Vol. 24 No. 3, September 2015 24
Ekspresi Faktor Antiangiogenesis Thrombospondin-1 (TSP-1)
dan Angiostatin Kanker Payudara Invasif
Ambar Mudigdo, Dyah Ratna Budiani, Riza Novierta Pesik, Novan Adi Setyawan Bagian/Laboratorium Patologi Anatomik, Fakultas Kedokteran, Universitas Sebelas Maret
Surakarta ABSTRAK
Latar belakang
Angiogenesis merupakan salah satu karakter sel kanker ganas. Aktivitas angiogenesis banyak dipertimbangkan sebagai salah satu penentu prognosis kanker payudara invasif. Tubuh memiliki faktor-faktor endogen yang berperan sebagai antiangiogenesis, seperti thrombospondin-1 (TSP1) dan angiostatin. TSP1 adalah faktor antiangiogenesis yang dependent pada p53 wild type. Ekspresi TSP-1 diinduksi oleh faktor transkripsi P53 WT. Pada beberapa malig-nansi mammae terjadi mutasi pada gen p53, sehingga TSP1 tidak dapat diekpresikan. Ketidakhadiran TSP1 diduga akan memunculkan prognosis yang lebih buruk. Kajian ekspresi protein antiangiogenesis ini diharapkan dapat diguna-kan sebagai salah satu indikator prognosis pada diguna-kanker payudara invasive ductal carcinoma mamae yang terbagi dalam 4 sub-type: Luminal A; Luminal B; Her2 (over expression) dan Triple negative/Basal-like. Tujuan penelitian ini menganalisis ekspresi faktor antiangiogenesis thrombospondin-1 (TSP-1) dan angiostatin kanker payudara invasif. Metode
Sebanyak 20 blok parafin jaringan kanker payudara invasive ductal carcinoma dari Bagian Patologi Anatomik RS Dr. Moewardi tahun 2013 dibagi ke dalam empat kelompok berdasarkan status ekspresi estrogen receptor, progesteron receptor dan Her2/neu sebagai berikut: sub tipe Luminal A (ER+/PR+/Her2 negatif); sub tipe Luminal B (ER-/PR dan Her2 positif); Sub tipe Her2 over exspression (ER-/PR-/Her2+ over ekspresi); serta sub tipe Triple negatif (basal-like tumor). Teknik imunohistokimia sistem ABC (avidin biotin-complex) digunakan dalam pewarnaan khusus untuk mengukur ekspresi TSP-1 dan Angiostatin, menggunakan anti bodi monoclonal anti-human TSP-1 dan anti-human Angiostatin. Nilai ekspresi dinyatakan dalam skala IDS, dengan rentang nilai=0 s.d. 300 IDS. Analisis data yang digunakan adalah uji beda berpasangan antar kelompok (p<0,05).
Hasil
Analisa statistik ekspresi antara TSP-1 sub-tipe Triple negative basal-like dan sub-tipe luminal A menunjukkan perbe-daan bermakna, serta antara luminal A dengan sub tipe Her2 dan ekspresi TSP-1 tertinggi adalah sub tipe luminal A dengan nilai=236,0 IDS; ekspresi TSP-1 terendah adalah sub tipe triple negatif=57,6 IDS. Ekspresi angiostatin teren-dah adalah sub tipe Luminal A sebesar=183 IDS dan ekspresi angiostatin tertinggi adalah sub tipe triple negative=234,4.
Kesimpulan
Ekspresi TSP-1 mengindikasikan prognosis kanker payudara invasive, semakin tinggi nilai ekspresi TSP-1, prognosis kanker payudara invasif semakin baik. Ekspresi Angiostatin tidak mengindikasikan prognosis kanker payudara invasif . Kata kunci : angiostatin, ER-PR & Her-2, invasive ductal carcinoma mammae, thrombospondin-1, triple negative.
