i
ABSTRAK
PEMODELAN MOLEKUL, SINTESIS, DAN UJI AKTIVITAS
ANDROGRAFOLID DAN TURUNANNYA SEBAGAI
INHIBITOR PROTEASE UNTUK ANTI-HIV
OlehSandra Megantara
NIM: 30713002
(Program Studi Doktor Farmasi)
Andrografolid yang merupakan senyawa diterpenoid utama dari tanaman sambiloto (Andrographis paniculata), diketahui mempunyai banyak aktivitas biologi diantaranya sebagai antimalaria dan anti-HIV. Studi in silico menunjukkan bahwa andrografolid dapat berinteraksi dengan plasmepsin, protease aspartat dari
Plasmodium falciparum. Protease aspartat merupakan keluarga enzim protease
yang menggunakan dua residu asam aspartat sebagai katalis pembelahan substrat peptida dalam sintesis protein. Plasmepsin diketahui mempunyai kemiripan struktur dengan protease HIV-1. Hasil analisis bioinformatika menunjukkan urutan asam amino pada kantung aktif plasmepsin II, dan IV mirip dengan protease HIV-1 (p=0,00003). Dari data tersebut, maka disusun hipotesis bahwa andrografolid mempunyai aktivitas sebagai antimalaria dan anti-HIV yaitu karena dapat berinteraksi pada protease aspartat yang sama sebagai inhibitor protease.
Secara umum penelitian ini bertujuan untuk menelaah interaksi andrografolid dengan protease aspartat, dan mendapatkan senyawa baru turunan andrografolid dengan aktivitas anti-HIV yang lebih aktif dari senyawa penuntunnya. Tahapan penelitian diawali dengan kajian in silico yang mencakup pengembangan dan validasi protokol penapisan maya berbasis struktur (PMBS), prediksi interaksi andrografolid dengan residu asam amino di dalam kantung aktif protease melalui penambatan molekul, pemodelan farmakofor, modifikasi molekul, prediksi aktivitas dan karakter absorpsi, distribusi serta toksisitas andrografolid dan senyawa turunannya. Pada tahap akhir dilakukan sintesis dan karakterisasi senyawa baru turunan andrografolid, serta uji aktivitas secara in vitro terhadap protease HIV-1. Kajian in silico diawali dengan pengembangan dan validasi protokol PMBS untuk mengidentifikasi inhibitor protease aspartat pada plasmepsin I, II, IV dan protease HIV-1. Protokol yang dikembangkan bertujuan untuk menghasilkan prosedur penambatan molekul yang valid, cepat dan terotomatisasi. Struktur kristal yang digunakan adalah 3QS1, 1SME, 1LS5 dan 1XL2 yang diperoleh dari Protein Data
Bank (PDB). Program SPORES, Open Babel, PLANTS1.2, dan shell script MGLTools1.5.6 digunakan untuk preparasi awal ligan dan reseptor. Program AutoDock Vina 1.1.2 digunakan dalam proses penambatan ulang, dilanjutkan
dengan program PLANTS1.2 dan PyPLIF 0.1.1 untuk penskoran ulang sidik jari interaksi. Program PyMOL dan PoseView digunakan untuk perhitungan root mean
ii
square deviation (RMSD) dan visualisasi hasil penambatan ulang. Validasi
retrospektif dilakukan terhadap basis data inhibitor protease HIV-1 yang diperoleh dari Database of Useful Decoys Enhanced (DUD-E), di mana kualitas penapisan dihitung dari koefisien Tanimoto (Tc) dan energi bebas ikatan (Ei) yang dihasilkan. Nilai RMSD terbaik untuk plasmepsin I, II, IV dan protease HIV-1 berturut-turut adalah 1,1 Å, 1,2 Å, 1,7 Å dan 0,8 Å. Faktor pengayaan pada 1% positif palsu (EF1%) untuk Tc dan Ei adalah 18,26% dan 9,03%, sedangkan luas area di bawah kurva (AUC) untuk Tc dan Ei adalah 76,84% dan 60,95%. Protokol yang dikembangkan menunjukkan kualitas PMBS yang lebih baik dari protokol aslinya dengan nilai AUC 59,58%. Penelitian ini memberikan data awal untuk melakukan PMBS yang valid dalam mengidentifikasi inhibitor protease.
