KULTIVASI MIKROORGANISME

KULTIVASI

Organisme Waktu Penggandaan sel

Bakteri dan khamir Kapang dan Alga Rumput Ayam Babi Sapi muda Manusia (muda) 20-120 menit 2-6 jam 1-2 minggu 2-4 mingu 4-6 mingu 1-2 bulan 3-6 bulan

Skema Umum Proses Kultivasi

Bioreaktor Pengembangan Inokulum

Kultur

Stok Labu_Kocok Bioreaktor_Inokulum Sterilisasi Media

Formulasi Media

Bahan Baku Media

Cairan Fermentasi Biomassa Pemisahan Sel Supernatan Bebas Sel Ekstraksi Produk Pemurnian Produk Pengemasan produk Penanganan Limbah Cair

CONTOH KULTIVASI PADA SUATU

BIOINDUSTRI

„

Metode kultivasi berdasarkan cara operasi bioreaktor :

„

-

nir sinambung/curah

(batch)

-

sinambung

(continuous)

-

semi sinambung

(fed- batch)

METODE KULTIVASI

Pelaksanaan kultivasi :

„ Bioreaktor steril diisi dengan media segar steril lalu

diinokulasi dengan inokulum Î KULTIVASI (merupakan

sistem tertutup)

„ Pada akhir kultivasi, isi bioreaktor dikeluarkan untuk

dilakukan pemanenan produk (proses hilir)

„ Bioreaktor selanjutnya dibersihkan dan disterilisasi untuk

digunakan pada kultivasi berikutnya

Penyiapan/pembersihan bioreaktor repot

Kultur Curah

:

1. Kultur curah merupakan cara yang paling sederhana, sehingga menjadi titik awal untuk studi kinetika kultivasi

2. Resiko kontaminasi rendah

3. Konsentrasi produk akhir lebih tinggi

4. Tidak perlu mikroba dengan kestabilan tinggi krn waktu kultivasinya pendek

5. Dapat untuk fase fermentasi yang berbeda pada bioreaktor yang sama (Contoh : pertumbuhan sel pd fase eksponensial &

pembentukan produk pd fase stasioner = metabolit sekunder 6. Pada industri farmasi, semua bahan-bahan yang digunakan

harus diketahui dengan tepat, sehingga lebih praktis dengan proses curah

7. Dari aspek rekayasa bioproses, kultur curah lebih fleksibel dalam perencanaan produksi, terutama untuk memproduksi beragam produk dengan pasar kecil

8. Kelemahan : Terakumulasi produk yang dapat menghambat pertumbuhan

Kurva Pertumbuhan

Bila sel ditumbuhkan pada kultur curah, maka sel akan tumbuh dengan melalui : fase lag, fase eksponensial (fase log), fase stasioner dan akhirnya fase kematian

Lag _{Eksponensial Stasioner Kematian}

Waktu

Log Jml

Sel/ml

Ln X (g/l)

‘Viable cell count’ dg lisis sel Lisis sel, diikuti

„ Fase Eksponensial :

„ Keterangan :

X = konsentrasi biomassa di dalam bioreaktor (g/l bobot kering)

µ = laju pertumbuhan spesifik (jam-1₎

t = waktu (jam)

„ Model pertumbuhan mikrobial ini dikenal sebagai Î Model Pertumbuhan Eksponensial

Plot antara ln[Sel] vs waktu

Î akan menghasilkan hubungan garis lurus pada fase

eksponensial (ingat pembelahan biner)

„ Mengapa populasi sel meningkat dengan cara eksponensial ? „ Perhatikan sel tunggal di dalam bioreaktorÎ Sel ini

membelah diri tiap jam (pembelahan biner).

„ Populasi sel pada tiap waktu generasi dapat digambarkan

sbb.

Bila 1 sel membelah menjadi 2 sel Î 2 Î 4 Î 8 …. dst 1 Î 21 Î 22 Î 23 Î 24 ………….. Î2n = N (jumlah sel) Pangkat (eksponen) n = jumlah generasi

Laju pertumbuhan spesifik(µ) :

- Menggambarkan kecepatan reproduksi sel.

