PENGARUH BERBAGAI MODEL LATIHAN TERHADAP EKSPRESI GEN 5’AMP- ACTIVATED PROTEIN KINASE Α2 DAN GLUCOSE TRANSPORTER 4 PADA
TIKUS MODEL DIABETES MELLITUS TIPE-2
TESIS Oleh : Rahmi 177008006
PROGRAM STUDI MAGISTER ILMU BIOMEDIK FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA 2020
PENGARUH BERBAGAI MODEL LATIHAN TERHADAP EKSPRESI GEN 5’AMP-ACTIVATED PROTEIN KINASE Α2 DAN GLUCOSE TRANSPORTER 4 PADA TIKUS MODEL DIABETES MELLITUS TIPE-2
TESIS
Diajukan untuk melengkapi persyaratan memperoleh Gelar Magister Biomedik dalam Program Studi Ilmu Biomedik pada Fakultas Kedokteran
Universitas Sumatera Utara
Oleh:
Rahmi 177008006
PROGRAM STUDI MAGISTER ILMU BIOMEDIK FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA 2020
Telah diuji pada
Tanggal : 13 Januari 2021
PANITIA PENGUJI TESIS:
Ketua : Dr. dr. Yetty Machrina, M.Kes Anggota : dr. Zulham, M.Biomed, Ph.D
dr. Tri Widyawati, M.Si., Ph.D Dr. dr. Rina Amelia, MARS
PENGARUH BERBAGAI MODEL LATIHAN TERHADAP EKSPRESI GEN 5’AMP-ACTIVATED PROTEIN KINASE Α2 DAN GLUCOSE TRANSPORTER 4 PADA TIKUS MODEL DIABETES MELLITUS TIPE-2
Abstrak
Salah satu penyebab peningkatan prevalensi Diabetes Mellitus Tipe 2 (DM Tipe-2) adalah penurunan aktivitas fisik. Olahraga menjadi pilar utama dalam pengelolaan Diabetes. Mekanisme pengambilan glukosa yang dimediasi oleh olahraga berbeda dengan insulin, dan mekanisme tersebut tidak terganggu pada penderita DM Tipe- 2. Salah satu mekanismenya adalah melalui aktivasi 5’AMP-activated protein kinase (AMPK). AMPK tidak hanya dapat meningkatkan translokasi glucose transporter 4 (GLUT4), tetapi juga meregulasi ekspresi GLUT4. Strategi olahraga yang paling efektif pada DM Tipe-2 belum ditetapkan. Olahraga aerobik terdiri dari tipe continuous dan interval. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh berbagai model latihan fisik terhadap ekspresi Ampk α2 dan Glut 4 di otot rangka.
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni dengan desain penelitian posttest with control group. Penelitian ini menggunakan bahan biologi tersimpan berupa otot rangka tikus wistar model DM Tipe-2 sebanyak 25 ekor yang dibagi atas K1 (kontrol) tidak diberikan latihan, K2 latihan continuous intensitas sedang, K3 latihan continuous intensitas berat, K4 latihan interval tipe lambat, dan K5 latihan interval tipe cepat. Latihan berupa berlari di atas treadmill frekuensi 3 kali seminggu selama 8 minggu. Ekspresi Ampk α2 dan Glut 4 dinilai dengan metode Real Time PCR. Analisis data menggunakan uji one way Anova, Kruskal Wallis, dan rumus Livak. Nilai ∆Ct Ampk α2 dan Glut 4 pada tiap kelompok tidak berbeda bermakna (p= 0,737 dan p= 0,909). Dari rumus Livak didapat peningkatan ekspresi terbesar terjadi pada K5 dengan peningkatan ekspresi Ampk α2 4,56 kali dan ekspresi Glut 4 meningkat 4,79 kali dibandingkan K1. Kesimpulan: latihan tipe continuous dan interval meningkatkan ekspresi Ampk α2 dan Glut 4. Peningkatan ekspresi terbesar terjadi pada latihan interval tipe cepat.
Kata kunci : olahraga aerobik, ekspresi gen AMPK, GLUT4, DM Tipe-2, tikus
THE EFFECT OF VARIOUS TRAINING MODELS ON THE EXPRESSION OF THE 5'AMP-ACTIVATED PROTEIN KINASE Α2 AND GLUCOSE
TRANSPORTER 4 IN TYPE-2 DIABETES MELLITUS MODEL RATS
Abstract
One of the causes of the increasing prevalence of Type 2 Diabetes Mellitus (T2DM) is lack of physical activity. Exercise is the main pillar in Diabetes management. The mechanism of glucose uptake mediated by exercise is different from insulin, and this mechanism is not disturbed in T2DM. One of the mechanisms is through the activation of 5'AMP-activated protein kinase (AMPK). AMPK not only increase the translocation of glucose transporter 4 (GLUT4), but also regulate GLUT4 expression. The most effective exercise strategy in T2DM has not been established.
Aerobic exercise consists of continuous and interval training. This study aims to determine the effect of various physical exercise models on the expression of Ampk α2 and Glut 4 in skeletal muscle. This research is a true experimental with a posttest design with a control group. This study uses skeletal muscles stored biological material of 20 rat Wistar T2DM divided into K1 (control) not given exercise, K2 moderate continuous training, K3 severe continuous training, K4 slow interval training, and K5. fast interval training. Running on a treadmill frequency 3 times a week for 8 weeks. The relative expression of Ampk α2 and Glut 4 was assessed by the Real Time PCR method and the results were compared between the treatment group and the control group. Data analysis using Kruskal Wallis and Livak formula. The values of ∆Ct Ampk α2 and Glut 4 in each group were not significantly different (p = 0.309 and p = 0.909). From the Livak formula, it was found that the largest increase in expression occurred in K5 with an increase in the expression of Ampk α2 4.56 times and the expression of Glut 4 increased 4.79 times compared to K1. Conclusion: continuous and interval training increase the expression of Ampk α2 and Glut 4. The greatest increase in expression occurs in fast interval training.
Keyword: aerobic exercise, AMPK and GLUT4 expression, Type 2 Diabetes Mellitus, rat
KATA PENGANTAR
Penulis mengucapkan puji dan syukur kepada Allah SWT yang telah memberikan rahmat dan kasih sayangNya kepada penulis sehingga penulis dapat menyelesaikan penulisan tesis ini.
Selama melakukan penulisan tesis ini penulis banyak memperoleh bantuan moril dan materil dari berbagai pihak. Oleh karena itu, pada kesempatan ini penulis menyampaikan ucapan terima kasih yang tulus kepada:
1. Dr. dr. Yetty Machrina, M.Kes selaku Ketua Komis Pembimbing yang telah mengizinkan menggunakan bahan biologi tersimpan beliau, membimbing dan mengarah penulis dalam menyelesaikan tesis ini
2. dr. Zulham, M.Biomed, Ph.D selaku Anggota Komisi Pembimbing yang membimbing dan mengarah penulis dalam menyelesaikan tesis ini
3. dr. Tri Widyawati, M.Si, Ph.D dan Dr. dr. Rina Amelia, MARS selaku Komisi Pembanding atas saran dan kritik yang telah diberikan
4. dr. rer. medic. M. Ichwan, M.Sc selaku Ketua Program Studi Magister Ilmu Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara atas bimbingan dan arahan selama masa studi.
5. Staf Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara yang telah membantu dan mendampingi selama proses penelitian.
6. Seluruh keluarga besar saya, terutama suami saya dr. Zul Bahri, kedua anak saya Abrar Faruqi dan Fathimah Azzahra. Keempat orang tua saya, (Alm) M. Yusuf AR dan Jasmani AM, (Alm) Samsul Bahri dan Nuriyani. Terima kasih atas kasih sayang dan pengertian yang luar biasa, dukungan moril dan materil serta doa yang tidak henti dipanjatkan selama saya menempuh masa studi.
7. Teman-teman mahasiswa Ilmu Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara dalam membantu dan mendukung penulisan tesis ini.
Penulis menyadari tesis ini masih banyak memiliki kekurangan dan jauh dari sempurna. Namun, harapan penulis semoga tesis ini bermanfaat kepada seluruh pembaca.
