DETEKSI TRANSMISI TRANSOVARIAL VIRUS DEN3 PADA
SEMUA STADIUM
Aedes aegypti
SECARA IMUNOSITOKIMIA
DENGAN KONFIRMASI
RT-PCR
TESIS
Disusun untuk memenuhi sebagian persyaratan memperoleh gelar Magister
Program Studi Biosain
oleh :
Adhi Kumoro Setya S-901302001
PROGRAM PASCA SARJANA
UNIVERSITAS SEBELAS MARET
SURAKARTA
commit to user
DETEKSI TRANSMISI TRANSOVARIAL VIRUS DEN3 PADA
SEMUA STADIUM
Aedes aegypti
SECARA IMUNOSITOKIMIA
DENGAN KONFIRMASI
RT-PCR
TESIS
Disusun untuk memenuhi sebagian persyaratan memperoleh gelar Magister
Program Studi Biosain
oleh :
Adhi Kumoro Setya S-901302001
PROGRAM PASCA SARJANA
UNIVERSITAS SEBELAS MARET
SURAKARTA
DETEKSI TRANSMISI TRANSOVARIAL VIRUS DEN3 PADA
SEMUA STADIUM
Aedes aegypti
SECARA IMUNOSITOKIMIA
DENGAN KONFIRMASI
RT-PCR
TESIS
Oleh
Adhi Kumoro Setya S-901302001
Telah disetujui oleh tim pembimbing
Komisi Nama Tanda Tanggal
pembimbing Tangan
Pembimbing I Prof. Dr. Sugiyarto, M.Si ...
...NIP. 19670430 199203 1 002 ... ...2015
Pembimbing II dr. Ir. Ruben Dharmawan, Ph.D
NIP. 195111201986011001 ... ...2015
Mengetahui
Ketua Program Studi Biosain
Program Pasca Sarjana
commit to user
DETEKSI TRANSMISI TRANSOVARIAL VIRUS DEN3 PADA
SEMUA STADIUM
Aedes aegypti
SECARA IMUNOSITOKIMIA
DENGAN KONFIRMASI
RT-PCR
TESIS
Oleh
Adhi Kumoro Setya S-901302001
Jabatan Nama Tanda tangan Tanggal
Ketua Dr. Agung Budiharjo, S.Si., M.Si
NIP. 196808232000031001 ... ... Sekretaris Dr. Ari Susilawati, S.Si., M.Si
NIP. 196904281997022006 ... ... Anggota Prof. Dr. Sugiyarto, M.Si
NIP. 196704301992031002 ... ... dr. Ir. Ruben Dharmawan, Ph.D
NIP. 195111201986011001 ... ...
Telah dipertahankan di depan penguji
Dinyatakan telah memenuhi syarat
Pada tanggal ... 2015
Mengetahui,
Direktur Program Pascasarjan UNS
Prof. Dr. M. Furqon Hidayatullah, M.Pd
NIP. 196107171986011001
Ketua Program Studi
Dr. Ari Susilawati, S.Si., M.Si
PERNYATAAN ORISINALITAS DAN PUBLIKASI TESIS
Saya menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa:
1. Tesis yang berjudul: ”Deteksi Transmisi Transovarial Virus DEN3 Pada Semua
Stadium Aedes aegypti Secara Imunositokimia Dengan Konfirmasi RT-PCR” ini
adalah karya penelitian saya sendiri dan tidak terdapat karya ilmiah yang pernah
diajukan oleh orang lain untuk memeroleh gelar akademik serta tidak terdapat karya
atau pendapat yang pernah ditulis atau diterbitkan oleh orang lain, kecuali yang
secara tertulis dikutip dalam naskah ini dan disebutkan dalam sumber kutipan dan
daftar pustaka. Apabila ternyata di dalam naskah Tesis ini dapat dibuktikan terdapat
unsur-unsur jiplakan, maka saya bersedia Tesis ini beserta gelar MAGISTER saya
dibatalkan, serta diproses sesuai dengan peraturan perundang-undangan yang berlaku
(UU No.20 Tahun 2003, pasal 25 ayat 2 dan pasal 70)
2. Tesis ini merupakan hak milik Prodi Biosain PPs-UNS. Publikasi sebagian atau
keseluruhan isi Tesis pada jurnal atau forum ilmiah lain harus seijin Ketua-Prodi
Biosain PPs-UNS dan minimal satu kali publikasi menyertakan tim pembimbing
