.3 ml) atau 3% H2O2 dalam metanol (disiapkan sesaat sebelum gelas objek dimasukkan) dengan cara mencelupkan gelas preparat dan dibiarkan dalam keadaan gelap selama 15 menit. Kemudian dilakukan pencucian dengan akuades dan phosphate buffer saline (PBS) masing-masing 2 kali selama 10 menit. Selanjutnya permukaan sediaan di sekitar jaringan dikeringkan menggunakan kertas tissue dengan tetap menjaga jaringan untuk tidak kering, kemudian preparat disusun sejajar secara mendatar dalam kotak lembab untuk selanjutnya ditetesi 50-60 µl normal serum untuk masing-masing preparat. Kotak kemudian ditutup rapat dan diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37°C selama 60 menit. Tujuan penetesan normal serum adalah untuk menutupi bagian antigen yang tidak spesifik pada jaringan agar tidak mengacaukan reaksi. Selanjutnya dilakukan pencucian preparat dengan PBS sebanyak 3 kali selama masing-masing 5 menit.
Tahap selanjutnya adalah penetesan antibodi primer (monoclonal antibody) Cu,Zn-SOD (SIGMA S2147) sebanyak 50-60 µl pada masing-masing preparat, lalu diinkubasi pada suhu 4 °C selama dua malam. Setelah diinkubasi, gelas preparat dicuci kembali dengan PBS sebanyak tiga kali masing-masing 10 menit, kemudian ditetesi antibodi sekunder DEPS sebanyak 50-60 µl per preparat pada suasana gelap dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 60 menit. Sediaan dicuci dengan PBS masing-masing 3 kali selama 5 menit kemudian ditetesi larutan kromogen DAB pada kondisi gelap dan di tutup selama 30 menit pada suhu ruang. Selanjutnya preparat dicuci dengan air bebas ion (milliQ) dan kemudian dilakukan pengecekan dengan mikroskop cahaya. Adanya warna coklat menunjukkan hasil positif. Proses selanjutnya adalah counterstain menggunakan pewarna hematoksilin untuk mewarnai sel yang tidak menghasilkan Cu,Zn-SOD dan dilanjutkan dengan dehidrasi pada alkohol bertingkat 70%, 80%, 90%, 95%, absolut I, dan absolut II masing-masing beberapa detik serta absolut III selama 1 menit, dilanjutkan clearing dengan xylol I dan II selama beberapa detik serta xylol
III selama 1 menit. Proses diakhiri dengan mounting (penutupan sediaan dengan
cover glass) menggunakan entelan.
Preparat yang telah selesai diwarnai diamati dengan mikroskop cahaya pada lensa objektif 20x pada tiap preparat. Pemotretan juga dilakukan dengan pembesaran lensa objektif 20x pada preparat jaringan hati tersebut sebanyak enam lapang pandang secara acak pada setiap preparat.
3.3.6 Analisis Kandungan SOD Hati Tikus
Analisis kandungan enzim superoksida dismutase (SOD) dilakukan dengan metode imunohistokimia. Pewarnaan imunohistokimia terhadap Cu,Zn-SOD dilakukan untuk mendeteksi sel-sel penghasil Cu,Zn-SOD yang dapat menunjukkan jumlah sel penghasil serta kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD. Pengamatan dilakukan secara kualitatif dan kuantitatif menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran lensa obyektif 20x.
Pengamatan Cu,Zn-SOD secara kualitatif dilakukan pada sitoplasma dan inti sel hati dengan melihat intensitas warna coklat dan distribusinya pada seluruh bagian setiap preparat yang diamati. Pengamatan dilakukan dengan mikroskop cahaya pada perbesaran objektif 10x. Semakin tua dan semakin merata warna coklatnya berarti mengandung semakin banyak Cu,Zn-SOD. Penilaian dilakukan dengan memberikan tanda (+). Semakin banyak tanda (+) berarti kandungan enzim Cu,Zn-SOD semakin banyak dan merata di seluruh bagian jaringan hati.
Pengamatan secara kuantitatif dilakukan pada inti sel hati berdasarkan berbagai tingkatan kandungan warna coklat yang terbentuk tiap lapang pandang pada perbesaran objektif 20x. Keberadaan enzim Cu,Zn-SOD ditunjukkan oleh tanda (+), semakin banyak tanda (+) berarti semakin tinggi kandungan enzim tersebut. Ada empat tingkatan hasil reaksi, yaitu positif kuat (+++, inti sel hati berwarna coklat tua), positif sedang (++, inti sel hati berwarna coklat sedang), positif lemah (+, inti sel hati berwarna coklat muda campur biru), dan reaksi negatif (-, inti sel hati berwarna biru). Perhitungan dilakukan pada enam lapang pandang yang berbeda yang dipilih secara acak pada setiap preparat jaringan. Hasil pengamatan kandungan antioksidan Cu,Zn-SOD pada jaringan hati secara
25
kuantitatif ini dianalisis dengan ANOVA dan apabila terdapat perbedaan yang nyata akan dilakukan uji Lanjutan Duncan (Wresdiyati et al. 2010).