Medan, 11 Desember 2020 Penulis,
Rahmi
DAFTAR RIWAYAT HIDUP Biodata Pribadi
Nama Lengkap : Rahmi
NIM : 177008006
Tempat/Tanggal Lahir : Kisaran / 8 April 1989 Jenis kelamin : Perempuan
Bangsa : Indonesia
Agama : Islam
Status Perkawinan : Menikah
Tempat Tinggal : Jl. Taqwa no. 2A, Medan
Email/No.HP : [email protected] / 081362082370 Riwayat Pendidikan
a. SD : SD Negeri 1 Langsa
Ijazah Tahun : 2001
b. SMP : SMP Negeri 1 Langsa Ijazah Tahun : 2004
c. SMA : SMA Negeri 1 Medan Ijazah Tahun : 2007
d. Strata Pertama (S1) : Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara Ijazah Tahun : 2012
Riwayat Pekerjaan
a. Dokter Internship RSUD Sultan Sulaiman Serdang Bedagai (2013-2014) b. Dokter Umum RSUD M. Djoelham Kota Binjai (2015-2017)
DAFTAR ISI
ABSTRAK... iii
KATA PENGANTAR... v
RIWAYAT HIDUP... vi
DAFTAR ISI... vii
DAFTAR GAMBAR... ix
DAFTAR TABEL... x
DAFTAR SINGKATAN... xi
BAB I PENDAHULUAN... 1
1.1. Latar Belakang... 1
1.2. Rumusan Masalah... 5
1.3. Tujuan Penelitian... 5
1.4. Manfaat Penelitian... 6
BAB II TINJAUAN PUSTAKA... 7
2.1.Diabetes Mellitus Tipe-2... 7
2.1.1. Klasifikasi dan Diagnosis Diabetes... 7
2.1.2. Patogenesis Diabetes Mellitus Tipe-2... 8
2.1.3. Penatalaksanaan Diabetes Mellitus Tipe-2...11
2.1.4. Manjamenen Olahraga pada Diabetes Mellitus Tipe-2...11
2.2.5’AMP-activated protein kinase... 12
2.2.1. Struktur dan Aktivasi AMPK... 12
2.2.2. Pengambilan Glukosa oleh AMPK... 16
2.3.Glucose Transporter 4... 19
2.4.Olahraga... 22
2.4.1. Metabolisme Olahraga... 24
2.4.2. Olahraga Aerobik... 27
2.5.AMPK dan Olahraga... 28
2.6.Latihan Treadmill pada Tikus ... 29
2.7.Model Hewan Coba Diabetes Mellitus ... 30
2.8.Kerangka Teori... 32
2.9.Kerangka Konsep ... 34
2.10. Hipotesis Penelitian... 35
BAB III METODE PENELITIAN... 36
3.1. Rancangan Penelitian... 36
3.2. Waktu dan Tempat Penelitian... 36
3.3. Populasi dan Sampel Penelitian... 36
3.4. Teknik Pengambilan Sampel dan Besar Sampel... 36
3.5. Variabel Penelitian... 38
3.6. Definisi Operasional... 38
3.7. Bahan, Alat, dan Cara Kerja... 40
3.8. Pengolahan dan Analisis Data... 46
3.9. Alur Penelitian ... 47
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN... 48
4.1. Hasil... 48
4.1.1. Karakteristik Bahan Biologi Tesimpan... 48
4.1.2. Pengaruh Latihan Continuous Intensitas Sedang terhadap Ekspresi Ampk α2 dan Glut 4 pada Tikus Model DM Tipe-2... 48
4.1.3. Pengaruh Latihan Continuous Intensitas Berat terhadap Ekspresi Ampk α2 dan Glut 4 pada Tikus Model DM Tipe- 2... 50
4.1.4. Pengaruh Latihan Interval Tipe Lambat terhadap Ekspresi Ampk α2 dan Glut 4 pada Tikus Model DM Tipe-2... 51
4.1.5. Pengaruh Latihan Interval Tipe Cepat terhadap Ekspresi Ampk α2 dan Glut 4 pada Tikus Model DM Tipe-2... 53
4.1.6. Perbedaan Pengaruh Berbagai Model Latihan Fisik terhadap Ekspresi Ampk α2 dan Glut 4 pada Tikus Model DM Tipe-2... 54
4.2. Pembahasan... 57
4.2.1. Kemurnian RNA Sampel... 56
4.2.2. Pengaruh Latihan Fisik Terhadap Ekspresi Ampk α2 ... 57
4.2.3. Pengaruh Latihan Fisik Terhadap Ekspresi Glut 4... 60
4.3. Keterbatasan Penelitian... 63
BAB V KESIMPULAN 5.1. Kesimpulan... 64
5.2. Saran... 64
DAFTAR PUSTAKA... 65 LAMPIRAN
DAFTAR GAMBAR
Gambar 2.1 Disfungsi mitokondria dan resistensi insulin... 10 Gambar 2.2 Struktur dan Fungsi Isoform AMPK... 14 Gambar 2.3 Regulasi AMPK dan Konsekuensi Metabolik dari AMPK yang teraktivasi... 15 Gambar 2.4 Hubungan antara jalur insulin dan jalur kontraksi otot pada saat Olahraga... 17 Gambar 2.5 Regulasi pengambilan glukosa pada saat kontraksi otot... 19 Gambar 2.6 Representasi respons elemen penting pada promoter
GLUT4...21 Gambar 2.7 Efek Olahraga terhadap Ekspresi GLUT4 ... 22 Gambar 2.8 Metabolisme Energi di Otot Rangka... 25 Gambar 2.9 Interaksi Sistem Energi dan Perbedaan laju turnover ATP selama Olahraga... 26 Gambar 2.10 Kerangka Teori ... 32 Gambar 3.1 Alur Penelitian ... 49 Gambar 4.1 Perubahan Ekspresi Ampk α2 Kelompok 2 terhadap Kelompok 1 ... 50 Gambar 4.2 Perubahan Ekspresi Glut 4 Kelompok 2 Terhadap Kelompok 1.... 50 Gambar 4.3 Perubahan Ekspresi Ampk α2 Kelompok 3 terhadap Kelompok...51 Gambar 4.4 Perubahan Ekspresi Glut 4 Kelompok 3 Terhadap Kelompok 1.... 52 Gambar 4.5 Perubahan Ekspresi Ampk α2 Kelompok 4 terhadap Kelompok 1 ...53 Gambar 4.6 Perubahan Ekspresi Glut 4 Kelompok 4 Terhadap Kelompok 1.... 53 Gambar 4.7 Perubahan Ekspresi Ampk α2 Kelompok 5 terhadap Kelompok 1... 54 Gambar 4.8 Perubahan Ekspresi Glut 4 Kelompok 5 Terhadap Kelompok 1.... 55 Gambar 4.9 Perubahan Ekspresi Ampk α2 Tiap Kelompok terhadap Kelompok 1... 56
Gambar 4.10 Perubahan Ekspresi Glut 4 Tiap Kelompok Terhadap Kelompok 1... 56
DAFTAR TABEL
Tabel 2.1 Klasifikasi Intensitas Olahraga... 24 Tabel 4.1 Kemurnian RNA hasil ekstraksi dan cDNA construct dengan 2 steps RT-PCR ... 48 Tabel 4.2 Perbandingan Nilai ∆Ct Ampk α2 pada K1 dan K2 dengan Uji T
Tidak Berpasangan... 49 Tabel 4.3 Perbandingan Nilai ∆Ct Glut 4 pada K1 dan K2 dengan Uji Mann-
Whitney... 49 Tabel 4.4 Perbandingan Nilai ∆Ct Ampk α2 pada K1 dan K3 dengan Uji T
Tidak Berpasangan... 51 Tabel 4.5 Perbandingan Nilai ∆Ct Glut 4 pada K1 dan K3 dengan Uji Mann-
Whitney... 51 Tabel 4.6 Perbandingan Nilai ∆Ct Ampk α2 pada K1 dan K4 dengan Uji T
Tidak Berpasangan... 52 Tabel 4.7 Perbandingan Nilai ∆Ct Glut 4 pada K1 dan K4 dengan Uji Mann-
Whitney... 52 Tabel 4.8 Perbandingan Nilai ∆Ct Ampk α2 pada K1 dan K5 dengan Uji Mann- Whitney... 54 Tabel 4.9 Perbandingan Nilai ∆Ct Glut 4 pada K1 dan K5 dengan Uji Mann- Whitney... 54 Tabel 4.10 Perbandingan Nilai ∆Ct Ampk α2 dengan Uji Kruskal
Wallis... 55 Tabel 4.11 Perbandingan Nilai ∆Ct Glut 4 dengan Uji Kruskal Wallis... 55
DAFTAR SINGKATAN AMPK 5’AMP-activated protein kinase
ADP Adenosine Diphosphate AMP Adenosie Monophosphate ATP Adenosine Triphosphate AS160 Akt Substrate 160 DGA Diacylglycerol
GEF Glut4 enhancer factor GLUT4 Glucose Transporter 4 HDAC5 Histone deacetylase 5 IRS Insulin Receptor Substrate KLF15 Krupfell like factor 15 MEF2 Myocyte enhancer factor 2 PI3K Phosphatidylinositol-3-kinase PKC Protein Kinase C
PP2A Protein Phosphatase 2A
PTP-1B Protein tyrosine phosphatase 1B
TBC1D1 Tre2-Bub2-Cdc16 domain family member 1 TBC1D4 Tre2-Bub2-Cdc16 domain family member 4 TRa1 Thyroid receptor a1
STZ Streptozotosin
BAB 1 PENDAHULUAN
1.1.Latar Belakang
Prevalensi Diabetes Mellitus Tipe-2 (DM Tipe-2) terus meningkat setiap tahun. International Diabetes Federation (IDF, 2019) menyebutkan bahwa pada tahun 2019, DM Tipe-2 telah mengenai lebih dari 387 juta orang seluruh dunia dan pada tahun 2045 diperkirakan mencapai 700 juta jiwa. Indonesia juga menghadapi situasi ancaman serupa dengan peningkatan prevalensi dari 6,9% di tahun 2013 menjadi 8,5% di tahun 2018; sehingga estimasi jumlah penderita di Indonesia mencapai lebih dari 16 juta orang pada tahun 2018 (Kementrian Kesehatan Republik Indonesia, 2018). Salah satu sebab peningkatan ini adalah penurunan aktivitas fisik (Neill, 2013; Sharabi et al., 2015).
DM Tipe-2 dicirikan oleh resistensi insulin, kondisi di mana sel tidak mampu berespons terhadap insulin, terutama terjadi di otot rangka, hati, dan adiposa. Otot rangka menjadi tempat utama penyimpanan glukosa post prandial.
Sekitar 90% pengambilan glukosa yang distimulasi insulin terjadi di otot rangka (DeFronzo and Tripathy, 2009). Oleh karena itu, resistensi insulin pada otot rangka berperan penting dalam perkembangan DM Tipe-2 (Abdul-Ghani and Defronzo, 2010).
Insulin menstimulasi pengambilan glukosa di otot rangka dengan metranslokasikan vesikel intraseluler berisi glucose transporter 4 (GLUT4) untuk berintegrasi ke membran plasma (Nicholas, Conn and Vaughan, 2014). Jumlah GLUT4 di otot rangka berperan untuk menentukan transpor glukosa maksimal (Koh et al., 2019). Kampmann et al., (2011) menunjukkan penurunan sekitar 30%
jumlah protein GLUT4 pada otot pasien DM Tipe-2. Carvalho et al., (2001) pula menemukan bahwa ekspresi GLUT4 menurun sekitar 60% pada penderita DM Tipe-2. Akibatnya, pengambilan glukosa darah pada penderita DM Tipe-2 menurun dan menyebabkan hiperglikemia (Leguisamo, 2012).
