1 A. Latar Belakang
Sistem imun merupakan sistem biologis dalam tubuh yang memiliki peran penting dalam menjaga kesehatan. Sistem ini bekerja dengan mencegah dan melawan infeksi dalam tubuh (Abbas dkk, 2001). Oleh karena itu, penurunan respon imun dapat menyebabkan proses pembersihan antigen infeksius dalam tubuh menjadi terhambat.
Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Sasmito dkk (2015), diketahui bahwa buah mengkudu memiliki fungsi sebagai imunostimulan dengan meningkatkan proliferasi sel limfosit berdasarkan adanya kandungan polisakarida di dalamnya. Selain itu, berdasarkan penelitian Brooke dkk (2009), buah mengkudu dilaporkan dapat meningkatkan jumlah sel TCD8+.
Dalam proses pertahanan tubuh, beberapa komponen sistem imun seperti sel fagositik maupun beberapa sel leukosit mampu menghasilkan senyawa radikal yang berperan dalam proses penghancuran mikroba. Namun apabila diproduksi secara berlebih, radikal tersebut dapat menyebabkan kerusakan komponen biologis tubuh (Pham-Huy dkk, 2008; Sordillo dan Aitken, 2009; Cook-Mills, 2002). Oleh karena itu, selain memerlukan senyawa yang dapat meningkatkan sistem imun, tubuh juga memerlukan senyawa antioksidan yang dapat mencegah kerusakan komponen biologis tubuh akibat radikal bebas (Antolovich dkk, 2001).
Salah satu bahan alam yang sering digunakan sebagai sumber antioksidan yaitu kulit buah manggis. Kulit buah manggis mengandung sebagian besar senyawa turunan xanton yang ada pada tanaman manggis dengan salah satu fungsinya sebagai antioksidan (Ahmat dkk, 2010). Menurut Zarena dan Sangkar (2009), ekstrak etil asetat dan ekstrak aseton dari kulit manggis memiliki aktivitas penangkapan radikal yang kuat.
Berdasarkan aktivitas yang dimiliki oleh buah mengkudu dan kulit buah manggis, diharapkan kombinasi keduanya dapat menjadi suplemen alternatif dalam peningkatan respon imun. Salah satu indikator untuk menilai respon imun, yaitu melalui pengamatan terhadap jumlah sel TCD8+. Hal ini dikarenakan, sel TCD8+ merupakan salah satu komponen dalam sel limfosit yang telah terbukti mampu meningkat dengan pemberian mengkudu dan sel ini bekerja secara langsung dalam membunuh mikroba yang masuk ke dalam sel dan menyebabkan infeksi pada sel yang dimasukinya. Oleh karena itu, pada penelitian ini dilakukan kombinasi ekstrak buah mengkudu (EBM) dan ekstrak kulit buah manggis (EKM) untuk memberikan informasi mengenai kemampuan kombinasi tersebut dalam mempengaruhi sistem imun melalui pembentukan sel TCD8+. Selain itu, diukur pula aktivitas penangkapan radikal oleh kombinasi ekstrak EBM dan EKM untuk mengetahui apakah terdapat interaksi antar ekstrak yang berpengaruh terhadap aktivitas penangkapan radikal.
B. Rumusan Masalah
1. Apakah kombinasi ekstrak buah mengkudu (EBM) dan ekstrak kulit buah manggis (EKM) dapat meningkatkan jumlah sel TCD8+ pada tikus yang diinduksi antigen?
2. Bagaimana pengaruh kombinasi ekstrak buah mengkudu (EBM) dan ekstrak kulit buah manggis (EKM) pada aktivitas penangkapan radikal jika dibandingkan ekstrak tunggalnya?
C. Tujuan Penelitian
1. Mengetahui pengaruh kombinasi ekstrak buah mengkudu (EBM) dan ekstrak kulit buah manggis (EKM) terhadap jumlah sel TCD8+ pada tikus yang diinduksi antigen.
2. Mengetahui pengaruh kombinasi ekstrak buah mengkudu (EBM) dan ekstrak kulit buah manggis (EKM) terhadap aktivitas penangkapan radikal dibandingkan dengan ekstrak tunggalnya.