Hasil penambatan molekul andrografolid pada plasmepsin I, II, IV, dan protease HIV-1 menggunakan protokol PMBS yang telah divalidasi, menunjukkan bahwa andrografolid dapat berinteraksi pada semua protease aspartat yang diuji, dengan nilai koefisien Tanimoto (Tc), energi bebas ikatan (Ei) dan konstanta inhibisi (Ki) berturut-turut adalah Tc = 0,38; Ei = -9,8 kkal/mol; Ki = 0,07 µM (plasmepsin I), Tc = 0,35; Ei = -8,7 kkal/mol; Ki = 0.42 µM (plasmepsin II), Tc = 0,31; Ei = -8,8 kkal/mol; Ki = 0,35 µM (plasmepsin IV), Tc = 0,32; Ei = -8,2 kkal/mol; Ki = 0,98 µM (protease HIV-1). Studi ini membuktikan bahwa andrografolid dapat mengikat asam amino yang penting pada kantung aktif plasmepsin I, II, IV, dan protease HIV-1 dengan membentuk ikatan hidrogen, baik sebagai donor maupun akseptor dengan residu asam amino aspartat, yang menyerupai pepstatin, suatu inhibitor protease. Oleh karena itu, berdasarkan kesamaan mode ikatan andrografolid dengan pepstatin, maka andrografolid diprediksi dapat bekerja sebagai inhibitor protease pada plasmepsin dan protease HIV-1.
Pemodelan farmakofor andrografolid di dalam kantung aktif protease HIV-1 divalidasi terhadap training set yang diperoleh dari DUD-E yaitu sebanyak 536 ligan aktif dan 35.750 decoys. Fitur farmakofor yang dihasilkan menunjukkan terjadinya tiga interaksi hidrofobik dan dua ikatan hidrogen dengan dua residu asam amino aspartat. Gugus hidroksil pada atom C-14 bertindak sebagai akseptor ikatan hidrogen dengan Asp29 dengan energi bebas dan jarak ikatan -9,4 kkal/mol dan 2,6 Å. Gugus hidroksil pada atom C-19 bertindak sebagai donor ikatan hidrogen dengan Asp25 dengan energi bebas dan jarak ikatan -2,3 kkal/mol dan 3,7 Å. Modifikasi molekul dilakukan berdasarkan masih adanya ruang hidrofobik kosong pada kantung aktif protease HIV-1, oleh karena itu ditambahkan gugus alkil atau hidroksibenzaldehid untuk memperpendek ikatan hidrogen dengan Asp25 sehingga kekuatan ikatan dan afinitasnya menjadi lebih besar.
Modifikasi tersebut menghasilkan delapan turunan andrografolid, yaitu 12,13-dihidro andrografolid, 3-metil andrografolid, 3-etil andrografolid, 3-propil andrografolid, 3-benzil andrografolid, serta tiga turunan hidroksibenziliden andrografolid, yaitu 3,19-2’-hidroksibenziliden andrografolid (SM-1), 3,19-3’-hidroksibenziliden andrografolid (SM-2) dan 3,19-4’-hidroksibenziliden andrografolid (SM-3). Pengujian prediksi, absorpsi, distribusi dan toksisitas menunjukkan andrografolid dan turunannya diserap dengan baik di usus, memiliki permeabilitas sedang pada sel Caco-2, terikat kuat pada protein plasma dan tidak
iii
menunjukkan sifat mutagenik atau karsinogenik. Hasil prediksi aktivitas menunjukkan bahwa SM-1, SM-2 dan SM-3 merupakan tiga senyawa terbaik dengan afinitas yang paling tinggi pada protease HIV-1.
Dalam penelitian ini telah berhasil disintesis senyawa SM-1, SM-2 dan SM-3 menggunakan reaktor sintesis gelombang mikro, dengan mereaksikan andrografolid dan hidroksibenzaldehid menggunakan katalis piridinium p-toluen sulfonat (PPTS) pada kondisi optimum suhu 50° C, kekuatan iradiasi 300 Watt, dan kecepatan pengadukan 200 rpm selama 3 jam. Pemurnian dilakukan dengan cara ditambahkan trietilamin, diencerkan dengan benzena dan kemudian dicuci dengan air 3 kali, lapisan organik dipisahkan dan dikeringkan dengan natrium sulfat anhidrat. Pemurnian lebih lanjut dilakukan dengan kromatografi kolom (silika gel 45 ~ 75 m, Wakogel C-300) dengan menggunakan kloroform - metanol (20:1) sebagai eluen. Hasil sintesis turunan andrografolid mempunyai pemerian serbuk berwarna putih, titik leleh 140-142°C (SM-1), 167-170°C (SM-2), 192-194°C (SM-3) dan rendemen 85% (SM-1) , 86% (SM-2), 86% (SM-3). Hasil karakterisasi dengan spektroskopi IR, MS, C-NMR dan H-NMR menunjukkan kesesuaian dengan struktur yang diharapkan.