Olahraga menjadi salah satu pilar utama pengelolaan DM Tipe-2 (PERKENI, 2015). Olahraga dan kontraksi otot menstimulasi pengambilan glukosa melalui mekanisme yang berbeda dengan yang diperantarai insulin (Richter and Hargreaves, 2013). Pada penderita DM Tipe-2, pengambilan glukosa yang dimediasi insulin mengalami gangguan namun pengambilan glukosa yang dimediasi olahraga adalah normal atau hampir normal. Oleh karena itu, mekanisme pengambilan glukosa yang dimediasi oleh olahraga menjadi penting untuk mengelola DM Tipe-2 (Stanford and Goodyear, 2014).
Aktivasi 5’AMP-activated protein kinase (AMPK) merupakan salah satu mekanisme bebas insulin yang dimediasi oleh olahraga. AMPK merupakan protein kinase heterotrimerik yang terdiri dari tiga subunit α, β, dan γ, yang dikode oleh gen-gen yang berbeda (α1, α2, β1, β2, γ1, γ2, dan γ3). AMPK diaktifkan oleh stres energi sebagai respons terhadap peningkatan konsumsi ATP atau penurunan produksi ATP, berupa rasio rendah dari ATP terhadap AMP dan ADP (Yan et al., 2018). Saat berolahraga, jumlah ADP dan AMP meningkat secara cepat sedangkan ATP sedikit menurun, akan mengaktifkan AMPK dan menstimulasi pengambilan glukosa dengan mentranslokasikan GLUT4 ke membran plasma (Richter and Ruderman, 2010; Pereira and Sanchez, 2017).
Pada saat olahraga hanya kompleks α2β2γ1 dan α2β2γ3 yang teraktivasi dan menyebabkan pengambilan glukosa oleh otot (Lantier et al., 2014). Olahraga lebih
mengaktifkan subunit α2 dibandingkan α1 (Jørgensen, S.B., Jensen, T.E., and Richter, 2007) sebab aktivasi subunit α2 lebih bergantung pada konsentrasi AMP.
Gong et al., (2011) menyebutkan bahwa olahraga, melalui mediasi AMPK α2, dapat meningkatkan ikatan faktor transkripsi GLUT4 ke promotor. Selain itu, aktivasi subunit α2 dibutuhkan untuk fosforilasi AS160 yang berperan dalam pengambilan glukosa (Treebak and Wojtaszewski, 2008).
AMPK juga meregulasi ekspresi GLUT4 (Pereira and Sanchez, 2017). Hal ini didukung oleh temuan bahwa olahraga, melalui aktivasi AMPK, dapat meningkatkan ekspresi GLUT4 di otot rangka (Mcgee et al., 2008; Hussey et al., 2011; Cao et al., 2012). Olahraga meningkatkan Glut4 sebanyak 1,7 kali pada tikus normal dan 2,3 kali pada tikus obese, dibandingkan pada tikus sedenter (Holmes and Dohm, 2004). Peningkatan ekspresi Glut4 otot rangka dapat memperbaiki kontrol gula darah pada DM Tipe-2 (Hansen et al., 2015).
Strategi olahraga yang paling efektif pada DM Tipe-2 belum ditetapkan (Francois and Little, 2015). American Diabetes Association (2019) merekomendasikan olahraga aerobik minimal 150 menit per minggu dengan intensitas sedang sampai berat. Olahraga aerobik dapat dilakukan dengan metode continuous dan interval (Spanoudaki, 2011), kedua metode tersebut efektif dalam meningkatkan kontrol glikemik (Mitranun et al., 2014). Olahraga continuous dapat dilakukan dengan intensitas ringan, sedang, dan berat. Olahraga interval dapat dilakukan dengan tipe lambat yang setara dengan intensitas sedang dan tipe cepat yang setara dengan intensitas berat (Harsono, 1988).
Olahraga tipe continuous lebih sering direkomendasikan sebagai pilihan olahraga aerobik (Álvarez et al., 2016). Namun, olahraga aerobik berintensitas
berat secara continuous dalam durasi lama dapat berisiko dan sulit dilakukan pada pasien dengan penyakit kronis seperti DM Tipe-2 (Mitranun et al., 2014). Olahraga aerobik tipe interval dapat menjadi alternatif karena dapat dilakukan dengan durasi yang lebih pendek dan intensitas yang lebih besar daripada olahraga continuous.
Olahraga aerobik tipe interval menginduksi adaptasi kardiometabolik yang mirip dengan olahraga tipe continuous dan mempunyai manfaat lebih superior dibandingkan olahraga continuous pada pasien DM Tipe-2 (De Nardi et al., 2018).
Olahraga interval menggunakan metode fase olahraga – istirahat – olahraga – istirahat. Adanya fase istirahat diantara olahraga memberikan waktu untuk mengembalikan sumber energi seperti fosfokreatin dan ATP (Mazoochi, 2016).
Olahraga tipe interval mengubah rasio AMP/ATP secara cepat sehingga meningkatkan aktivitas AMPK dan peningkatannya 2,9 kali dibandingkan olahraga continuous (Gibala et al., 2009; Combes et al., 2015).
Pengaruh latihan continuous dan interval dengan intensitas sedang-berat terhadap ekspresi AMPK dan GLUT4 pada DM Tipe-2 belum banyak diketahui.
Penelitian pada tikus model DM Tipe-2 menunjukkan bahwa latihan interval dengan intensitas berat dapat lebih meningkatkan jumlah Glut4 dibandingkan latihan continuous dengan intensitas sedang, tetapi aktivitas AMPK tidak berbeda diantara keduanya (Chavanelle et al., 2017). Menurut Afzalpour et al., (2016) latihan continuous dan interval mengakibatkan peningkatan jumlah Glut4 dan Ampk yang sama pada tikus model DM Tipe-2. Penelitian ini akan mengkaji pengaruh berbagai model latihan, yaitu latihan continuous intensitas sedang, latihan continuous intensitas berat, latihan interval tipe cepat, dan latihan interval tipe
lambat terhadap ekspresi Ampk α2 dan Glut4 pada tikus galur wistar model DM Tipe-2.
1.2.Rumusan Masalah
Berdasarkan uraian pada latar belakang, rumusan masalah adalah sebagai berikut :
1. Apakah terdapat pengaruh latihan continuous intensitas sedang terhadap ekspresi Ampk α2 dan Glut4 pada tikus galur wistar model DM Tipe-2?
2. Apakah terdapat pengaruh latihan continuous intensitas berat terhadap ekspresi Ampk α2 dan Glut4 pada tikus galur wistar model DM Tipe-2?
3. Apakah terdapat pengaruh latihan interval tipe lambat terhadap ekspresi Ampk α2 dan Glut4 pada tikus galur wistar model DM Tipe-2?
4. Apakah terdapat pengaruh latihan interval tipe cepat terhadap ekspresi Ampk α2 dan Glut4 pada tikus galur wistar model DM Tipe-2?
5. Apakah terdapat perbedaan pengaruh antara latihan continuous intensitas sedang, latihan continuous intensitas berat, latihan interval tipe cepat, dan latihan interval tipe lambat pada tikus galur wistar model DM Tipe-2?
1.3.Tujuan Penelitian 1.3.1. Tujuan Umum
Tujuan umum penelitian ini adalah untuk menganalisis berbagai pengaruh model latihan terhadap ekspresi Ampk α2 dan Glut4 pada tikus galur wistar model DM Tipe-2.
1.3.2. Tujuan Khusus
Berdasarkan rumusan masalah, tujuan khusus penelitian ini adalah untuk menentukan:
1. Pengaruh latihan continuous intensitas sedang terhadap ekspresi Ampk α2 dan Glut4 pada tikus galur wistar model DM Tipe-2
2. Pengaruh latihan continuous intensitas berat terhadap ekspresi Ampk α2 dan Glut4 pada tikus galur wistar model DM Tipe-2
3. Pengaruh latihan interval tipe lambat terhadap ekspresi Ampk α2 dan Glut4 pada tikus galur wistar model DM Tipe-2
4. Pengaruh latihan interval tipe cepat terhadap ekspresi Ampk α2 dan Glut4 pada tikus galur wistar model DM Tipe-2
5. Perbedaan pengaruh antara latihan continuous intensitas sedang, latihan continuous intensitas berat, latihan interval tipe cepat, dan latihan interval tipe lambat terhadap ekspresi Ampk α2 dan Glut4 pada tikus galur wistar model DM Tipe-2
1.4.Manfaat Penelitian
1. Memberikan informasi mengenai peran AMPK dalam memediasi pengambilan glukosa saat olahraga.
2. Menjadi bahan pertimbangan dalam menentukan jenis olahraga yang sesuai bagi penderita DM Tipe-2.
3. Sebagai landasan untuk penelitian selanjutnya.
BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Diabetes Mellitus Tipe-2
Diabetes Mellitus Tipe 2 (DM Tipe-2) merupakan suatu kelompok penyakit metabolik dengan karakteristik hiperglikemia yang terjadi karena kelainan sekresi insulin, kerja insulin atau kedua-duanya (PERKENI, 2015). Pada tahun 2019 sekitar 463 juta dewasa (20-79 tahun) di dunia menderita DM Tipe-2, dan di tahun 2045 diperkirakan mencapai 700 juta jiwa. Peningkatan proporsi individu dengan DM Tipe-2 meningkat hampir di seluruh negara. DM Tipe-2 menyebabkan 4,2 juta kematian di seluruh dunia, dan sebanyak 374 juta orang berisiko untuk mengalami DM Tipe-2 (IDF, 2019).