- Semakin tinggi nilainya, maka semakin cepat sel tumbuh. - Pada saat sel tidak tumbuh, maka laju spesifik pertumbuhan

= 0

Model Pertumb Eksponensial

¾ Hasil integrasi :

Persamaan di atas menggambarkan hubungan eksponensial

„ Penentuan Laju Pertumbuhan Spesifik :

Plot antara ln X vs t akan menghasilkan garus lurus

Hubungan antara Waktu Penggandaan (doubling time = t_D) dengan laju spesifik pertumbuhan (μ)

„t_d menggambarkan waktu yang diperlukan untuk menggandakan

populasi sel Î menggambarkan laju pertumbuhan sel

„Selama fase eksponensial t_D relatif konstan

„Hubungan antara t_D dengan laju pertumbuhan spesifik

Î bila konsentrasi biomassa menjadi dua kali dari X₀ menjadi X₁ selama waktu penggandaan t_D (= t ₁- t₀) :

t_d = 0,693 μ

Aplikasi Kultur Curah

:

• Digunakan untuk memproduksi biomassa, metabolit primer dan metabolit sekunder

• Untuk produksi biomassa Î digunakan kondisi kultivasi yang mendukung pertumbuhan biomassa, sehingga mencapai

maksimal

• Untuk prodiksi metabolit primer Î kondisi kultivasi harus dapat memperpanjang fase eksponensial yang dibarengi dengan

sintesis produk

• Untuk produksi metabolit sekunder Î kondisi kultivasi harus dapat memperpendek fase eksponensial dan memperpanjang fase stasioner

KULTUR SINAMBUNG

„ Media segar secara kontinyu ditambahkan ke dalam

bioreaktor, dan pada saat yang bersamaan cairan kultivasi dikeluarkan (Sistem Terbuka)

„ Sel mikroba secara kontinyu berpropagasi menggunakan

media segar yang masuk, dan pada saat yang bersamaan produk, produk samping metabolisme dan sel dikeluarkan dari bioreaktor Î volume tetap

„ Bioreaktor kultur sinambung membutuhkan lebih sedikit

pembersihan dibandingkan sistem curah.

„ Dapat menggunakan Sel mikroba imobil untuk

memaksimumkan waktu tinggalnya (retensi), sehingga meningkatkan produktivitasnya.

Imobilisasi sel : penempatan mikroba pada ruang/daerah tertentu, sehingga dapat mempertahankan kestabilannya & dapat digunakan berulang-ulang (contoh :

Kultur Sinambung

Kelebihan :

1. Produktivitas lebih tinggi, penyebab :

- lebih sedikit waktu persiapan bioreaktor per satuan produk yang dihasilkan

- laju pertumbuhan & konsentrasi sel dapat dikontrol Î dengan mengatur laju dilusi

- pemasokan oksigen dan pembuangan panas dapat diatur Dengan demikian hanya butuh pabrik lebih kecil (pengurangan biaya modal untuk fasilitas baru)

2. Dapat dijalankan pada waktu yang lama

3. Cocok untuk proses yang resiko kontaminasinya rendah (contohnya penanganan limbah cair) & produk yang

berasosiasi dengan pertumbuhan

4. Pemantauan dan pengendalian proses lebih sederhana 5. Tidak ada akumulasi produk yang menghambat

Kultur Sinambung

Dengan mengontrol laju dilusi Î dimungkinkan untuk

mempertahankan laju pertumbuhan spesifik yang optimal untuk pembentukan produk

Kelemahan :

‰ Aliran umpan yang lama Î resiko kontaminasi besar (operasi harus hati-hati & desain peralatan lebih baik)

‰ Peralatan untuk operasi dan pengendalian proses harus bisa tetap bekerja baik untuk waktu yang lama

‰ Memerlukan mikroba dengan kestabilan genetik tinggi, karena akan digunakan pada waktu yang lama

Î Terjadinya degenerasi galur mikroba yang digunakan akibat mutasi spontan menyebabkan penurunan produk yang

dihasilkan

‰ Sebaiknya ada konsumen/permintaan yang tetap terhadap produk spy efisien

NERACA MASSA PADA KULTUR SINAMBUNG

Biomassa :

Akumulasi = Sel masuk – Sel keluar + Pertumbuhan – Sel mati

(

μ

D

)