sebagai author. Apabila dalam waktu sekurang-kurangnya satu semester (6 bulan
sejak pengesahan Tesis) saya tidak mengajukan publikasi dari sebagian atau
keseluruhan Tesis ini, maka Prodi Biosains PPs-UNS berhak mempublikasikannya
pada jurnal ilmiah yang diterbitkan oleh Prodi Biosain PPs-UNS dan atau media
ilmiah yang ditunjuk. Apabila saya melakukan pelanggaran dari ketentuan publikasi
ini, maka saya bersedia mendapatkan sanksi akademik yang berlaku
Surakarta, Juli 2015
Mahasiswa
Adhi Kumoro Setya
commit to user
Adhi Kumoro Setya. 2015. Deteksi Transmisi Transovarial Virus DEN3 Pada
Semua Stadium Aedes aegypti Secara Imunositokimia Dengan Konfirmasi
RT-PCR. TESIS. Pembimbing I: Prof. Dr. Sugiyarto, M.Si., II: dr. Ir. Ruben Dharmawan, Ph.D. Program Studi Biosain, Program Pascasarjana, Universitas Sebelas Maret Surakarta
ABSTRAK
Salah satu penyakit berbahaya akibat virus yang ditularkan oleh vektor nyamuk adalah demam berdarah dengue (DBD). Tidak hanya di Indonesia virus ini banyak menimbulkan masalah kesehatan masyarakat dunia, bahkan upaya pemberantasan DBD belum berhasil sampai saat ini. Di alam, keberadaan virus dengue terpelihara dengan baik dalam tubuh vektornya dalam mekanisme penularan horizontal dan transovarial. Penelitian virus dengue dari isolat nyamuk Aedes spesies belum banyak dilakukan. Penelitian ini bertujuan untuk mendeteksi penularaan transovarial virus dengue secara imunositokimia sebagai prosedur untuk deteksi dini potensi terjadinya DBD.
Penelitian diawali dengan peremajaan virus DEN3 dari stok dalam media kultur essensial C6/36, sampai deteksi terjadinya transovarial menggunakan pemeriksaan imunositokimia metode SBPC (Streptavidine Biotin Peroxidase Complex) dengan antibodi DSSC7. Penelitian ini menggunakan kontrol positif dari kultur virus dan kontrol negatif dari sampel darah probandus yang tidak diinfeksi virus. Sebanyak 12 A. aegypti betina umur 1 minggu yang belum terkontaminasi diinfeksikan virus DEN3 secara peroral dan dibiakan untuk diperiksa terjadinya penularan transovarial. Hasil positif adanya antigen DEN3 dalam tubuh vektor akan berikatan dengan antibodi spesifik dari reagen dan dengan adanya enzim serta substrat kromogen akan muncul warna coklat pada sel dan granula disekitar sel. Sampel yang mendapat peluang diperiksa, diperoleh dengan cara pengundian dan dinyatakan sebagai hasil Transovarial Index Rate (TIR)
Hasil penelitian menunjukkan metode imunositokimia SBPC mampu mendeteksi adanya virus DEN3 pada semua stadium metamorfose A. aegypti dengan nilai TIR stadium telur 82%, larva 89%, pupa 94% dan dewasa 100%. Konfirmasi dengan RT-PCR menunjukan semua induk betina hasil pembiakan positif mengandung virus DEN3 yang teramplifikasikan sebagai gen E (penyandi protein envelope) berukuran 538bp. Dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa virus DEN3 terbukti terpelihara secara transovarial dalam vektornya (A. aegypti) dan metode imunositokimia SBPC dengan antibodi DSSC7 dapat dipakai sebagai prosedur deteksi dini potensi terjadinya DBD.