D. Manfaat Penelitian
Hasil penelitian ini dapat bermanfaat untuk menambah data ilmiah mengenai potensi kombinasi ekstrak buah mengkudu dan ekstrak kulit manggis sebagai agen imunomodulator, sehingga dapat menjadi sumber data yang bermanfaat bagi pengembangan penelitian selanjutnya.
E. Tinjauan Pustaka
1. Mengkudu (Morinda citrifolia L.)
Mengkudu merupakan tanaman yang mudah tumbuh pada berbagai tipe lahan dan iklim, dan merupakan tanaman asli dari Asia Tenggara dan Australia (Nelson, 2006; Winarti dan Nurdjanah, 2005). Tanaman yang memiliki nama ilmiah Morinda citrifolia ini memiliki berbagai nama berbeda di beberapa negara maupun di beberapa daerah di Indonesia. Beberapa nama mengkudu tersebut antara lain, Indian mulberry dan nuna dari India, noni dari Hawai dan cheese fruit dari Australia. Adapun beberapa nama daerah mengkudu antara lain pace, kemudu, cengkudu di Jawa, mengkudu, bengkudu dan eodu di Sumatra, dan masih banyak lagi nama daerah untuk buah ini (Yanine dkk, 2005; Wijayausuma dan Dalimartha, 1995). Berikut klasifikasi tumbuhan mengkudu :
Kingdom : Plantae (Tumbuhan)
Subkingdom : Tracheobionta (Tumbuhan berpembuluh) Super Divisi : Spermatophyta (Menghasilkan biji) Divisi : Magnoliophyta (Tumbuhan berbunga) Kelas : Magnoliopsida (berkeping dua / dikotil) Sub Kelas : Asteridae
Ordo : Rubiales
Famili : Rubiaceae (suku kopi-kopian) Genus : Morinda
Gambar 1. Buah Mengkudu (Nelson, 2006)
Tanaman mengkudu tumbuh selalu hijau dengan ketinggian 3-10 meter. Memiliki daun yang berbentuk elips, ujung runcing, tepi rata, tulang daun menyirip dengan panjang 20 – 45 cm dan lebar 7 – 25 cm. Daun berwarna hijau tua dengan helai daun tebal dan mengkilap. Buah mengkudu merupakan buah majemuk berwarna putih kekuningan, dengan panjang 5-10 cm dan diameter 3-4 cm. Daging buah lunak dan berbau busuk saat matang (Nelson, 2006).
Buah mengkudu telah digunakan sebagai bahan makanan dan pengobatan tradisional polinesia selama lebih dari 2000 tahun. Beberapa contoh pemanfaatan mengkudu dalam bidang pengobatan antara lain untuk melawan bakteri, virus, jamur, tumor dan anti cacing (Nagalingam dkk, 2013). Selain itu, buah mengkudu juga dapat dimanfaatkan untuk meningkatkan sistem imun, sebagai agen anti inflamasi, analgesik, antioksidan dan dapat mencegah pembentukan dan proliferasi tumor (Yanine dkk, 2005; Brooks dkk, 2009).
Buah mengkudu memiliki berbagai kandungan seperti protein, skopoletin, polisakarida, asam askorbat, proxeronin dan proxeroninase (Sjabana dan Bahalwan, 2002 dalam Sasmito dkk, 2015). Dari beberapa kandungan tersebut, senyawa
polisakarida diketahui memiliki kemampuan sebagai agen imunomodulator. Polisakarida yang terkandung dalam buah mengkudu terutama tersusun atas ramnosa, arabinosa, galaktosa dan asam glukoronat (Hirazumi dan Furuzawa, 1999; Yanine dkk, 2005).
Gambar 2. Penyusun polisakarida dalam buah Mengkudu (Assi dkk, 2015)
Menurut penelitian yang dilakukan oleh Sasmito dkk (2015), tingginya kandungan polisakarida dalam ekstrak buah mengkudu memberikan stimulasi yang tinggi pada proliferasi limfosit. Selain itu, jus buah mengkudu juga diketahui dapat meningkatkan jumlah sel TCD8+ (Brooke dkk, 2009).