X

DX

μX

X

V

F

μX

dt

dX

−

=

−

=

−

=

αX

μX

X

V

F

X

V

F

dt

dX

0

−

+

−

=

0

=

dt

dX

Bila suplai medium steril (X₀ = 0) dan μ >> α, maka

Dalam keadaan setimbang (staedy state), D_crit ≈ μ_max

D mendekati D_crit ⇒ tidak stabil D > μ_max ⇒ wash out

Substrat :

Akumulasi = nutrisi masuk – nutrisi keluar – konsumsi untuk tumbuh

– konsumsi untuk pemeliharaan – konsumsi untuk

sintesis produk

(

)

(

S

_f

−

S

)

=

=

−

−

=

<<

S X S X f S X

Y

x

sehingga

,

0

dt

dS

setimbang,

Saat

Y

μX

S

S

D

dt

dS

maka

produk,

n

pembentuka

ada

dan tidak

,

Y

μX

mX

Bila

S P p S X f Y X q mX Y μX S V F S V F dt dS _{= − − − −}

Kultur Sinambung :

Start-Up

‰ Kultivasi sinambung diawali dengan kultivasi curah

‰ Setelah kultur mencapai fase eksponensial, lalu umpan dimasukkan

‰ Bila komposisi media saat start-up sama dengan umpan, perubahan dari curah ke sinambung menyebabkan

konsentrasi sel atau produk berosilasi (A) Î penyebab : kultur mikroba mengalami hambatan oleh substrat)

Î dicegah dengan komposisi media saat start-up 1/2 umpan

(B)

‰ Penambahan umpan dilakukan kira-kira setelah kons sel ½

kons sel saat “steady-state” (biomassa, substrat & produk tidak berubah dan laju metabolisme sel kontan)

A B

Waktu Waktu

Kons Sel

Kons

Kultur Sinambung :

‰ Model hubungan laju pertumbuhan sel dgn konsentrasi substrat pada kultivasi sinambung Î Model MONOD

µ = S µ_maks K_S + S

Keterangan :

µ = laju pertumbuhan spesifik (jam-1₎

µ_maks = laju pertumbuhan spesifik maksimum (jam-1₎

S = konsentrasi substrat pembatas (g/l)

K_S = kons substrat (g/l) pada saat ½ laju pertumbuhan spesifik maksimum Î menggambarkan efisiensi mikroba dalam

Model yang menghubungkan X, S dan D

(

)

X

D

S

K

.S

μ

X

D

μ

dt

dX

s max

⎟⎟

⎠

⎞

⎜⎜

⎝

⎛

−

+

=

−

=

S

K

.S

μ

μ

s max

+

=

(

)

(

)

_⎟⎟

⎠

⎞

⎜⎜

⎝

⎛

+

−

−

=

−

−

=

S

K

.S

μ

Y

X

S

S

D

Y

μX

S

S

D

dt

dS

S max S X f S X f

Persamaan Saat Tidak Setimbang (Non-Steady State) Biomassa

D

μ

DK

S

maka

,

0

dt

dS

Bila

max S

−

=

=

S

K

S

.

μ

D

D

S max

+

=

=

μ

(

)

f max S f S X f S X

S

dan

D

dari

fungsi

X

D

dari

fungsi

S

D

μ

DK

S

Y

S

S

Y

X

⎟⎟

⎠

⎞

⎜⎜

⎝

⎛

−

−

=

−

=

Persamaan dalam Keadaan Setimbang (Steady State) Substrat

D kritis

D kritis ⇒ D terendah saat mana wash out terjadi

f S f max C f max C

S

K

S

μ

D

S

S

dan

μ

D

+

=

=

=

Aplikasi Kultur Sinambung :

‰ Digunakan untuk penelitian fisiologi dan biokimia mikroba,

dikarenakan kondisinya mantap, laju pertumbuhan dapat diatur oleh laju alir dan laju pertumbuhan dibatasi oleh konsentrasi substrat

pembatas Î dapat digunakan untuk penelitian pengaruh substrat pembatas thd kinerja mikroba, untuk perbaikan sistem curah/semi sinambung

‰ Untuk isolasi dan seleksi mikroba penghasil enzim menggunakan

media diperkaya

‰ Untuk produksi biomassa, contoh ICI (Imperial Chemical Industries,

kapasitas bioreaktor 3000 m3_{, substrat metanol)}

‰ Untuk produksi bir menggunakan bioreaktor menara (tower

KULTUR SEMI SINAMBUNG (FED-BATCH)

„ Media segar ditambahkan ke dalam bioreaktor tanpa pengeluaran isi bioreaktor.