Indonesia juga menghadapi situasi ancaman serupa. Indonesia adalah negara peringkat ketujuh di dunia dengan jumlah penderita DM Tipe-2 sekitar 10,7 juta orang (IDF, 2019). Riset Kesehatan Dasar memperlihatkan peningkatan angka prevalensi DM Tipe-2 yang cukup signifikan, yaitu dari 6,9% di tahun 2013 menjadi 8,5% di tahun 2018; sehingga estimasi jumlah penderita di Indonesia mencapai lebih dari 16 juta orang (Riskesdas, 2018). Peningkatan prevalensi ini diakibatkan oleh penurunan aktivitas fisik akibat teknologi yang mendukung gaya hidup sedenter dan konsumsi makanan yang berlebihan yang dikombinasikan dengan predisposisi genetik (Neill, 2013; Sharabi et al., 2015)
2.1.1. Klasifikasi dan Diagnosis Diabetes
Klasifikasi etiologis Diabetes adalah Diabetes mellitus tipe 1, Diabetes mellitus tipe 2, Diabetes mellitus tipe lain, dan Diabetes mellitus gestasional (PERKENI, 2015). Diagnosis DM Tipe-2 ditegakkan atas dasar pemeriksaan kadar glukosa darah, yaitu sebagai berikut:
a) Pemeriksaan glukosa plasma puasa ≥ 126 mg/dL. Puasa adalah kondisi tidak ada asupan kalori minimal 8 jam, atau
b) Pemeriksaan glukosa plasma ≥ 200 mg/dL 2 jam setelah Tes Toleransi Glukosa Oral dengan beban glukosa 75 g, atau
c) Pemeriksaan glukosa plasma sewaktu ≥ 200 mg/dL dengan keluhan klasik, atau
d) Pemeriksaan HbA1C ≥ 6,5% dengan menggunakan metode yang terstandarisasi oleh National Glycohaemoglobin Standarization Program . 2.1.2. Patogenesis Diabetes Mellitus Tipe-2
Pada DM Tipe-2 terjadi resistensi insulin di jaringan metabolik seperti jaringan adiposa, hati, dan otot (DeFronzo and Tripathy, 2009). Resistensi insulin merupakan keadaan ketidakmampuan sel untuk berespons terhadap sinyal insulin (Nicholas, Conn and Vaughan, 2014). Hal ini menyebabkan sel β pankreas mensekresikan insulin lebih banyak, yang disebut sebagai hiperinsulinemia kompensasi. Bersamaan dengan resistensi insulin, dapat terjadi deplesi sel β, yang menyebabkan hiperglikemia berkepanjangan dan DM Tipe-2 (Samuel and Shulman, 2016).
Insulin menginduksi pengambilan glukosa melalui jalur yang kompleks yang diinisiasi dengan ikatan insulin dengan reseptor insulin. Pengambilan glukosa di otot terjadi melalui difusi difasilitasi, yang bergantung pada ketersediaan glucose transporter 4 (GLUT4) di membran plasma (Richter and Hargreaves, 2013). Dalam keadaan basal (tidak ada stimulus insulin), sebagian besar GLUT4 tersimpan di dalam vesikel intrasel dalam keadaan diam, menunggu adanya sinyal yang merekrut mereka (Pereira and Sanchez, 2017). Insulin mengontrol homeostasis glukosa
dengan meregulasi translokasi GLUT4 dari intraseluler ke membran plasma Gangguan pada pada jalur yang mencetuskan translokasi GLUT4 dapat menyebabkan resistensi insulin (Moreli, Tewari and Benite-ribeiro, 2015).
Pada beberapa sindrom kronis yang berhubungan dengan obesitas, seperti DM Tipe-2 dan sindrom metabolik, terjadi peningkatan kadar asam lemak yang bersirkulasi dalam darah. Sel otot yang terpapar dengan kadar asam lemak yang tinggi menyebabkan resistensi insulin. Jenis asam lemak yang berperan adalah asam lemak jenuh rantai panjang dan asam stearat (Martins et al., 2012).
Terdapat beberapa mekanisme bagaimana asam lemak jenuh dapat menganggu kerja insulin. Asam lemak dapat menghambat sinyal insulin dengan mengaktivasi berbagai kinase seperti protein kinase C (PKC), IkappaB kinase ( IKK), c-jun terminal amino kinase (JNK), dan p38 mitogen activated protein kinase (MAP kinase). Enzim ini dapat menurunkan fosforilasi Insulin Receptor Substrate- 1 (IRS-1) oleh insulin. Selain itu, jumlah lemak yang bersirkulasi yang melebihi kemampuan pengambilan dan penyimpanan jaringan lemak menyebabkan akumulasi di jaringan lain, seperti otot (Martins et al., 2012). Akumulasi asam lemak di otot menurunkan fungsi mitokondria dalam mengoksidasi asam lemak (Moreli, Tewari and Benite-ribeiro, 2015).
Asam lemak yang berakumulasi di intraseluler miosit terutama adalah long- chain fatty acyl-CoA, monoacylglycerol, diacylglycerol, phosphatidic acid, triacylglycerol, dan ceramid. Di antara asam lemak tersebut dan turunannya, diacylglycerol dan ceramid secara langsung berhubungan menghambat sinyal insulin (Gambar 2.1) (Martins et al., 2012). Diacylglycerol dapat mempromosikan aktivasi PKC yang menginhibisi reseptor insulin (Samuel, Petersen and Shulman,
2010). Peningkatan ceramid intraseluler menyebabkan aktivasi protein phosphatase 2A (PP2A), yang memdefosforilasi dan inaktivasi Akt dan penurunan aktivitas phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) , sehingga menghambat sinyal insulin (Holland et al., 2011). Jalur PI3K adalah komponen kunci dalam kaskade sinyal insulin, yang penting untuk translokasi GLUT4. Penurunan aktivitas PI3K yang distimulasi insulin ternyata menurun pada otot rangka pasien DM Tipe-2.
Perubahan ini menyebabkan penurunan pengambilan glukosa dari darah ke sel otot (Choi and Kim, 2010).
Gambar 2.1 Disfungsi mitokondria dan resistensi insulin.
Kadar asam lemak bebas dalam plasma. Disfungsi mitkondria menurunkan oksidasi lemak, menyebabkan akumulasi asam lemak bebas dan lemak. Akumulasi asam lemak yang diikuti dengan peningkatan diacylglycerol (DGA) dan ceramid dapat menghambat sinyal insulin. DGA mengaktivasi PKC yang dapat menginhibisi reseptor insulin. Ceramid menyebabkan defosforilasi Akt melalui aktivasi protein phosphatase 2A (PP2A) (Gutierrez-Rodelo, Roura-Guiberna and Olivares-Reyes, 2017).
2.1.3.Penatalaksanaan Diabetes Mellitus Tipe-2
Pilar utama dalam manajemen DM Tipe-2 adalah menerapkan pola hidup sehat, termasuk diet sehat, aktivitas fisik yang reguler, tidak merokok, dan mempertahankan berat badan tubuh yang normal. Jika perubahan gaya hidup tidak cukup untuk mengontrol kadar gula darah, maka dilakukan intervensi farmakologi Apabila obat-obatan oral tidak dapat mengontrol hiperglikemia, injeksi insulin mungkin diperlukan (PERKENI, 2015; IDF, 2019).
2.1.4 Manajemen Olahraga pada Diabetes Mellitus Tipe-2
Aktivitas fisik adalah istilah umum yang meliputi semua pergerakan yang meningkatkan penggunaan energi. Olahraga adalah bentuk spesifik dari aktivitas fisik, yang terstruktur dan didesain untuk meningkatkan kebugaran fisik. Keduanya berperan penting dalam manajemen penatalaksanaan DM. Semua individu, terutama penderita DM harus mengurangi jumlah waktu sedenter (seperti bekerja di komputer, menonton TV) lebih dari 30 menit, dengan cara berdiri cepat, berjalan, atau melakukan aktivitas fisik ringan (American Diabetes Association, 2019).
Penderita DM Tipe-2 harus melakukan olahraga aerobik secara teratur.
Aktivitas aerobik idealnya dilakukan minimal 10 menit, dengan tujuan 60 menit/hari atau lebih. Olahraga dilakukan minimal 3 kali dalam seminggu dengan jeda tidak diperbolehkan lebih dari 2 hari diantara sesi olahraga. Aktivitas harus meningkat intensitas dan frekuensinya, dan/atau durasinya hingga mencapai minimal 150 menit/minggu dengan intensitas sedang hingga berat. Olahraga durasi yang lebih pendek (75 menit/minggu intensitas berat atau latihan interval) dapat dilakukan pada usia muda dan kebugaran yang lebih baik (American Diabetes Association, 2019).
2.2. 5’AMP-activated protein kinase
5’AMP-activated protein kinase (AMPK) adalah sensor dan regulator homeostasis energi pada eukariot. AMPK diaktifkan oleh stres energi sebagai respons terhadap peningkatan konsumsi ATP (contohnya olahraga, proliferasi sel, anabolisme) atau penurunan produksi ATP (kadar glukosa rendah, stres oksidatif, hipoksia), yang dinilai sebagai rasio rendah dari ATP terhadap AMP dan ADP (Yan et al., 2018).
Setelah diaktivasi, AMPK berupaya mengembalikan homeostasis energi dengan meningkatkan jalur katabolik alternatif yang menghasilkan ATP, dan pada saat yang sama menurunkan proses yang membutuhkan energi (Ross, MacKintosh and Hardie, 2016). Ketika konsentrasi fisiologis ATP telah tercapai, AMPK menjadi tidak aktif (Russo et al., 2013).
Disregulasi homeostasis energi dianggap menjadi faktor penting dalam perkembangan penyakit manusia, seperti DM Tipe-2, obesitas, dan kanker. Oleh karena itu, AMPK menjadi menarik untuk digunakan sebagai target obat dalam mencegah atau mengobati penyakit tersebut (Carling, 2017; Yan et al., 2018).