ABSTRACT Background
Angiogenesis is one of the characteristics of malignant cancer cells. Angiogenesis activity considered as one of many determinants of prognosis of invasive breast cancer. The body has endogenous factors that act as antiangiogenesis, such as thrombospondin-1 (TSP1) and angiostatin. TSP1 is an antiangiogenesis factor that is dependent on wild-type p53. TSP-1 expression is induced by the transcription factor p53 WT. In some breast malignancies occurs mutations in the p53 gene, so TSP1 can not be expressed. The absence of TSP1 expected to bring a worse prognosis. Study of antiangiogenesis protein expression is expected to be used as an indicator of prognosis in breast cancer invasive ductal mammary carcinoma which divided into four sub-types: luminal A; luminal B; Her2 (over-expression) and triple negative/basal-like. This study is to analyzed TSP-1 and angiostatin of invasive breast cancer.
Methods
A total of 20 paraffin blocks of breast cancer tissue invasive ductal carcinoma from Pathology Anatomy RS Dr. Moewardi in 2013 were divided into four groups based on the expression status of estrogen receptors, progesterone receptors and Her2/neu as follows: luminal A subtype (ER+/PR+/Her2 negative); sub-type luminal B (ER-/PR and Her2 positive); Her2 over expression subtype (ER-/PR-/Her2 over-expression); and triple negative subtypes (basal-like tumors). Technique immunohistochemical ABC (avidin-biotin complex) used in special stains to measure the expression of TSP-1 and angiostatin, using monoclonal antibodies anti-human TSP-1 and anti-human angiostatin. Expression values are expressed in scale IDS, with a value range 0 to IDS 300. Analysis of the data used is difference test paired between groups (p<0.05).
Results
Statistic analyses of TSP-1 expression between subtypes triple negative/basal-like with the luminal A subtype showed significant differences, as well as between the luminal A subtype with Her2. The highest TSP-1 expression is an luminal A subtype (236.0 IDS), whilst the lowest expression is on triple negative subtype (57.6 IDS). The lowest angio-statin exspression is on luminal A subtype (183 IDS), whilst the highest is on triple negative (234.4 IDS). Statistic analyses of angiostatin expression between luminal A subtype and triple negative subtype showed no significant differences.
Conclusion
Expression of TSP-1 could be used to determined invasive breast cancer prognosis, whilst expression of angiostatin could not be.
Vol. 24 No. 3, September 2015 25 PENDAHULUAN
Penentuan prognosis dan prediktif kanker payudara dengan dasar analisis makna ekspresi
estrogen receptor (ER), progesteron receptor
(PR) dan epidermal growth factor receptor
(EGFR/HER2/neu/c-erbB2), sudah dilaksanakan di Indonesia setidaknya dalam 1 dasa warsa ini. Klasifikasi kanker payudara invasif berdasarkan ekspresi genomik menjadi 4 sub tipe: a. Luminal A (ER+/PR+/Her2-); b. Luminal B (ER+/PR-/Her2+); c. Her2 positif dan d. Sub tipe Triple Negatif.2 Pemeriksaan ER/PR dan Her2 selain bertujuan untuk penentuan jenis terapi yang terarah dapat digunakan sebagai penentu prognosis kanker payudara invasif.1,2
Sebanyak 12% kanker payudara luminal A dilaporkan memiliki mutasi TP53 sedangkan sub tipe luminal B mengalami inaktivasi TP53 akibat dari hilangnya ATM dan amplifikasi gen MDM2.2 Kanker payudara triple negative
(TNBC) atau dikenal sebagai basal like tumor, teridentifikasi sebagai berikut: (1). Gen BRCA1