Potensi inhibitor protease HIV-1 diuji secara in vitro menggunakan fluorometric
assay kit. Prinsip pengukuran berdasarkan kemampuan protease HIV-1 untuk
memecah substrat peptida sintetik dan melepaskan fluorofor yang dapat dideteksi pada panjang gelombang eksitasi 330 nm dan emisi 450 nm menggunakan
fluorescence microplate reader. Suatu inhibitor protease akan menghambat
pemecahan substrat peptida dan mengurangi kadar fluorofor yang dilepaskan. Hasil pengujian menunjukkan IC50 untuk pepstatin dan lopinavir yang diisolasi dari tablet Aluvia® berturut-turut adalah 1,61 µM dan 1,12 µM. Sedangkan andrografolid dan turunannya SM-1, SM-2, dan SM-3 memiliki IC50 yang lebih besar dari kedua standar inhibitor protease yang digunakan yaitu berturut-turut 18,14 µM; 10,72 µM; 9,93 µM; dan 8,32 µM. Data ini menunjukkan turunan andrografolid lebih aktif dari andrografolid sebagai senyawa penuntunnya, tetapi potensinya masih rendah dari kedua standar inhibitor protease. Meskipun demikian, mengingat sudah banyaknya resistensi terhadap obat-obat inhibitor protease yang ada, senyawa baru turunan andrografolid masih berpotensi untuk digunakan sebagai alternatif anti-HIV. Kata Kunci: Andrographis paniculata, andrografolid, hidroksibenziliden
iv
ABSTRACT
MOLECULAR MODELLING, SYNTHESIS, AND ACTIVITY
STUDY OF ANDROGRAPHOLIDE AND ITS ANALOGUES
AS PROTEASE INHIBITORS FOR ANTI-HIV
By
Sandra Megantara
NIM: 30713002
(Doctoral Program in Pharmacy)
Andrographolide, a major diterpenoid compound of Andrographis paniculata, has been known for its many bioactivities such as antimalarial and anti-HIV. In silico study showed that andrographolide could be interact with plasmepsin, the aspartic protease from Plasmodium falciparum. Aspartic protease was a family of protease enzymes that used two aspartic acid residues for catalytic cleavage of their peptide substrate in protein synthesis. Plasmepsin was known to have a structural similarity with the HIV-1 protease. Based on bioinformatics analysis which revealed that there was similarity of amino acid sequence of plasmepsin II and IV with HIV-1 protease (p=0.00003). From these data, it was assumed that andrographolide had activity as antimalarial and anti-HIV by interacted with aspartic proteases as protease inhibitors.
In general, this research was aimed to study the molecular mechanism of andrographolide with aspartic protease, and to obtain the novel analogues of andrographolide with better anti-HIV activity than their lead compound. This research was started with in silico study which comprises of developing and validating the structure-based virtual screening (SBVS) protocol, predicting the interaction of andrographolide and aspartic acid residues in the active site by molecular docking simulation, pharmacophore modelling, modifying andrographolide molecule, and predicting the bioactivity, absorption, distribution and toxicity properties of andrographolide and its analogues. Synthesis and characterization of andrographolide analogues followed by in vitro study on their inhibitory activity against HIV-1 aspartic proteases were carried out as the final step.
In silico study was performed by developing SBVS protocol to identifying aspartic protease inhibitor in plasmepsin I, II, IV and HIV-1 protease. The developed-protocol was applied to validate and automate molecular docking procedure of andrographolide and its analogues to aspartic protease. Proteins used were 3QS1, 1SME, 1LS5 and 1XL2 obtained from Protein Data Bank (PDB). Programs used for ligand and receptor preparation were SPORES, Open Babel, PLANTS1.2, and MGLTools1.5.6 shell script. AutoDock Vina 1.1.2 was used in redocking process continued PLANTS1.2 and PyPLIF 0.1.1 for finger print interaction scoring. PyMOL and PoseView were used to calculating the root mean square deviation
v
(RMSD) and visualizing the redocking result. Retrospective validation was performed by using the database of useful decoys enhanced (DUD-E) of HIV-1 inhibitors, where Tanimoto coefficient (Tc) and the binding energy (Ei) were employed. The best RMSD value of plasmepsin I, II, IV and HIV-1 protease are 1.1 Å, 1.2 Å, 1.7 Å, and 0.8 Å, respectively. The enrichment factor 1% of false positive (EF1%) for Tc and Ei was 18.26% and 9.03%, whereas the AUC was 76.84% and
60.95%, respectively. The developed protocol showed a better SBVS compared to the original, with AUC 59.58%. This work provides a solid baseline to perform a valid SBVS in identifying protease inhibitors.