2. Manggis (Garcinia mangostana L.)
Manggis (Garcinia mangostana L.) merupakan tumbuhan yang banyak tersebar di kawasan Asia Tenggara. Selain itu tumbuhan ini juga banyak ditemukan didaerah Australia bagian utara, Afrika, India, Hawai’i, dan Amerika tengah dan selatan (Diczbalis, 2011). Di Indonesia, tanaman ini tersebar hampir di seluruh daerah, dengan pusat produksi berada di Sumatra Barat, Jawa Barat, Jawa Timur dan Bali (Sobir dan Poerwanto, 2007).
Tanaman manggis memiliki buah dengan warna kulit buah yaitu ungu gelap atau kemerahan sedangkan daging buah berwarna putih, lembut dengan rasa sedikit
asam dan manis dan memiliki aroma yang menyenangkan (Hyun-Ah dkk, 2006). Adapun klasifikasi tanaman manggis sebagai berikut :
Divisio : Spermatophyta Sub-divisio : Angiospermae Kelas : Dicotyledoneae Ordo : Guttiferales
Familia : Guttiferae (Clusiaceae) Genus : Garcinia
Spesies : Garcinia mangostana L.
Gambar 3. Kulit Buah Manggis (Purnawati, 2010 dan Gutierrez-Orozco dan Failla, 2013)
Buah manggis memiliki beberapa kandungan bioaktif. Beberapa kandungan tersebut antara lain adalah xanton, flavonoid, triterpenoid dan benzofenon (Gutierrez-Orozco dan Failla, 2013). Senyawa golongan xanton merupakan salah satu komponen dari buah manggis yang saat ini banyak dipelajari. Senyawa golongan ini diketahui memiliki aktivitas sebagai antioksidan, anti-inflamasi, antibakteri, dan anti kanker (Ahmat dkk, 2010). Adanya kandungan variasi antioksidan dalam suatu buah diketahui dapat mengurangi insidensi terjadinya penyakit degeneratif seperti kanker, penyakit jantung, artritis, inflamasi, dan
penurunan sistem imun (Hyun-Ah dkk, 2006). Senyawa golongan xanton dalam tanaman manggis dapat diisolasi baik dari kulit buah, seluruh bagian buah, kulit kayu maupun dari daun (Pedraza-Chaverri dkk, 2008; Young-Won dan Kinghorn, 2008). Ada sekitar 68 jenis senyawa golongan xanton yang sudah diidentifikasi dengan pasti tersebar di bagian berbeda dari tumbuhan manggis, dan sekitar 50 jenis ditemukan di bagian kulit manggis dengan konsentrasi tinggi dibanding bagian aril (bagian yang dapat dimakan dari buah tersebut). Dari banyaknya senyawa golongan xanton pada buah mengkudu, α-mangostin dan γ-mangostin merupakan jenis yang paling berlimpah pada buah manggis (Gutierrez-Orozco dan Failla, 2013).
(a) (b)
Gambar 4. a. α-mangostin, b. γ-mangostin (Gutierrez-Orozco dan Failla, 2013)
3. Flow cytometry
Flow cytometry merupakan suatu teknologi yang dapat menganalisis secara
bersamaan beberapa sifat fisik dari partikel tunggal dalam jumlah besar dengan waktu yang singkat (James, 1991). Prinsip dari flow cytometry yaitu, partikel yang terdapat dalam suatu aliran larutan sampel akan diperiksa secara tunggal dengan melewati suatu daerah sempit dalam waktu yang singkat (Robinson, 2004).
Flow cytometry terdiri dari tiga sistem utama yaitu fluidics system, optical system, dan electronic system. Fluidics system berfungsi untuk membawa partikel
pada aliran sampel menuju berkas sinar untuk di periksa. Sistem optik terdiri dari sinar yang akan menyinari partikel untuk melakukan deteksi, sedangkan sistem elektronik berfungsi untuk mengubah deteksi dari sinyal cahaya menjadi sinyal elektronik yang dapat di proses oleh komputer (Anonim, 2002).