mutasi dan mengalami inaktivasi BRCA1; (2). Hilangnya gen RB; (3). Amplifikasi gen Cyclin E1; (4) Ekspresi gen AKT3 yang berlebihan; (5) Gen Myc mengalami amplifikasi dan ekspresi-nya berlebihan; (6) Frekwensi mutasi TP53 meningkat.3 Kanker payudara invasif sub tipe: Triple negative memiliki prognostic terburuk, dibandingkan dengan kelompok lain.3,4
Pada penelitian lain dilaporkan bahwa subtype Her2 positif (over ekspresi) dan tipe luminal ER positif lebih berpeluang berkembang menjadi subtype Basal-Like (triple negative).4
Penentuan prognostic dan prediktif kanker payudara invasif dapat juga dilaksana-kan dengan mengkaji faktor antiangiogenesis seperti Angiostatin dan Trombospondin-1 (TSP-1), karena peningkatan aktivitas angiogenesis atau neovaskularisasi merupakan salah satu ciri keganasan yang dimiliki oleh sel kanker. Angiogenesis berperan penting dalam pertum-buhan tumor dan metastasis. Meningkatnya sensitivitas sel tumor terhadap faktor-faktor pro-angiogenik menunjukkan prognosis penyakit yang memburuk.TSP-1 adalah inhibitor angio-genesis poten, penurunan regulasi ekspresi TSP-1 mengindikasikan adanya pertumbuhan tumor yang di modulasi angiogenesis pada beberapa variasi subtipe tumor. Ekspresi TSP-1 diinduksi oleh P53, regulasi negatif ekspresi TSP-1 diperankan onkogen seperti Myc dan Ras. TSP-1 dihasilkan oleh sel-sel stromal
fibroblast, sel endothelial dan sel imunsupresif. TSP-1 menghambat angiogenesis dengan cara menghambat migrasi sel dan proliferasi endo-telial, dan memacu apoptosis sel ini. Namun pada sisi yang lainnya aktivasi TSP-1 terhadap TGFβ justru akan memacu progresi tumor.5,6
Oleh karena itu dilakukan penelitian untuk menganalisis ekspresi faktor antiangiogenesis thrombospondin-1 (TSP-1) dan angiostatin kanker payudara invasif.
METODE PENELITIAN
Sebanyak 20 (dua puluh) blok parafin jaringan kanker payudara invasif dari pasien Rumah Sakit Dr. Muwardi, Surakarta dibedakan ke dalam 4 kelompok sebagai berikut :
Kelompok I : Luminal A Kelompok II : Luminal B.
Kelompok III : Her2 over-expression
Kelompok IV : Triple-negative/Basal-like.
Penentuan kelompok tersebut didasar-kan pada hasil analisis Immunohistokimia dengan menggunakan monoclonal antibody (MoAb) anti-Human Estrogen receptor (Biocare, dilusi 1:200); MoAb Anti human-Progesteron Receptor (Biocare, dilusi 1:200), dan MoAb Anti human-Her2/c-erbB2 (Santa Cruz 1:100), dengan sistem deteksi Avidin-Biotin Complex (Startrek universal Biocare). Ekspresi TSP1 dan Angiostastin dilaksanakan juga dengan teknik immunohistokimia dengan sistem deteksi yang sama. Penentuan ekspresi kedua faktor anti-angiogenik ini dilakukan dengan MoAb human anti-TSP1 (Santa Cruz, dilusi 1:100) dan MoAb anti-Angiostatin (Santa Cruz, dilusi 1:100). Interpretasi hasil ekspresi dituangkan dalam skala numerik intensity distribution score (IDS). Yang didapatkan dari formula sebagai berikut : IDS = (%Kx3)+(%Sx2)+(%Lx1)+(%Nx0)
Hasil pengamatan ditabulasikan dan dianalisis dengan uji beda berpasangan antar kelompok dengan p=0,05, menggunakan soft ware SPSS versi 20.
HASIL
Vol. 24 No. 3, September 2015 26 gai berikut:
Tabel 1. Nilai IDS TSP-1 dan angiostatin kanker payudara invasif.
Lum.A Lum. B Her-2
Triple negative Basal-like
TSP1 236a 137.6a, b 77 b,c 57.6b,c
Angiostatin 183a 225.6a 231.6a 234.4a
Profil IDS TSP-1 dan angiostatin pada 4 (empat) sub tipe kanker payudara invasif digambarkan dengan grafik berikut ini :
Gambar 1. Profil IDS TSP-1 dan angiostatin pada 4 sub tipe kanker payudara invasif: LA (Luminal A), LB
(Luminal B), Her-2 (Her-2 over expression) dan triple
negatif.