2.2.1. Struktur dan Aktivasi AMPK
AMPK terdiri dari protein kinase heterotrimerik αβγ yang diekspresikan pada setiap sel eukariot. Subunit α adalah subunit katalitik, sedangkan subunit β dan γ adalah subunit regulatorik (Gambar 2.2). Pada mamalia, AMPK dikodekan oleh dua subunit alternatif α (α1 dan α2), dua subunit alternatif β (β1 dan β2), dan tiga subunit alternatif γ (γ1, γ2, γ3), yang dapat membentuk sampai 12 isoform αβγ yang berbeda (Ross, MacKintosh and Hardie, 2016; Olivier, Foretz and Viollet,
2018). Pada vertebrata, ketiga subunit dikode oleh tiap gen yang berbeda. (Ross, MacKintosh and Hardie, 2016).
Subunit α dan β masing-masing memiliki dua isoform yang sangat mirip.
Subunit α1 dan β1 terdapat hampir di seluruh jaringan tubuh, sedangkan subunit α2 dan β2 lebih terbatas distribusinya, sebagian besar di otot rangka. Di dalam sel, subunit α1 berada di sitosol, sedangkan α2 berada di inti sel. Perbedaan ini menunjukkan spesialisasi kepentingan pada kompleks yang berbeda pada regulasi seluler. Kompleks yang mengandung α1 berfungsi untuk mengontrol jalur sinyal, sedangkan α2 meregulasi transkripsi dan ekspresi gen (Moffat and Harper, 2010)
Isoform subunit γ, yaitu γ1, γ2, dan γ3, ketiganya memiliki struktur yang sangat bervariasi. Subunit γ1 diekspresikan secara luas di berbagai jaringan.
Subunit γ2 terdapat di jantung, otak, plasenta, dan otot rangka. Sedangkan subunit γ3 hanya terdapat di otot rangka tipe otot serat 2a (Moffat and Harper, 2010).
Gambar 2.2 Struktur dan Fungsi Isoform AMPK
Isoform α1/α2 dan β1/β2 sangat mirip. Subunit α: KD, kinase domain mempunyai Thr172 untuk aktivasi oleh upstream kinase; AID, autoinhibitory domain; dua α- RIM, regulatory subunit interacting motifs yang mencetuskan perubahan konformasional sebagai respons ikatan AMP pada subunit γ; α-CTD, C-terminal domain binding to the β subunit. Subunit β: CBM, Carbohydrate binding module, β-CTD, C-terminal domain mempunyai tempat ikatan ke subunit α dan diikuti dengan domain untuk berinteraksi dengan subunit γ. Subunit γ: ketiga isoform mempunyai N-terminal domains (NTD) yang bervariasi; empat CBS, cystathione- β-domain, yang membentuk empat adenosine nucleotide-binding sites (Sites1-4).
Site 2 selalu kosong dan site 4 berikatan secara kuat dengan AMP, dimana site 1 dan 3 merepresentasikan tempat regulatory yang berikatan dengan AMP, ADP, atau AtP secara kompetitif
Selama keadaan stres energi, ketika ATP dikonsumsi lebih cepat daripada sintesisnya, konsentrasi ATP di sel menurun (Gambar 2.3). Hal ini menyebabkan peningkatan ADP, yang dilanjutkan dengan peningkatan AMP akibat kerja dari enzim adenylate kinase di sitosol. Enzim ini mengubah dua molekul ADP menjadi satu molekul ATP dan satu molekul AMP (Carling et al., 2011). AMP dan ADP akan berikatan dengan subunit γ dan mengaktivasi AMPK. Selain itu, fosforilasi pada T172 di subunit α juga dapat mengaktivasi AMPK (Jeon, 2016).
Gambar 2.3 Regulasi AMPK dan Konsekuensi Metabolik dari AMPK yang Teraktivasi.
Fosforilasi oleh upstream kinase adalah mekanisme utama dalam mengaktivasi AMPK. Regulasi fosforilasi AMPK dapat berupa nucleotide dependent, berasal dari perubahan rasio AMP:ATP yang diinduksi oleh keadaan stres energi. Selain itu, terdapat mekanisme lain dalam mengaktifkan AMPK yaitu nucleotide independent.
Sebagai respons terhadap stres energi, AMPK mengembalikan jumlah ATP dengan menghambat jalur yang menggunakan ATP dan secara bersamaan mengaktifkan jalur katabolik yang menghasilkan ATP (Garcia and Shaw, 2017).
Di otot rangka, AMPK menstimulasi proses pembentukan energi seperti pengambilan glukosa dan oksidasi asam lemak, dan menurunkan proses penggunaan energi seperti sintesis protein dan lipid (Richter and Ruderman, 2010) (Gambar 2.3). Peningkatkan oksidasi asam lemak dapat menurunkan akumulasi lipid intramiosit dan meningkatkan sensitivitas insulin otot. Hal ini merupakan alasan mengapa olahraga menjadi penting pada individu dengan resistensi insulin (Zhang, Zhou and Li, 2009; Hardie, 2010).
2.2.2. Pengambilan Glukosa oleh AMPK
AMPK meningkatkan pengambilan glukosa selama kontraksi otot, yang digunakan untuk menghasilkan ATP, suatu proses katabolisme. Pengambilan glukosa oleh otot juga dimediasi oleh insulin, tetapi hal ini umumnya terjadi pada saat otot istirahat ketika glukosa diperlukan untuk sintesis glikogen, suatu proses anabolisme (Hardie, Ross and Hawley, 2017).
Seperti insulin, olahraga meningkatkan laju pengambilan glukosa ke otot rangka yang berkontraksi, melalui proses yang diregulasi oleh translokasi GLUT4 ke membran plasma dan tubulus transversal. Menariknya, insulin dan olahraga/kontraksi otot meregulasi pengambilan glukosa pada otot rangka melalui mekanisme yang berbeda (Gambar 2.4) (Neill, 2013). Jalur insulin meliputi reseptor yang mengkatalisis fosforilasi IRS 1 yang diikuti dengan aktivasi PI3K, sedangkan pada jalur kontraksi otot tidak ada pengaktifan protein-protein tersebut (Winder, 2001). Kedua jalur ini akan menyatu secara parsial pada bagian distal, dan terdapat dua molekul sinyal yang mempengaruhi translokasi GLUT4, yang diaktivasi baik oleh insulin maupun kontraksi otot, yaitu TBC1D4 (dikenal juga dengan AS160) dan TBC1D1 (Richter and Hargreaves, 2013).
Gambar 2.4 Hubungan antara jalur insulin dan jalur kontraksi otot pada saat olahraga (Santos, Tewari and Benite-ribeiro, 2014)
Jumlah GLUT4 di sarcolemma dan di tubulus T diregulasi oleh efisiensi relatif dari dua proses, endositosis dan eksositosis vesikel yang berisi GLUT4 (Richter and Hargreaves, 2013). Insulin meningkatkan jumlah GLUT4 di membran plasma melalui peningkatan eksositosis (Stöckli, Fazakerley and James, 2011), sedangkan kontraksi otot (yang mengaktifkan AMPK) tidak hanya meningkatkan eksosotosis tetapi juga menurunkan laju endositosis GLUT4 (Huang and Czech, 2007). Hal ini menjadi penjelasan efek aditif latihan fisik pada pengambilan glukosa oleh insulin (Winder, 2001)(Richter and Hargreaves, 2013).
Selain itu, tampaknya terdapat dua pools GLUT4 intraseluler, satu direkrut utamanya oleh insulin dan yang lainnya melalui kontraksi. Contraction pool berbeda dengan insulin responsive pool. Struktur utama contraction pool adalah reseptor positif transferin. Keberadaan dua pool ini sepertinya menjadi alasan lain dari penemuan bahwa insulin dan kontraksi mempunyai efek aditif pada transportasi glukosa pada otot tikus (Richter and Hargreaves, 2013).
Bagaimana AMPK menstimulasi translokasi GLUT4 menjadi sangat menarik baik segi biokimia maupun genetik (Gambar 2.5). Translokasi dan fusi vesikel GLUT4 ke membran plasma berada di bawah kontrol protein Rab G yang aktif (GTP-bound state). Dalam keadaan basal, protein Rab G dinonaktifkan (GDP-bound state) oleh enzim golongan RabGTPase, seperti TBC1D1 dan TBC1D4 yang berhubungan dengan penyimpanan vesikel GLUT4. TBC1D4 dapat difosforilasi oleh insulin dan AMPK, sedangkan TBC1D1 hanya dapat difosforilasi dan diinaktivasi oleh AMPK (Russo et al., 2013). TBC1D1 dan TBC1D4 yang telah aktif membuat ikatan dengan protein 14-3-3 dan mengubah protein Rab dari bentuk inaktif menjadi bentuk aktif, sehingga menginduksi fusi vesikel GLUT4 dengan membran plasma (Hardie, 2010; Jeon, 2016; Hardie, Ross and Hawley, 2017).
Gambar 2.5 Regulasi pengambilan glukosa pada saat kontraksi otot.
Selama kontraksi, terjadi depolarisasi tubulus T (membran plasma hanya ditemukan pada otot rangka) yang menyebabkan kalsium (Ca2+) keluar dari retikulum sarkoplasma, yang mencetuskan interaksi aktin dan miosin (merah; tebal miosin dan tipis filamen aktin). Kebutuhan energi untuk kontraksi meningkatkan rasio AMP/ATP, sehingga menstimulasi AMPK. TBC1D1 dan TBC1D4 terlibat dalam meregulasi pengambilan glukosa sebagai respons terhadap kontraksi; namun, TBC1D1 berperan lebih penting. AMPK dapat memfosforilasi TBC1D1 dan TBC1D4, tetapi selama kontraksi terdapat korelasi kuat antara fosforilasi TBD1D1 dan ikatan 14-3-3 (protein yang diperkirakan berperan dalam regulasi GAP junction TBC1D1 setelah fosforilasi), yang menyebabkan disosiasi protein Rab dan translokasi GLUT4 ke membran plasma dan pengambilan glukosa. AK, adenylate kinase, enzim yang dibutuhkan untuk pembentukan AMP (Neill, 2013).