Adhi Kumoro Setya. 2015. The Detection of Transovarial Transmission of DEN3
Virus on All of Aedes aegypti Stadium Immunocytochemistry with RT-PCR
Confirmation. Thesis. Supervisor I: Prof. Dr. Sugiyarto, M.Sc., Supervisor II: dr. Ir.
Ruben Dharmawan, Ph.D. Bioscience Studies Program, Graduate Program, Sebelas Maret University of Surakarta
ABSTRACT
One of the dangerous diseases was caused by a virus transmitted by mosquito vectors is Dengue Hemorrhagic Fever (DHF). Not only in Indonesia this virus was caused a lot of health problems in the world community, even the DHF eradication efforts have not been successful to date. In nature, the presence of dengue virus in the body is well-maintained in the body vector in the transmission mechanism of horizontal and transovarial. The studies of dengue virus from Aedes species isolates are rare. This study was aimed detect the transovarial transmission of dengue virus immunocytochemistry as procedures for early detection of potential occurrence of DHF.
The study begins with the rejuvenation of the DEN3 virus stock in culture media of C6/36 essential, to detect the occurrence of transovarial used immunocytochemistry examination with SBPC (Streptavidine Biotin Peroxidase Complex) methods with DSSC7 antibodies. This study was used positive control of virus culture and negative control of probandus blood samples was not infected virus. A total of 12 females A. aegypti aged 1 week were not been contaminated by the DEN3 virus orally and cultured to examine the transovarial occurrence. The positive results of DEN3 antigen in the vector body will be related to the specific antibodies from reagents and in the presence of enzyme and chromogen substrate will appear brown on cells and granule surrounding the cells. The samples had chance to examined, obtained by the draw and expressed as a result of Transovarial Index Rate (TIR)
The study results were showed SBPC immunocytochemistry method are capable to detect the presence of DEN3 virus at all stages of A. aegypti metamorphosis with TIR value of egg stage is 82%, larva is 89%, pupa and adult is 94% to 100%. The RT-PCR confirmation was showed all of the female parent from culture results were positive for the DEN3 virus were amplificated as E gene (encoding of protein envelope) measured of 538bp. From the study result can be concluded that the DEN3 virus are proven transovarially maintained in vector (A. aegypti) and immunocytochemistry method of SBPC with DSSC7 antibodies can be used as an early detection procedure of DHF potential.
commit to user
MOTTO
HALAMAN PERSEMBAHAN
Karya ini saya persembahkan kepada:
Tuhan Yang Maha Esa
Orang Tuaku
Semua Guru Dan Dosenku
Sisilia Tri Nastiti
commit to user
KATA PENGANTAR
Puji syukur ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa, atas berkat dan kasih karunianya, sehingga penulis dapat menyelesaikan dan menyajikan penelitian Tesis yang berjudul: “Deteksi Transmisi Transovarial Virus DEN3 Pada Semua Stadium Aedes aegypti Secara Imunositokimia Dengan Konfirmasi RT-PCR”. Penyusunan tesis ini merupkan salah satu persyaratan untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program studi Biosain, Program Pascasarjana, Universitas Sebelas Maret, Surakarta.