Saat sampel melewati berkas sinar, maka akan terjadi sebaran sinar. Sebaran tersebut dapat menuju ke arah depan atau biasa disebut forward scatter (FS) maupun sebaran ke arah samping atau side scatter (SS). Parameter FS dapat digunakan untuk mengetahui ukuran partikel serta dapat membedakan antara pecahan sel dengan sel hidup, sedangkan SS dapat memberikan informasi mengenai konsistensi granular dalam partikel (Rahman, 2006).
Gambar 5. Sifat sebaran sinar pada sel (Anonim, 2002)
Hampir semua partikel alam dapat dianalisis dengan flow cytometry. Salah satu penggunaan umum dalam flow cytometry adalah menggunakan molekul
fluorescent yang akan menempel pada partikel. Molekul fluorescent akan
berkonjugasi dengan antibodi seperti antibodi monoklonal ataupun poliklonal yang dapat mengenali reseptor spesifik dari sel (Robinson, 2004).
4. Sistem imun
Sistem imun merupakan kumpulan sel jaringan dan molekul yang memediasi ketahanan tubuh, sedangkan respon imun merupakan reaksi koordinasi sel dan molekul untuk melawan mikroba infeksius. Fungsi dari sistem imun yaitu untuk mencegah infeksi maupun menghilangkan infeksi yang sudah ada. Selain itu, sistem imun juga dapat mencegah pertumbuhan tumor serta berperan dalam pembersihan sel mati dan dalam permulaan perbaikan jaringan. Namun, respon imun yang tidak normal juga dapat membahayakan tubuh, karena dapat melukai sel dan menginduksi inflamasi, sehingga dapat menyebabkan penyakit inflamasi, alergi maupun penyakit autoimun (Abbas dkk, 2001).
Mekanisme pertahanan tubuh oleh sistem imun dapat dibedakan menjadi dua macam mekanisme yaitu innate immunity atau respon imun bawaan dan respon imun adaptif (adaptive immunity) atau yang biasa disebut respon imun spesifik. Respon imun bawaan merupakan respon imun lini pertama yang memediasi pertahanan awal dalam melawan infeksi. Sistem imun ini dimediasi oleh sel non
lymfoid seperti granulosit, monosit, sel mast dan natural killer. Respon imun adaptif
merupakan respon imun yang membutuhkan pengembangan dan diferensiasi dari sel limfosit dalam merespon atau dapat dikatakan bahwa sistem imun ini akan beradaptasi terhadap kehadiran senyawa-senyawa infeksius (Abbas dkk, 2001; Ghaedi dan Takei, 2016; Pham-Huy dkk, 2008).
Gambar 6. Mekanisme respon imun bawaan dan respon imun adaptif (Abbas dkk, 2001)
Pengenalan reseptor antigen dalam respon imun adaptif dilakukan oleh sel limfosit. Terdapat dua sel limfosit yaitu sel limfosit B dan limfosit T. Sel Limfosit B merupakan komponen sistem imun yang memberikan respon humoral dengan menghasilkan antibodi yang dapat mengenali berbagai makromolekul seperti protein, polisakarida, lipid, dan asam nukleat, sedangkan sel limfosit T berperan dalam respon imun selular yang dapat mengenali fragmen peptida dari antigen. Kebanyakan sel limfosit T dalam mengenali peptida antigen memerlukan bantuan molekul major histocompatibility complex (MHC) dari antigen-presenting cells (APC), dimana MHC akan berikatan dan mengenalkan antigen kepada sel limfosit T (Abbas dkk, 2001; Nauta, 2011). Sel limfosit mengalami diferensiasi dan pematangan di organ limfoid primer. Sel limfosit B dan sel limfosit T, keduanya diproduksi di sumsum tulang belakang, namun pada saat proses pematangan, sel limfosit B akan menetap di sumsum tulang belakang sedangkan sel limfosit T akan berpindah menuju timus sebelum keduanya bermigrasi menuju organ limfoid sekunder (Stewart, 2012).