Nilai IDS yang didapatkan berdasarkan perhitungan sel positif TSP-1 (sitoplasmik) dengan warna coklat tua (kategori positif kuat), coklat muda (katergori positif sedang) dan kuning keemasan (kategori positif lemah). Sel negatif yang dihitung adalah sel yang tidak menunjukkan ekspresi warna kecoklatan dan hanya biru dan keunguan. Persentase nilai positif didapatkan dengan memperhitungkannya pada 9 (sembilan) lapang pandang searah jarum jam untuk setiap sediaan. Nilai IDS ditabulasi-kan dan dianalisis dengan uji t. Jarak perbedaan antar kelompok diuji dengan uji beda berpa-sangan antar kelompok (Tabel 1). Huruf indeks yang sama menunjukkan tidak adanya per-bedaan nilai ekspresi antar kelompok yang diuji. Sedangkan huruf indeks yang berbeda menun-jukkan adanya perbedaan yang signifikan antar kelompok (p>0,5). Pada Tabel 1 dijelaskan bahwa nilai IDS angiostatin tidak menunjukkan perbedaan yang bermakna antar kelompok. Sebaliknya nilai IDS TSP1 menunjukkan per-bedaan antara kelompok Luminal A dengan kelompok triple negatif (p=0,016); dan antara luminal A dengan kelompok Her2 over ekspresi (p=0,014). Hasil pewarnaan Immunohistokimia
dirangkum dalam Tabel 2 yang diabadikan pada skala perbesaran 400x.
Tabel 2. Hasil pengecatan immunohistokimia ekspresi TSP-1 dan angiostatin pada 4 sub tipe kanker
payu-dara invasif (paraffin-embeded tissue). Perbesaran
400x .
DISKUSI
Ekspresi TSP1 pada kelompok luminal A (ER dan PR positif, Her2 negatif) menunjukkan nilai tertinggi 236 (IDS) dan terendah dimiliki oleh kelompok triple negative (ER negatif/PR negatif dan Her2 negatif) sebesar 57.6 (IDS). Hal ini menunjukkan bahwa pada sub tipe luminal A memiliki kemampuan yang baik dalam hal aksi antiangiogenesis yang diperankan oleh TSP1. Peran TSP-1 sebagai anti angiogenesis menurut beberapa sumber adalah sebagai faktor induksi apoptosis, mencegah migrasi dan proliferasi sel endotelial.5,6
Vol. 24 No. 3, September 2015 27 hal tersebut TSP-1 juga akan memacu
apop-tosis sel endotelial dalam proses neo-vascularisasi melalui binding-site dengan CD36 juga.5-7
Beberapa kejadian malignansi terkait dengan mutasi pada TP53 sehingga faktor transkripsi P53 tidak dapat berperan dalam menginduksi beberapa gen yang termasuk dalam down-stream effect P53 , seperti: p21, PCNA, PUMA, Noxa, Bax dan TSP-1. Akibatnya jumlah ekspresi gen-gen tersebut akan menurun atau tidak ada sama sekali. Keadaan ini akan mengakibatkan penghambatan 4 (empat) jalur utama fungsi p53, yaitu: penghambatan siklus sel, induksi repair DNA, induksi apoptosis, dan penghambatan angiogenesis. Jadi rendahnya tingkat ekspresi TSP-1 pada sub tipe Her2 dan triple negatif mengindikasinya rendahnya peran P53. Keadaan ini kemungkinan disebabkan oleh adanya mutasi pada hot spot gen TP53. Prognosis sub tipe Her2 over ekspresi dan sub tipe triple negatif makin memburuk dengan menurunnya tingkat ekspresi TSP-1. Menurun-nya TSP-1 dalam hal ini mengindikasikan terpacunya mekanisme angiogenesis. Hasil analisis uji beda antar kelompok menunjukan hasil bahwa antara luminal A tidak berbeda nyata dengan luminal B , sub tipe Her2 over ekspresi tidak berbeda nyata dengan sub tipe Triple negatif. Berdasarkan ekspresi TSP-1 maka dapat diramalkan bahwa progonis terburuk dimiliki oleh sub tipe triple negatif , disusul Her2, luminal B dan prognosis terbaik adalah luminal A (ER dan PR positif, Her2 negatif).5-7