Percobaan deteksi transovarial DEN3 dalam laboratorium, diawali dengan peremajaan virus DEN3 dari stok dalam media kultur essensial agar berpropagasi. Untuk kemudian diinfeksikan secara peroral ke dalam 12 A. aegypti induk dan dibiakan. 12 stadium keturunan yang terbentuk diuji keberadaan antigennya secara imunositokimia metode SPBC dengan anti bodi DSSC7. Hasilnya di baca secara kualitatif dan derajad transovarial disajikan dalam “Transovarial Index Rate (TIR)”. Untuk mempertegas keberhasilan imunositokimia dilakukan konvirmasi pemeriksaan RT-PCR pada stadium akhir metamorfose. Di dalam tulisan ini, disajikan pokok-pokok bahasan yang meliputi persiapan virus dan vektor A. aegypti untuk siap diteliti, penyisipan virus dan pembiakan nyamuk, serta pemeriksaan imunositokimia dan PCR.
Nilai penting dalam penelitian ini adalah menambah alternatif pemeriksaan akibat virus dengue pada vektornya sehingga diharapkan dapat memberikan informasi dan pengetahuan tentang penanggulangan penyakit DBD sedini mungkin sebelum jatuhnya korban ataupun meledaknya kejadian kasus sakit (KLB). Hasil yang diperoleh dapat disimpulkan bahwa metode imunositokimia metode SBPC dengan antibodi DSSC7 dapat dipergunakan untuk pemeriksaan virus dengue dalam tubuh vektornya dengan nilai TIR pada stadium telur 82%, larva 89%, pupa 94% dan dewasa 100%. Keberhasilan deteksi transovarial penelitian ini dipertegas dengan pemeriksaan RT-PCR yang memperlihatkan hasil amplifikasi semua induk betina memperlihatkan band pita sejajar terhadap primer D3 yang dipakai.
Penulis menyadari bahwa penelitian ini masih banyak kekurangan dan keterbatasan, oleh sebab itu penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun agar tulisan ini bermanfaat bagi banyak pihak.
Surakarta, Januari 2015
UCAPAN TERIMA KASIH
Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih yang tak terhingga kepada:
1. Prof. Dr. Ravik Karsidi, M.S selaku rektor Universitas Sebelas Maret Surakarta
yang telah memberikan izin studi di Universitas Sebelas Maret Surakarta.
2. Prof. Dr. M. Furqon Hidayatullah, M.Pd selaku Direktur Program Pascasarjana
Universitas Sebelas Maret Surakarta yang telah memberikan izin studi di Program
biosain Pascasarjana Universitas Sebelas Maret Surakarta.
3. Dr. Ari Susilowati, S.Si., M.Si selaku Ketua Program Studi Biosain sekaligus
penguji tesis atas segala ilmu dan saran selama proses penelitian.
4. Prof. Dr. Sugiyarto, M.Si selaku dosen pembimbing I yang telah sabar memberikan
bimbingan, petunjuk dan dukungan dalam proses penyusunan tesis ini.
5. dr. Ir. Ruben Dharmawan, Ph.D selaku dosen pembimbing II yang telah
memberikan bimbingan, arahan serta dukungan selama penulis melaksanakan
penelitian sampai terselesaikannya tesis.
6. Prof. dr. Supargiyono, DTM&H., SU., Sp.Par(K)selaku kepala bagian Parasitologi
Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada atas ijin yang diberikan untuk
melakukan penelitian.
7. Drh. Siti Rahmah Umniyati, SU selaku supervisi di lapangan yang telah
memberikan banyak ilmu, pengetahuan dan masukan demi keberhasilan tesis ini.
8. Ibu Supriatin yang telah membantu pelaksanaan penelitian baik secara teknis
maupun non teknis.
9. Semua dosen di Prodi Biosain yang telah memberikan ilmu pengatahuan dan
wawasan kepada mahasiswa.