Sel limfosit T dalam sistem imun adaptif berdiferensiasi menjadi sel T
helper dan sel T sitolitik. Keduanya dibedakan dengan adanya protein spesifik yang
berada di permukaan sel yang disebut Cluster of Differentiation (CD). Sel T helper ditandai dengan protein spesifik CD4+ sedangkan sel T sitolitik ditandai dengan protein spesifik CD8+. Sel limfosit TCD4+ berfungsi membantu sel limfosit B untuk memproduksi antibodi dan membantu fagosit untuk menghancurkan mikroba, sedangkan sel limfosit TCD8+ berfungsi untuk membunuh mikroba intraseluler. Fungsi sel limfosit TCD8+ ini cukup penting, karena mikroba yang berhasil menginfeksi sel akan selamat dari antibodi, karena antibodi tidak dapat memasuki sel, sehingga diperlukan sel limfosit TCD8+ (sel T sitolitik) yang dapat membunuh sel yang terinfeksi mikroba patogen (Abbas dkk, 2001).
Dalam proses pertahanan tubuh, beberapa komponen sistem imun seperti sel fagositik maupun beberapa sel leukosit juga mampu menghasilkan senyawa radikal yang berperan dalam proses penghancuran mikroba. Namun apabila diproduksi secara berlebih, radikal tersebut dapat menyebabkan kerusakan komponen biologis tubuh (Pham-Huy dkk, 2008; Sordillo dan Aitken, 2009; Cook-Mills, 2002).
5. Imunomodulator
Imunomodulator merupakan agen yang dapat memodifikasi respon dari sistem imun. Senyawa imunomodulator dapat bekerja dengan meningkatkan atau menurunkan respon imun. Senyawa yang dapat mengaktivasi atau menginduksi mediator atau komponen sistem imun disebut dengan senyawa imunostimulan, sedangkan senyawa yang dapat menghambat sistem imun disebut dengan imunosupresan (Bascones-Martinez dkk, 2014; Jantan dkk, 2015).
Senyawa imunostimulan dan imunosupresan memiliki fungsi masing-masing. Senyawa imunosupresan memiliki fungsi untuk mengurangi respon imun dalam pengobatan penyakit autoimun serta mengurangi respon imun dalam melawan organ tranplantasi untuk mengurangi kegagalan dalam proses transplantasi organ, sedangkan senyawa imunostimulan berfungsi untuk meningkatkan sistem imun pada penyakit infeksi, imunodefisiensi dan kanker.
Senyawa imunomodulator dapat diperoleh dari bahan alam. Beberapa contoh bahan alam yang sering digunakan sebagai agen imunomodulator, khususnya yang dapat meningkatkan sistem imun yaitu buah mengkudu, meniran, sambiloto dan temulawak (Devagaran dan diantini, 2012).
6. Antioksidan
Antioksidan merupakan senyawa yang dapat menunda ataupun menghambat proses oksidasi (Pisoschi dan Pop, 2011). Antioksidan berperan untuk menghilangkan radikal bebas yang reaktif, sebelum radikal tersebut menyerang dan mengakibatkan kerusakan oksidatif terhadap komponen biologis tubuh (Niki, 2014). Proses oksidasi dapat terjadi baik dalam tubuh maupun dalam makanan. Proses oksidasi dalam tubuh seperti metabolisme diperlukan oleh tubuh untuk kelangsungan hidup sel. Namun efek samping dari proses tersebut yaitu adanya produksi radikal bebas dan reactive oxygen species (ROS) (Antolovich dkk, 2001). Produksi yang berlebih dari radikal bebas tersebut menyebabkan kerusakan terhadap protein seluler, membran lipid, maupun DNA. Selain itu asam lemak
polyunsaturated juga memiliki kemungkinan besar untuk diserang oleh radikal
strukturnya. Kerusakan-kerusakan yang terjadi pada komponen biologis tubuh tersebut dapat menyebabkan gangguan fungsional tubuh (Hughes, 1999; Antolovich dkk, 2001).
Selain dapat mencegah kerusakan pada komponen biologis tubuh akibat serangan radikal bebas, antioksidan juga dapat mempengaruhi sistem imun tubuh. Sistem imun tubuh, untuk bekerja efektif berkaitan dengan komunikasi sel-sel melalui reseptor terikat membran yang kaya akan asam lemak tak jenuh. Oleh karena itu, penyerangan radikal bebas pada komponen lemak membran sel imun dapat menyebabkan hilangnya integritas membran dan mengubah fluiditas membran (Hughes, 1999).