Pewarnaan imunohistokimia terhadap Cu,Zn-SOD dilakukan untuk melihat kandungan enzim antioksidan Cu,Zn-SOD di jaringan hati tikus pada setiap kelompok perlakuan. Enzim Cu,Zn-SOD merupakan enzim antioksidan endogen yang mempunyai peranan penting dalam melindungi sel dari serangan radikal bebas dan secara tidak langsung dapat menjaga keseimbangan oksigen yang bersifat toksik (Wresdiyati et al. 2002). Enzim Cu,Zn-SOD mengkatalis dismutasi radikal bebas anion superoksida (O2-) menjadi radikal yang lebih lemah yaitu hidrogen peroksida (H2O2) dan selanjutnya akan diubah menjadi oksigen (O2) yang lebih stabil dan air (H2O) oleh glutation peroksidase dan katalase (Finkel dan Holbrook 2000).
Reaksi positif dari pewarnaan imunohistokimia terhadap enzim Cu,Zn-SOD divisualisasikan berupa produk reaksi warna coklat di jaringan hati. Intensitas dan distribusi warna coklat menujukkan kandungan enzim antioksidan Cu,Zn-SOD pada jaringan hati. Semakin tua dan merata warna coklat yang terbentuk berarti kandungan enzim Cu,Zn-SOD semakin banyak/tinggi. Sel yang bereaksi negatif atau tidak mengandung enzim Cu,Zn-SOD ditunjukkan dengan warna biru.
Pengamatan dilakukan secara kualitatif dan kuantitatif. Pengamatan secara kualitatif dilakukan dengan melihat intensitas warna coklat pada seluruh bagian jaringan hati. Sedangkan pengamatan secara kuantitatif dilakukan dengan menghitung inti sel hati yang dibedakan pada beberapa tingkatan warna coklat, yakni positif kuat (+++, coklat tua), positif sedang (++, coklat sedang), positif lemah (+, coklat muda campur biru), dan reaksi negatif (-, biru).
Pengamatan secara kualitatif terhadap jaringan hati pada terminasi hari ke-8 menunjukkan bahwa tidak terdapat perbedaan kandungan enzim Cu,Zn-SOD antar kelompok perlakuan (Tabel 3). Kandungan enzim Cu,Zn-SOD pada jaringan hati tikus kelompok perlakuan bakteri asam laktat (BAL) L. plantarum, L. fermentum,
L. plantarum + EPEC, dan L. fermentum + EPEC relatif sama dengan kelompok
kontrol negatif dan kontrol positif (Gambar 7). Hal ini berarti L. plantarum dan
L. fermentum belum mampu meningkatkan kandungan enzim Cu,Zn-SOD pada
27
laktat tersebut. Selain itu, tidak adanya perbedaan kandungan enzim Cu,Zn-SOD pada kelompok kontrol positif dengan kelompok perlakuan lain dapat terjadi karena kelompok kontrol positif belum dicekok EPEC pada minggu pertama.
Tabel 3 Kandungan enzim Cu,Zn-SOD pada jaringan hati tikus percobaan
Kelompok perlakuan Kandungan Cu,Zn-SOD
Terminasi hari ke-8, sebelum pemberian EPEC (T1)
T1A ++ T1B ++ T1C ++ T1D ++ T1E ++ T1F ++
Terminasi hari ke-15, satu minggu setelah pemberian EPEC (T2)
T2A ++ T2B ++ T2C +++ T2D ++ T2E ++++ T2F +/-
Terminasi hari ke-22, satu minggu setelah pemberian EPEC dari luar dihentikan (T3)
T3A ++ T3B ++ T3C +++ T3D + T3E ++++ T3F +/-
Ket: Tanda (+) menunjukkan adanya kandungan enzim Cu,Zn-SOD. Semakin banyak tanda (+) berarti semakin tinggi kandungan enzim tersebut. A = kelompok kontrol
negatif (perlakuan ransum standar); B = kelompok perlakuan L. plantarum; C = kelompok perlakuan L. fermentum; D = kelompok perlakuan L. plantarum +
EPEC; E = kelompok perlakuan L. fermentum + EPEC; F = kelompok kontrol positif (perlakuan EPEC).
Kemudian pada terminasi hari ke-15, terdapat perbedaan kandungan enzim Cu,Zn-SOD pada setiap kelompok perlakuan (Gambar 8). Secara kualitatif kelompok perlakuan L. fermentum + EPEC memiliki kandungan enzim Cu,Zn-SOD paling tinggi, terlihat dari intensitas warna coklat yang terbentuk pada kelompok perlakuan ini lebih kuat dibandingkan kelompok lain. Hal ini berarti