„ Pada kultur

fed batch

, media segar ditambahkan ke dalam bioreaktor tanpa pengeluaran isi bioreaktor secara kontinyu. „ Harus disediakan ruang dalam bioreaktor untuk penambahan

media

„ Pada saat isi bioreaktor penuh, bioreaktor dikosongkan, baik sebagian atau seluruhnya dan proses dimulai kembali.

„ Dapat mengurangi efek represif sumber karbon akibat

penggunaan kons substrat yang tinggi dan mempertahankan kapasitas aerasi dalam bioreaktor

Aplikasi Kultur Semi Sinambung (Fed-Batch)

„ Untuk produksi antibiotika penisilin (metabolit sekunder)

Î - kultivasi 2 tahap : fase pertumbuhan sel cepat dan fase

produksi yang diatur dengan mengatur umpan substrat glukosa - Na-fenilasetat (prekursor) toksik thd

Penicillium chrysogenum

Î pengumpanan harus diatur

„ Untuk memproduksi enzim yang rentan thd represi katabolit

Kultur Curah Semi

Sinambung SinambungKultur

Aliran masuk (F_in)

Aliran keluar (F_out)

F_in = F_out = 0 F_in> 0, F_out = 0 F_in = F_out > 0

Volume kultur Konstan Meningkat Konstan

Pengendalian

kons substrat Tdk mungkin (menurun) Mungkin (konstan) Mungkin (konstan)

Konsentrasi Sel Rendah (<5 g/l)

Kons. tertentu (> 100 g/l)

Kons. tertentu

Konsentrasi

produk Meningkat s.d tk rendah Meningkat s.d tk tinggi Konstan

Kemudahan bagi

pengguna Mudah Agak mudah Sulit

Bahaya

kontaminasi Tidak serius Tidak serius Serius

Kinetika Curah (Batch)

Produksi Etanol oleh bakteri Zymomonas mobilis

Waktu (jam) Biomassa (g/l) Glukosa (g/l) Etanol (g/l) ln biomassa 5 0,05 247 1,5 -2,99573 9 0,15 240 5 -1,89712 14 0,45 225 12 -0,79851 18 1,2 195 22 0,182322 22 2,8 130 47 1,029619 24 3,4 100 63 1,223775 26 3,8 75 74 1,335001 30 4,15 40 90 1,423108 35 4,2 25 100 1,435085

Fase eksponensial = 5 – 22 jam

kurva pertumbuhan

-4 -3 -2 -1 0 1 2 5 9 14 18 22 24 26 30 35 Waktu (jam ) ln X ( g /L )

Laju Pertumb. Spesifik maks (μ

_maks

) = 0,24 Jam

-1

Penent Laju Pertumb. Spesifik

y = 0,2355x - 4,0992 R2 _{= 0,9984} -4 -3 -2 -1 0 1 2 0 5 10 15 20 25 Waktu (jam ) L n B io m assa ( g /l)

Waktu

(jam) (X-Xo) (So-S) (P-Po)

5 0 0 0 9 0,1 7 3,5 14 0,4 22 10,5 18 1,15 52 20,5 22 2,75 117 45,5 24 3,25 147 61,5 26 3,75 172 72,5 30 4,1 207 88,5 35 4,15 222 98,5

Yp/s = 0,38 g etanol/g substrat

Yp/s

y = 0,3827x + 0,8447 R2 _{= 0,9983} 0 10 20 30 40 50 0 50 100 150 (So-S) g/l (P -P o ) g /l

Yx/s = 0,03 g etanol/g substrat

Yx/s

y = 0,0273x + 0,4472 R2 _{= 0,8583} 0 1 2 3 4 0 50 100 150 (So-S) g/l (X -X o) g/ l

Yp/x = 12,047 g etanol/g biomassa

Yp/x

y = 12,047x - 2,4313 R2 _{= 0,8615} -20 0 20 40 60 0 1 2 3 4 (X-Xo) g/l (P -P o) g/ l