Antioksidan dapat diperoleh dari berbagai sumber, salah satunya melalui buah dan sayur yang dikonsumsi. Hal ini dikarenakan, dalam buah ataupun sayur terdapat beberapa senyawa seperti senyawa fenolik dan flavonoid. Kedua senyawa tersebut efektif sebagai antioksidan karena dapat mendonorkan hidrogen dari kelompok fenolik hidroksil kepada senyawa radikal (Zarena dan Sankar, 2009).
7. DPPH
Metode DPPH merupakan salah satu metode untuk pengujian aktivitas
antioksidan. Metode ini menggunakan reagen yang disebut dengan 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) (Apak dkk, 2013). DPPH merupakan salah satu
jenis radikal yang memiliki warna ungu tua dan dapat larut dalam metanol. Pengukuran dengan metode DPPH didasarkan pada kemampuan reduksi antioksidan terhadap DPPH yang dapat dievaluasi melalui penurunan absorbansinya (Pisoschi dan Pop 2011; Shurbaji dan Agha, 2016). Penurunan
absorbansi tersebut terjadi karena DPPH radikal yang berwarna ungu akan bereaksi dengan donor hidrogen dari senyawa antioksidan sehingga akan merubah warna larutan DPPH menjadi kuning (Shurbaji dan Agha, 2016).
Gambar 7. Reaksi antara senyawa DPPH dengan senyawa Antioksidan (Bendary dkk, 2013)
Dari pengujian aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH, diperoleh hasil berupa nilai EC50. EC50 dihitung berdasarkan analisis regresi linier dari kurva antara konsentrasi dengan % penangkapan radikal (Shurbaji dan Agha, 2016). EC50 merupakan konsentrasi antioksidan yang dibutuhkan untuk menangkal radikal DPPH sampai setengahnya (Antolovich, 2001). Nilai EC50 yang kecil menunjukkan potensial antioksidan yang besar (Shurbaji dan Agha, 2016).
F. Landasan Teori
Berdasarkan penelitian terdahulu, mengkudu telah diketahui dapat digunakan sebagai agen imunomodulator. Buah mengkudu mengandung protein, skopoletin, polisakarida, asam askorbat, proxeronin dan proxeroninase. Diantara beberapa kandungan tersebut, senyawa polisakarida yang terdapat pada buah mengkudu memiliki kemampuan sebagai imunostimulan. Salah satu efek imunostimulan yang dimiliki oleh buah mengkudu yaitu melalui peningkatan jumlah sel TCD8+. Sedangkan, pada buah manggis terdapat senyawa golongan
xanton yang menunjukkan aktivitas antioksidan. Dari sekitar 68 jenis senyawa golongan xanton yang terdapat pada tanaman manggis, kurang lebih sekitar 50 jenis senyawa tersebut terdapat di dalam kulit buahnya. Kandungan antioksidan tersebut dapat berfungsi untuk menangkal radikal bebas baik yang berasal dari luar tubuh ataupun dari dalam tubuh yang dapat menyebabkan kerusakan oksidatif terhadap komponen biologis tubuh. Oleh karena itu, apabila buah mengkudu dan kulit buah manggis dikombinasikan, diduga kombinasi keduanya dapat meningkatkan aktivitas imunostimulan melalui peningkatan jumlah sel TCD8+ serta dapat meningkatkan aktivitas penangkapan radikal, sehingga kombinasi keduanya dapat menjadi alternatif dalam meningkatkan respon imun serta daya tahan tubuh.
C. Hipotesis
1. Kombinasi ekstrak buah mengkudu (EBM) dan kulit buah manggis (EKM) dapat meningkatkan jumlah sel TCD8+ pada tikus yang terinduksi antigen. 2. Kombinasi ekstrak buah mengkudu (EBM) dan kulit buah manggis (EKM)
dapat meningkatkan aktivitas penangkapan radikal dibanding dengan aktivitas penangkapan radikal pada ekstrak tunggalnya.