Mekanisme antiangiogenesis yang diperantarai angiostatin Kringle (K)1-3, K1-4 dan K1-4,5 diikuti peningkatan ekspresi p53 berikut
down-streams efektornya, meningkatkan FasL
mediated signaling path-way, dan supresi aktivitas AKT. Setidaknya ada 3 (tiga reseptor yang mengikuti aksi anti angiogenesis angiostatin seperti: Fas, integrin ανβ3 dan ATP sintase. Reseptor-reseptor ini juga berperan dalamaksi anti angiogenesis yang diperankan oleh molekul angiostatin. Angiostatin K1-3, K1-4 dan K1-4,5 melaksanakan aksi anti-angio-genesisnya melalui: penghambatan proliferasi, penghambatan migrasi, tube formation, dan induksi apoptosis sel endotelial. Dilaporkan juga bahwa mekanisme penghambatan angiogenesis yang diperantarai DAP K1 juga diinduksi oleh kehadiran angiostatin.8 Peran Angiostatin
seba-gai faktor anti angiogenesis pada kanker payudara invasif dalam penelitian ini tidak menunjukkan perbedaan yang nyata antar sub tipe kanker payudara nilai p>0.05. Namun dari semua sub tipe kanker payudara invasif yang diuji menunjukan nilai IDS ekspresi Angiostatin yang tinggi 183-234.4 (IDS). Hal ini menunjuk-kan bahwa peran angiostatin sebagai faktor anti angiogenesis masih cukup baik. Angka tertinggi dimiliki oleh kelompok triple-negatif (234.4 IDS) dan terendah dimiliki luminal A (183 IDS). Ekspresi angiostatin dalam penelitian ini tidak menggambarkan buruknya prognosis kanker payudara invasif.9-11
Peneliti terdahulu menyatakan bahwa masih perlu kajian lain digunakan sebagai pendukung seperti: grading histologi, tipe histopatologi, nottingham progostic index (NPI), status ER, PR dan Her2.12
KESIMPULAN
Ekspresi TSP-1 mengindikasikan prognosis kanker payudara invasive, semakin tinggi nilai ekspresi TSP-1, prognosis kanker payudara invasif semakin baik. Ekspresi Angiostatin tidak mengindikasikan prognosis kanker payudara invasif .
UCAPAN TERIMAKASIH
Riset ini dibiayai dari dana BOPTN Universitas Sebelas Maret No. kontrak 165/UN27.11/ PN/2013. Ucapan Terimakasih dan penghar-gaan kami sampaikan kepada LPPM Universitas Sebelas Maret Surakarta. identification of primary and secondary target genes regulated by p53. Oncogene 2001; 20: 2225-34.
3. Perou CM. Molecular statisfication of triple negative breast cancer. Oncologist. 2011; 16: 67-70.
Vol. 24 No. 3, September 2015 28 sub-types of invasive breast carcinoma. J
Clin Cancer Res. 2004;10: 5367-74.
5. Perou CM. The Cancer Genome Atlas Network: Comprehensive molecular portrait of human breast tumours. Nature 2012; 490: 61-70.
6. Yanagawa M, Ikemot K, Kawauchi S, Furuya T, Yamamoto S, Oka M et al. Luminal A, luminal B (Her2 negative) subtypes breast cancer consist of mixture of tumors with diference genotype. Licensee Bio Med Central Ltd. 2012; 5: 375.
7. Pecorino L. Molecular Biology of Cancer: Mechanism, Targets, and Therapeutics. Oxford: Oxford University Press; 2005. 8. Chen YH, Wu HL, Li C, Huang YH, Chiang
CW, Wu MP, et al. Antiangiogenesis mediated by angiostatin 3, 4 and
K1-4.5. Involvement of p53, FasL, AKT and mRNA deregulation. Thromb Haemost. 2006; 95: 668-77.
9. Cianfrocca M, Goldstein LJ. Prognostic and predictive factors in early-stage breast cancer. Oncologist. 2004; 9: 606-16.
10. Kerbel RS. Tumor angiogenesis: past, present and the near future. J Carcinogen 2000; 21: 505-15.
11. Winters ZE, Hunt NC, Brandburn MJ, Royds JA, Turley H, Harris AL et al. Subceluller localisation of cyclin B, cdc2 and p21, in breast cancer, asscociation with prognosis. Eur J Cancer. 2001; 37: 2405-12.