The molecular docking of andrographolide into plasmepsin I, II, IV, and HIV-1 protease by using validated SBVS protocol, revealed that this ligand interacts against all test targets. Tanimoto coefficient (Tc), binding affinity (Ei) and inhibition constants (Ki) values were Tc = 0.38; Ei = -9.8 kcal/mol; Ki = 0.07 µM (plasmepsin I), Tc = 0.35; Ei = -8.7 kcal/mol; Ki = 0.42 The µM (plasmepsin II), Tc = 0.31; Ei = -8.8 kcal/mol; Ki = 0.35 µM (plasmepsin IV), Tc = 0.32; Ei = -8.2 kcal/mol; Ki = 0.98 µM (HIV-1 protease) respectively. This study proved that andrographolide binds to important aspartic acid residues in the active site of plasmepsin I, II, IV, and HIV-1 protease by forming hydrogen bonds both as donor (HBD) and acceptor (HBA), as showed by pepstatin, an aspartic protease inhibitor. Therefore, based on the similarity of the binding mode of andrographolide with pepstatin, andrographolide could be predicted work as protease inhibitor in plasmepsin and HIV-1 protease.
Pharmacophore modeling study of andrographolide in the catalytic pocket of HIV-1 protease was validated against the training set obtained from DUD-E of 536 active ligands and 35,750 decoys. Pharmacophore features revealed three hydrophobic interactions and two hydrogen bonds with two aspartic acid residues. The hydroxyl group at C-14 acts as HBA to Asp29 with binding affinity and bond distance were -9.4 kcal/mol and 2.6 Å respectively,. The hydroxyl group at C-19 acts as HBD to Asp25 with binding affinity and bond distance were -2.4 kcal/mol and 3.7 Å respectively. Molecular modification was performed to occupy the empty hydrophobic space in the active site of HIV-1 protease, therefore an alkyl or hydroxyl benzaldehyde moiety could be added to shorten the hydrogen bond distance with Asp25 and this would consequently strengthen the binding affinity.
These particular modifications resulted eight andrographolide analogues which were 12,13-dehydro andrographolide, 3-methyl andrographolide, 3-ethyl andrographolide, 3-propyl andrographolide, 3-benzyl andrographolide, and three hydroxybenzylidene andrographolides e.g. 3,19-2’-hydroxybenzylidene andrographolide (SM-1), 3,19-3’-hydroxybenzylidene andrographolide (SM-2), and 3,19-4’-hydroxybenzylidene andrographolide (SM-3). Absorption, distribution and toxicity prediction of andrographolide and its analogues showed well absorbed in the intestine, medium permeability in Caco-2 cells, strongly bound to plasma proteins and no mutagenic or carcinogenic properties. The prediction of bioactivity showed that SM-1, SM-2 and SM-3 were the three best compounds with highest affinity in HIV-1 protease.
vi
This work had successfully synthesized compound SM-1, SM-2 and SM-3 using microwave synthesis reactor, where andrographolide and hydroxybenzaldehyde were mixed and treated with pyridinium p-toluene sulfonate (PPTS) catalyst at the optimum condition 50° C, 300 Watts irradiations and 200 rpm stirring speed for 3 hours. Purification was carried out by the addition of triethylamine, diluted with benzene and then washed with water 3 times. The organic layer was separated and dried with anhydrous sodium sulfate. Further purification was performed by column chromatography (silica gel 45 ~ 75 m, Wakogel C-300) using a mixture of chloroform - methanol (20:1) as the eluent. All synthesized andrographolide analogues appear as white powder, melt in the range of 140-142 ° C (SM-1), 167-170 ° C 2), 192-194 ° C 3) and their yields were 85% 1), 86% (SM-2), 86% (SM-3). The characterization using IR spectroscopy, MS, 13C-NMR and 1H-NMR showed correlations in accordance with the expected structure.
The inhibitory activity against HIV-1 protease was measured by in vitro method using Fluorometric Assay Kit. The principle of this measurement is based on the ability of HIV-1 protease to breakdown and to release the synthetic peptide substrate fluorophore that could be detected at wavelengths 330 nm of excitation and 450 nm of emission using a fluorescence microplate reader. Protease inhibitor would inhibit the breakdown of peptide substrates and consequently reduces the amount of fluorophore released. The results showed that IC50 for pepstatin and
lopinavir isolated from Aluvia® tablets were 1.61 μM and 1.12 μM, respectively.
While the andrographolide and its analogues SM-1, SM-2, and SM-3 had greater IC50 than the two standard protease inhibitors used were 18.14 μM, 10.72 μM, 9.93
μM, and 8.32 μM respectively. These data showed that andrographolide analogues more active than andrographolide as lead compound, but the potency were still low from both standard of protease inhibitors. However, due to the many drugs resistance for existing protease inhibitors, the new andrographolide analogues still potential to be used as anti-HIV alternative.
Keywords: Andrographis paniculata, andrographolide, HIV-1 protease,