2.3. Glucose Transporter 4
GLUT4 adalah salah satu dari 14 anggota keluarga glucose transporter (GLUT) yaitu transporter yang memfasilitasi transport glukosa melewati membran plasma tanpa menggunakan ATP, dengan mekanisme difusi difasilitasi (Navale and Paranjape, 2016). Setiap anggota GLUT memiliki afinitas dan spesifitas yang berbeda untuk heksosa tertentu, dan memiliki distribusi jaringan yang unik. Protein GLUT4 dikodekan oleh gen solute carrier family 2 member 4 (SLC2A4) (Esteves,
Enguita and Machado, 2017). GLUT4 memiliki afinitas yang tinggi terhadap glukosa. Strukturnya terdiri dari protein 12-transmembran yang diekspresikan di sel-sel otot dan adiposa (Thorens and Mueckler, 2010).
Dalam keadaan tidak ada insulin, sebagian besar GLUT4 dipertahankan di dalam struktur vesikel intraseluler. Di dalam sel, vesikel tersebut berada di antara endosom, di dalam jaringan trans Golgi, dan di dalam struktur tubulovesikuler (Foley, Boguslavsky and Klip, 2011). Dalam keadaan tidak ada insulin pula, hanya terdapat 5% dari total GLUT 4 yang ditemukan di permukaan sel. Kegagalan untuk mentranslokasikan GLUT4 ke membran plasma merupakan tahap awal perkembangan resistensi insulin dan DM Tipe-2 (Leto and Saltiel, 2012).
Jumlah GLUT4 pada otot rangka sebagian besar diregulasi pada level transkripsi. Analisis pada promotor gen GLUT4 menunjukkan bahwa myocyte enhancer factor (MEF2) penting untuk ekspresi normal GLUT4 di otot rangka (Gambar 2.7). Terdapat beberapa faktor transkripsi lainnya seperti MyoD, thyroid receptor α1 (TRα1), Kruppel like factor 15 (KLF15), dan GLUT4 enhancer factor (GEF). Tetapi semua faktor transkripsi tersebut berinteraksi secara fisik dengan MEF2 untuk menginduksi transkripsi GLUT4. Penurunan ekspresi MEF2 berhubungan dengan penurunan ekspresi GLUT4 (Mcgee et al., 2008).
Gambar 2.6. Representasi respons elemen penting pada promoter GLUT4.
GEF, GLUT4 enhancer factor,; MEF2, myocyte enhancer factor; sekuensi promoter -859 bp adalah tempat awal yang mengandung informasi yang cukup untuk ekspresi GLUT4 dan untuk regulasi oleh olahraga (Holmes and Dohm, 2004).
Dalam keadaan istirahat, MEF2 secara fisik berhubungan dengan represor transkripsi histone deacetylase 5 (HDAC5) (Gambar 2.7.). HDAC5 membuat struktur kromatin menjadi sangat padat sehingga menekan kerja MEF2. Hal ini menyebabkan represi transkripsi DNA yang bergantung MEF2 (Mcgee et al., 2008). Pada DM Tipe-2 terjadi penurunan aktivitas perlekatan MEF2 ke DNA sehingga menyebabkan penurunan ekspresi GLUT4 (McGee and Hargreaves, 2010).
AMPK yang diaktifkan saat olahraga dapat memfosforilasi HDAC5, sehingga HDAC5 keluar dari nukleus dan kompleks MEF2/HDAC5 terdisosiasi.
GLUT4 diekspresikan sebagai respons terhadap olahraga apabila MEF2 berhubungan dengan histone acetyl transferase (HAT). Hal ini membutuhkan koaktivator transkripsi peroxisome proliferator–activated receptor gamma coactivator 1α (PGC-1α). Disosiasi kompleks MEF2/HDAC5 menyebabkan MEF2 dapat berikatan dengan PGC-1α dan meningkatkan ekspresi GLUT4 (McGee and Hargreaves, 2006; Ling and Nitert, 2011; Ntanasis-Stathopoulos et al., 2013).
Gambar 2.7. Efek Olahraga terhadap Ekspresi GLUT4.
(a) Dalam keadaan istirahat, HDAC5 berikatan dengan MEF2 sehingga menghambat ekspresi GLUT4. (b) Dengan olahraga, AMPK diaktivasi dan menyebabkan fosforilasi dan pemindahan HDAC5 dari nukleus sehingga PGC-1a berikatan dengan MEF2 dan menarik HAT ke MEF2. Hal ini menstimulasi aktivitas MEF2 dan meningkatkan ekspresi GLUT4 (Ling and Nitert, 2011).
2.4.Olahraga
Istilah aktivitas fisik dan olahraga sering digunakan, tetapi kedua hal ini berbeda. Aktivitas fisik didefinisikan sebagai setiap pergerakan tubuh yang dihasilkan oleh kontraksi otot rangka yang mengakibatkan peningkatan pengeluaran kalori dibandingkan pengeluaran energi saat istirahat. Olahraga adalah jenis aktvitas fisik dengan pergerakan tubuh yang terencana, terstruktur, dan berulang, yang dilakukan untuk meningkatkan dan/atau mempertahankan satu atau lebih komponen kebugaran fisik. Kebugaran fisik didefinisikan sebagai karakteristik individu yang dimiliki yang berhubungan dengan kemampuannya dalam melakukan aktivitias fisik (Riebe, 2014). Latihan adalah kegiatan olahraga yang sistematis dalam waktu yang panjang, ditingkatkan secara bertahap dan
perorangan, bertujuan untuk membentuk manusia yang berfungsi fisiologis dan psikologisnya untuk memenuhi tuntutan tugas (Bompa and Haff, 2009).
Program olahraga menggunakan formula frequency, intensity, time, dan type (FITT). Frekuensi adalah seberapa sering berolahraga atau jumlah hari per minggu yang didedikasikan untuk program olahraga. Intensitas adalah seberapa berat berolahraga atau jumlah energi yang dibutuhkan untuk melakukan aktivitas fisik per unit waktu. Time atau waktu atau durasi adalah seberapa lama berolahraga atau jumlah waktu yang digunakan untuk melakukan aktivitas fisik. Tipe olahraga adalah tipe spesifik aktivitas fisik yang dipilih (Raven et al., 2013).
Olahraga di bawah intensitas minimum tidak akan cukup membuat respons fisiologi tubuh, seperti peningkatan konsumsi oksigen maksimal (VO2max). Ambang batas minimum intensitas olahraga bervariasi antarindividu bergantung kepada tingkat kebugaran kardiorespirasi dan faktor lainnya seperti umur, kesehatan, perbedaan fisiologi, genetik, kebiasaan aktivitas fisik, dan faktor sosial dan psikologi (Riebe, 2014).
Penentuan intensitas olahraga umumnya menggunakan persentase pengambilan oksigen maksimum (%VO2max) dan denyut nadi maksimal (%HRmax) (Tabel 2.1). Pada individu tertentu penilaian tersebut dapat menjadi underestimated atau overestimated, sehingga terdapat beberapa metode lain dalam menentukan intensitas olahraga, seperti dengan menggunakan oxygen consumption reserve (VO2R) dan heart rate reserve (HRR). Sayangnya, metode tersebut belum digunakan secara universal (Riebe, 2014).
Tabel 2.1 Klasifikasi Intensitas Olahraga (Garber et al., 2011)
Intensitas % HRR atau %VO2 R %HRmax %VO2max
Sangat ringan < 30 < 57 < 37
Ringan 30-39 57-63 37-45
Sedang 40-59 64-76 46-63
Berat 60-89 77-95 64-90
Hampir maksimal atau maksimal
≥ 90 ≥ 96 ≥ 91
Keterangan HRR = Reserve Heart Rate; HRmax = Maximal Heart Rate; VO2max = pengambilan oksigen maksimal; VO2R = oxygen uptake reserve
Secara umum jenis olahraga dikategorikan sebagai anaerobik (nonoksidatif) dan aerobik (oksidatif). Olahraga anaerobik adalah aktivitas yang terutama bergantung pada reaksi metabolik pada sel otot yang tidak memerlukan oksigen.
Contoh aktivitas anaerobik adalah angkat berat, latihan beban, atau lempar martil.
Olahraga aerobik adalah aktivitas yang terutama bergantung pada reaksi metabolik sel otot yang memerlukan oksigen. Aktivitas aerobik contohnya adalah berjalan, berlari, berenang, bersepeda, dayung, dan ski (Raven et al., 2013).
2.4.1. Metabolisme Olahraga
Untuk mempertahankan kontraksi otot, ATP harus diregenerasi untuk mencukupi kebutuhan. Di jaringan otot, hidrolisis 1 mol ATP akan menghasilkan energi sebesar 31 kJ (7.3 kkal). Penyimpanan ATP di intramuskular sangat kecil (~5 mmol/kg), dan simpanan tersebut hanya dapat digunakan untuk olahraga singkat. Oleh karena itu, jalur metabolik lain harus diaktifkan untuk mensintesis ATP untuk kebutuhan energi selama kontraksi. Jalur ini termasuk fosforilasi substrat yang tidak membutuhkan oksigen (jalur fosfagen dan glikolitik) dan fosforilasi oksidatif yang bergantung pada ketersediaan oksigen (Gambar 2.8).
Ketiga sistem ini memiliki perbedaan penggunaan substrat dan jumlah ATP yang dihasilkan (Baker, McCormick and Robergs, 2010). Meskipun asam amino dapat dioksidasi oleh otot yang berkontraksi, asam amino berkontribusi kecil dalam metabolisme olahraga, sedangkan karbohidrat dan lemak adalah substrat primer dalam metabolisme oksidatif selama olahraga (Hargreaves and Spriet, 2018).