10. Keluarga besar Akademi Analis Kesehatan Nasional Surakarta yang selalu
memberikan dukungan dan semangat kepada penulis untuk menyelesaikan studi di
commit to user
DAFTAR ISI
HALAMAN JUDUL ... i
HALAMAN PENGESAHAN PEMBIMBING ... ii
HALAMAN PENGESAHAN PENGUJI ... iii
PERNYATAAN ORISINALITAS DAN PUBLIKASI TESIS ... iv
ABSTRAK ... v
2. Demam Berdarah Dengue ... 13
3. Virus Dengue ... 18
B. Kerangka Pemikiran ... 26
C. Hipotesis ... 27
A. Tempat dan waktu Penelitian ... 28
B. Jenis Penelitian ... 28
C. Subjek Penelitian ... 28
D. Sumber Data Penelitian ... 28
E. Teknik Sampling ... 28
F. Alat dan Bahan Penelitian ... 29
1. Imunositokimia ... 29
2. RT-PCR ...29
G. Prosedur Penelitian ... 30
1. Persiapan sel C6/36 dan virus DEN3 ... 30
2. Persiapan sampel nyamuk ... 31
3. Pemeriksaan imunositokimia ... 31
4. Pemeriksaan RT-PCR pada induk A. aegypti ... 33
H. Pembacaan data penelitian ... 35
I. Alur penelitian ... 36
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. Peremajaan DEN3 dari stok kedalam media kultur ... 37
B. Penginfeksian DEN3 hasil propagasi ke dalam A. aegypti induk ... 39
C. Deteksi DEN3 dengan imunositokimia SBPC ... 39
D. Konfirmasi hasil dengan RT-PCR ... 43
BAB V. PENUTUP A. Kesimpulan ... 44
B. Saran ... 44
DAFTAR PUSTAKA ... 46
commit to user
DAFTAR TABEL
Tabel 1. Primer untuk pemeriksaan One-Step Multiplex RT-PCR ...34
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Morfologi dewasa Aedes aegypti dengan ciri lyre form ... 5
Gambar 2. Aedes aegypti, bentuk gelap dan bentuk pucat ... 6
Gambar 3. Perbedaan thorax Aedes aegypti kiri dengan Aedes albopictus ... 6
Gambar 4. Siklus hidup Aedes aegypti ... 7
Gambar 5. Telur Aedes aegypti ... 8
Gambar 6. Larva Aedes aegypti (kiri) dengan comb di segmen kedelapan ... 9
Gambar 7. Pupa Aedes aegypti ... 10
Gambar 8. Negara-negara atau daerah di dunia dengan kasus infeksi dengue... 14
Gambar 9. Angka Insiden DBD per 100.000 Penduduk di Indonesia Tahun 1968–2009 ... 15
Gambar 10. Perjalanan khas demam berdarah dengue 35 ... 17
Gambar 11. Struktur bola virus dengue ... 19
Gambar 12. Genom virus dengue mengkodekan tiga struktural (kapsid [C], membran [M], dan amplop [E]) dan tujuh protein nonstruktural (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, dan NS5) ... 19
Gambar 13. Prinsip reaksi imunositokimia metode streptavidin- biotinperoxidase-complex (SBPC) ... 23
Gambar 14. Sel C6/36 yang sebelum dan sesudah DEN3 berpropagasi ... 26
Gambar 15. Hasil kontrol negatif berwarna biru dan kontrol positif berwarna coklat ... 36
Gambar 16. Hasil positif pemeriksaan imunositokimia memperlihatkan warna coklat pada stadium telur, larva, pupa dan dewasa ... 40
Gambar 17. Unsur pengotor (artefak) pada pengecatan imunositokimia ... 42
commit to user
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Bahan-bahan kultur virus DEN3 ... 51
Lampiran 2. Peremajaan virus DEN3 pada sel C6/36 ... 52
Lampiran 3. Inkubasi dalam suasana anaerob (CO2 inkubator) ... 53
Lampiran 4. Persiapan penginfeksian virus DEN3 dalam A. aegypti induk ... 54
Lampiran 5. Pembiakan induk A. aegypti positif DEN3 ... 57
Lampiran 6. Pembuatan preparat squash dan pengecatan imunositokimia ... 58
Lampiran 7. Hewan percobaan mencit ... 59
Lampiran 8. Set alat RT-PCR ... 60