Gambar 2.8 Metabolisme Energi di Otot Rangka (Hargreaves and Spriet, 2018) Jalur pembentukan energi selama olahraga dipengaruhi oleh intensitas dan durasi olahraga (Gambar 2.9). Pada olahraga anaerobik dengan gerakan yang membutuhkan tenaga yang besar dalam waktu yang singkat, sumber utama ATP berasal dari degradasi creatine phosphate (jalur phosphagen) dan glikolisis, sedangkan fosforilasi oksidatif hanya berperan 25-30%. Karbohidrat lebih efisien secara metabolik daripada lemak, sebab karbohidrat dapat dipecah dengan cepat tanpa menggunakan oksigen untuk menghasilkan ATP melalui proses glikolisis (Hargreaves and Spriet, 2018). Namun proses tersebut hanya untuk waktu yang terbatas yaitu hanya sekitar ±90 detik dan menghasilkan molekul ATP yang lebih sedikit jika dibandingkan dengan metabolisme energi secara aerobik (2 ATP dibanding 36 ATP per 1 molekul glukosa) (Raven et al., 2013).
Pada kegiatan olahraga dengan aktivitas aerobik yang dominan, sebagian besar ATP berasal dari metabolisme oksidatif karbohidrat dan lipid. Substrat utama untuk oksidasi adalah glikogen otot dan glukosa darah, dan asam lemak dari jaringan adiposa dan pemecahan trigliserida intramuskular. Kontribusi relatif substrat - substrat ini bergantung pada intensitas olahraga. Pada olahraga intensitas yang rendah, oksidasi lipid lebih dominan, tetapi seiring peningkatan intensitas, lebih banyak menggunakan glikogen otot dan glukosa darah (Egan and Zierath, 2013; Hargreaves and Spriet, 2018).
Gambar 2.9 Interaksi Sistem Energi dan Perbedaan Laju turnover ATP Selama Olahraga (Baker, McCormick and Robergs, 2010)
Proses metabolisme energi secara aerobik merupakan proses yang bersih karena proses tersebut hanya akan menghasilkan produk samping berupa karbondioksida dan air. Hal ini berbeda dengan proses metabolisme secara anaerobik yang juga akan menghasilkan produk samping berupa asam laktat yang apabila terakumulasi dapat menghambat kontraksi otot dan menyebabkan rasa nyeri pada otot. Hal ini menyebabkan gerakan-gerakan bertenaga saat berolahraga
tidak dapat dilakukan secara kontinu dalam waktu yang panjang dan perlu diselingi dengan interval istirahat (Raven et al., 2013).
2.4.2. Olahraga Aerobik
Olahraga aerobik terdiri dari kontraksi isotonik yang berulang dengan melibatkan banyak kelompok otot. Olahraga aerobik membutuhkan kecocokan yang tepat antara sistem kardiovaskular dan respirasi untuk menyediakan suplai energi ke otot yang berkontraksi. Olahraga yang aerobik dilakukan secara teratur dapat meningkatkan fungsi jantung, paru, dan sistem sirkulasi sehingga dapat menurunkan risiko DM, penyakit jantung, dan stroke (Morici et al., 2016).
Olahraga aerobik dilakukan dengan metode continous dan interval. Kedua metode sering digunakan untuk program rehabilitasi pasien dengan penyakit kronis.
Beban latihan pada tipe continous tidak berubah dengan mempertahankan intensitas denyut jantung selama latihan (Spanoudaki, 2011). Olahraga interval menggunakan metode dengan periode olahraga – istirahat – olahraga – istirahat.
Olahraga ini dapat dilakukan dengan intensitas yang lebih besar daripada latihan continuos. Adanya fase istirahat diantara olahraga memberikan waktu untuk mengembalikan sumber energi seperti fosfokreatin dan ATP (Mazoochi, 2016).
Jika dibandingkan dengan latihan continuous, latihan interval dapat menginduksi perubahan fisik yang hampir sama atau bahkan lebih superior. Hal ini penting dalam perspektif kesehatan publik sebab “ketersediaan waktu” menjadi faktor utama melakukan program olahraga. Selain itu, latihan interval dianggap lebih menyenangkan dibandingkan latihan continuous (Gibala et al., 2012) (Francois and Little, 2015).
Mekanisme molekular latihan interval dalam adaptasi metabolisme otot rangka masih diteliti. Latihan interval berpotensi meningkatkan kapasitas mitokondria melalui aktivasi PGC 1α. (Egan et al., 2010) menyebutkan bahwa olahraga latihan interval meningkatkan mRNA PGC1α beberapa kali setelah 3 jam olahraga, mirip dengan latihan continuous. Sinyal upstream yang dapat mengaktivasi PGC1α dan biogenesis mitokondria masih belum jelas, tetapi kemungkinan disebabkan oleh perubahan cepat rasio AMP/ATP saat olahraga dan mengaktivasi AMPK (Gibala et al., 2012).
2.5.AMPK dan Olahraga
Otot rangka mengekspresikan tujuh isoform pada level mRNA, tetapi aktivitas AMPK pada jaringan tersebut hanya dilakukan pada kombinasi: α1β2γ1, α2β2γ1, dan α2β2γ3 (Treebak and Wojtaszewski, 2008; Ross, MacKintosh and Hardie, 2016). Pada saat olahraga hanya kompleks α2β2γ1 dan α2β2γ3 yang teraktivasi dan menyebabkan pengambilan glukosa oleh otot (Lantier et al., 2014).
Olahraga lebih mengaktifkan subunit α2 dibandingkan α1 (Jørgensen, S.B., Jensen, T.E., and Richter, 2007) dan aktivasi subunit α2 dibutuhkan untuk fosforilasi AS160 yang berperan dalam pengambilan glukosa (Treebak and Wojtaszewski, 2008).
AMPK tidak terlibat terhadap respons olahraga anaerobik yang singkat, seperti angkat berat. Pada jenis olahraga ini ATP lebih banyak dibentuk dari perubahan fosfokreatinin menjadi ATP, sehingga terjadi sedikit perubahan pada jumlah ATP, ADP, dan AMP. Saat fosfokreatinin berkurang, glikogen dipecah dan glikolisis anaerobik menjadi penting untuk pembentukan ATP. Keadaan ini tidak membutuhkan AMPK, sebab enzim kunci yang terlibat (fosforilase dan
fosfofruktokinase) secara langsung berikatan dengan AMP, terbebas dari AMPK (Hardie, 2010).
AMPK menjadi penting pada saat perubahan metabolisme anaerobik menjadi metabolisme aerobik, yang dibutuhkan pada saat olahraga aerobik, misalnya lari lebih dari 200 m. Selama olahraga, penggunaan metabolisme aerobik dan bahan bakar dari darah seperti glukosa dan asam lemak menjadi sangat penting, dan disinilah peran AMPK (Hardie, 2010).
2.6.Latihan Treadmill pada Tikus
Treadmill merupakan salah satu pilihan modalitas untuk menginvestigasi respons fisiologi, biokimia, perilaku, dan respons molekular terhadap olahraga yang bersifat akut dan kronis. Berbeda dengan modalitas lainnya, seperti berenang dan running wheel, treadmill memfasilitasi perhitungan dan pengaturan intensitas dan durasi. Berlari di atas treadmill meningkatkan laju metabolik tikus secara sistematik dan terukur sebanding dengan VO2max. Selain itu, berlari di atas treadmill menyebabkan stres metabolik sehingga meningkatkan penghantaran oksigen ke otot yang berkontraksi yang bergantung pada intensitas dan waktu. (Poole et al., 2020).
Tikus harus dibiasakan dengan treadmill secara bertahap. Pengkondisian tikus umumnya sekitar 5 menit pada kecepatan yang bervariasi selama 5-14 hari.
Tikus sebaiknya olahraga pada suhu lingkungan yang netral (20-22°C). Tidak seperti manusia, tikus tidak berkeringat untuk meregulasi suhu tubuh. Kipas anging diletakkan di depan tikus dapat membantu menghilangkan panas tubuh. Intensitas latihan treadmill ditentukan oleh kecepatan dan kemiringan treadmill, dengan kategori sebagai berikut (Poole et al., 2020):
a. Intensitas rendah : <18m/menit, kemiringan 0-5%
b. Intensitas sedang : 18-25 m/menit, kemiringan 0-10%
c. Intensitas berat : >25 m/menit, kemiringan > 0%
Durasi olahraga umumnya berkisar antara 20 menit/hari sampai 70 menit/hari, dengan frekuensi 5 hari perminggu, sampai 7 hari/minggu. Olahraga jangka pendek adalah kurang dari 6 minggu, sedangkan olahraga jangka panjang adalah 6 minggu atau lebih. Olahraga akut adalah tikus berlari pada kecepatan tertenu dan tetap sampai kelelahan atau pada durasi dan kecepatan yang tetap untuk sesi tunggal (Wang et al., 2019).
2.7.Model Hewan Coba Diabetes Mellitus Tipe-2
DM Tipe-2 merupakan kelompok penyakit dengan karakteristik terjadinya resistensi insulin dan gangguan sel β Langerhans pankreas dalam mensekresi insulin. Hewan uji DM Tipe-2 dapat dibuat dengan beberapa cara yaitu: pemberian nutrisi yang dapat menstimulasi resistensi insulin, pankreatektomi parsial, pemberian senyawa diabetogenik, ataupun secara genetik. Perlakuan tersebut mengakibatkan terjadinya penurunan respon jaringan perifer terhadap aksi insulin atau malfungsi dari reseptor insulin dan penurunan kemampuan sel β Langerhans pankreas dalam menstimulasi insulin. Kedua hal tersebut mengakibatkan peningkatan kadar glukosa darah seperti pada kondisi DM Tipe-2 (Nugroho, 2006).
Pemberian makanan kaya akan fruktosa pada tikus selama lebih dari 2 bulan akan menginduksi resistensi insulin. Pemberian diabetogenik dan streptozotosin (STZ) dosis 90 mg/kg BB secara intraperitoneal (i.p.) pada tikus neonatal menginduksi terjadinya DM Tipe-2 pada usia 6 minggu atau lebih (Nugroho, 2006).
STZ atau 2-deoksi-2-[3-(metil-3nitrosoureido)-D-gluko piranose] diperoleh dari Streptomyces achromogenes digunakan untuk menginduksi baik DM Tipe-1 maupun DM Tipe-2 pada hewan uji. Untuk menginduksi DM Tipe-2, STZ diberikan i.v. atau i.p. dengan dosis 100 mg/kg BB pada tikus yang berumur 2 hari kelahiran sehingga pada 8-10 minggu tikus tersebut mengalami gangguan respon terhadap glukosa dan sensitivitas sel β terhadap glukosa. Di lain pihak, sel α dan δ tidak dipengaruhi secara signifikan oleh pemberian STZ pada tikus neonatal tersebut sehingga tidak berdampak pada perubahan glukagon dan somatostatin.
Patofisiologis tersebut identik pada DM Tipe-2 (Nugroho, 2006).
Aksi STZ intraseluler mengubah DNA sel β pankreas. Alkilasi DNA sel β oleh STZ melalui gugus nitrosourea mengakibatkan kerusakan pada sel β pankreas.
Selain itu, STZ juga mampu membangkitkan oksigen reaktif yang mempunyai peran tinggi dalam kerusakan sel β pankreas. Aksi STZ dalam mitokondria membentuk anion superoksida dan meningkatkan aktivitas xantin oksidase. Dalam hal ini, STZ menghambat siklus Krebs dan menurunkan konsumsi oksigen mitokondria. Produksi ATP mitokondria yang terbatas selanjutnya mengakibatkan pengurangan secara drastis nukleotida sel β pankreas (Nugroho, 2006).
2.8.Kerangka Teori
Gambar 2.10 Kerangka Teori
AMP= Adenosie Monophosphate
AMPK= 5’AMP-activated protein kinase Predisposisi DM
Tipe-2:
Genetik
Asupan kalori tinggi Kurang aktivitas
Akumulasi lemak di otot
Aktivasi PKC dan inhibisi reseptor insulin
Translokasi GLUT4
Pengambilan glukosa di otot
Olahraga aerobik
Continuous
Rasio AMP/ATP meningkat Interval
Aktivasi AMPK
Meningkatkan ekspresi GLUT4 Aktivitas Akt
dan PI3K menurun
Ekspresi GLUT4 menurun
Fosforilasi HDAC5 Fosforilasi TBC1D1
dan TBC1D4
Meningkatkan aksesiblitas MEF2 ke
promotor GLUT4 Asam bebas lemak di plasma meningkat
Peningkatan DAG dan ceramid Disfungsi Mitokondria
Perlekatan MEF2 ke promotor GLUT4
menurun
ATP= Adenosine Triphosphate DAG= Diacylglycerol
GLUT4= Glucose Transporter 4 HDAC5= Histone deacetylase 5 IRS= Insulin Receptor Substrate MEF2= Myocyte enhancer factor 2 PI3K= Phosphatidylinositol-3-kinase PKC= Protein Kinase C
STZ= Streptozotosin
TBC1D1= Tre2-Bub2-Cdc16 domain family member 1 TBC1D4 = Tre2-Bub2-Cdc16 domain family member 4 = menginduksi
= menghambat
2.9.Kerangka Konsep
Variabel Bebas
• Latihan continuous intensitas sedang
• Latihan continuous intensitas berat
• Latihan interval tipe lambat
• Latihan interval tipe cepat
Variabel Terikat
• Ekspresi Ampk α2
• Ekspresi Glut4
2.10. Hipotesis Penelitian
1. Latihan continuous intensitas sedang mempengaruhi ekspresi Ampk α2 dan Glut4 pada tikus galur wistar model DM Tipe-2.
2. Latihan continuous intensitas berat mempengaruhi ekspresi Ampk α2 dan Glut4 pada tikus galur wistar model DM Tipe-2.
3. Latihan interval tipe lambat mempengaruhi ekspresi Ampk α2 dan Glut4 pada tikus galur wistar model DM Tipe-2.
4. Latihan interval tipe cepat mempengaruhi ekspresi Ampk α2 dan Glut4 pada tikus galur wistar model DM Tipe-2.
5. Terdapat perbedaan pengaruh antara latihan continuous intensitas sedang, latihan continuous intensitas berat, latihan interval tipe cepat, dan latihan interval tipe lambat terhadap ekspresi Ampk α2 dan Glut4 pada tikus galur wistar model DM Tipe-2
BAB III
METODOLOGI PENELITIAN 3.1. Rancangan Penelitian
Penelitian ini adalah penelitian eksperimental murni menggunakan model hewan coba dengan menggunakan desain penelitian posttest with control group.
3.2. Waktu dan Tempat Penelitian 3.2.1. Waktu Penelitian
Penelitian telah dilakukan pada bulan September sampai November 2020.
Penelitian dilakukan selama 12 minggu setelah mendapat persetujuan dari Komisi Etik Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara.
3.2.2. Tempat Penelitian
Bahan biologi tersimpan berupa jaringan otot gastrocnemeius tikus putih jantan galur Wistar disimpan di Laboratoium Terpadu Fakultas Kedokteran Sumatera Utara. Pemeriksaan ekspresi Ampk α2 dan Glut4 juga dilakukan di Laboratoium Terpadu Fakultas Kedokteran Sumatera Utara.
3.3. Populasi dan Sampel Penelitian
Populasi pada penelitian ini adalah tikus putih jantan galur Wistar yang telah dibuat menjadi tikus model DM Tipe-2 oleh Dr. dr. Yetty Machrina, M.Kes sebanyak 25 ekor. Sampel penelitian ini adalah bahan biologi tersimpan berupa jaringan otot yang berasal dari tikus tersebut milik Dr. dr. Yetty Machrina, M.Kes.
Bahan biologi tersimpan tersebut berumur 4 tahun, disimpan dalam jumlah kecil di tabung ependorf 1,5 ml dan menggunakan larutan RNAlater pada lemari pendingin -80°C.
Kriteria Bahan Biologi Tersimpan yang baik menurut International Agency for Research on Cancer (IARC, 2017):
- Konsentrasi RNA minimal 40 µg/mL
- Kemurnian RNA, nilai rasio A260/280 adalah 1,8-2,2 3.4. Besar Sampel
Peneliti pertama menghitung besar sampel menggunakan rumus Federer, sebagai berikut,
(t-1) (n-1) ≥ 15
t = jumlah kelompok perlakuan
n = jumlah sampel per kelompok perlakuan
= (5-1)(n-1) ≥ 15
= 5n - 5 -1n + 1≥ 15
= 4n - 4≥ 15
= 4n ≥ 19
n = 5 ekor tikus per kelompok perlakuan.
3.5. Variabel Penelitian 3.5.1. Variabel Bebas
• Latihan continuous intensitas sedang
• Latihan continuous intensitas berat
• Latihan interval tipe lambat
• Latihan interval tipe cepat
3.5.2. Variabel Terikat
• Ekspresi Ampk α2
• Ekspresi
Glut4
3.6. Definisi Operasional
Variabel Bebas Definisi
Latihan continuous intensitas sedang
Aktifitas fisik yang diberikan pada kelompok tikus Diabetes berupa lari di atas treadmill dengan kecepatan lari 20 m/menit, selama 30 menit.
Latihan continuous intensitas berat
Aktifitas fisik yang diberikan pada kelompok tikus Diabetes berupa lari di atas treadmill dengan kecepatan lari 24-33 m/menit, selama 30 menit.
Latihan interval tipe lambat
Aktifitas fisik yang diberikan pada kelompok tikus Diabetes berupa lari di atas treadmill dengan kecepatan lari 20m/menit, sebanyak 10 sesi pengulangan, dengan durasi waktu 2 menit/
sesi dengan diselingi istirahat selama1 menit (20m/menit, 10x2 menit, istirahat 1 menit)
Latihan interval tipe cepat
Aktifitas fisik yang diberikan pada kelompok tikus Diabetes berupa lari di atas treadmill dengan kecepatan lari 30 m/menit, sebanyak 15 sesi pengulangan dengan durasi waktu 30 detik/
sesi dengan diselingi istirahat selama 1 menit (30 m/menit, 15x30 detik, istirahat 1 menit).
Varibel Terikat
Definisi Cara Ukur Hasil Ukur Skala
Ukur Ekspresi
Ampk α2
Sensor perubahan rasio
AMP/ATP di dalam sel
RNA jaringan otot diisolasi. Ekspresi Ampk a2 diukur menggunakan Real Time PCR
∆Ct Rumus Livak = 2-∆∆Ct
Numerik
Ekspresi Glut4
Gen fasilitator transport glukosa melewati membran plasma di otot rangka
RNA jaringan otot diisolasi. Ekspresi Glut4 diukur menggunakan Real Time PCR
∆Ct Rumus Livak = 2-∆∆Ct
Numerik
3.7. Bahan, Alat, dan Cara Kerja
3.7.1. Pembuatan Model Hewan Coba dan Proserdur Perlakuan
Prosedur pembuatan model hewan coba yang dilakukan oleh Dr.dr.Yetty Machrina, M.Kes merupakan modifikasi dari metode Zhang et al., (2008). Tikus ditempatkan pada kandang dengan suhu ruangan, dengan siklus terang gelap 12/12 jam. Model DM Tipe-2 dilakukan dengan memberikan diet tinggi lemak dengan komposisi 41% lemak, 41% karbohidrat, dan 18% protein selama 5 minggu dan diinjeksikan streptozosin dosis rendah sebanyak dua kali. Tikus model DM Tipe-2
