15
TINJAUAN PUSTAKA Sapi Bali (Bos javanicus)
Sapi Bali (Bos javanicus) diduga berasal dari hasil domestikasi banteng liar (Bibos banteng). Payne dan Rollinson (1973) menduga asal mula sapi Bali adalah dari Pulau Bali mengingat tempat ini merupakan pusat distribusi sapi Bali di Indonesia. Nozawa (1979) menduga gen asli sapi Bali berasal dari Pulau Bali yang kemudian menyebar luas ke daerah Asia Tenggara, dengan kata lain bahwa pusat gen sapi Bali adalah di Pulau Bali.
Sapi Bali mempunyai ciri-ciri fisik yang seragam, dan hanya mengalami perubahan kecil dibandingkan dengan leluhur liarnya (banteng).Warna sapi betina dan anak atau sapi muda biasanya cokelat muda dengan garis hitam tipis terdapat di sepanjang tengah punggung. Warna sapi jantan adalah cokelat ketika muda tetapi kemudian warna ini berubah agak gelap pada umur 12-18 bulan sampai mendekati hitam pada saat dewasa, kecuali sapi jantan yang dikastrasi akan tetap berwarna coklat. Pada kedua jenis kelamin terdapat warna putih pada bagian belakang paha (pantat), bagian bawah (perut), keempat kaki bawah (white stocking) sampai di atas kuku, bagian dalam telinga, dan pada pinggiran bibir atas (Payne dan Rollinson, 1973; Hardjosubroto dan Astuti, 1993).
Kemampuan produksi sapi Bali dapat dilihat dari beberapa indikator sifat-sifat produksi seperti bobot lahir, bobot sapih, bobot dewasa, laju pertambahan bobot badan, sifat-sifat karkas (persentase karkas dan kualitas karkas), maupun sifat reproduksi seperti dewasa kelamin, umur pubertas, jarak beranak (calving interval), persentase beranak. Beberapa sifat produksi dan reproduksi tersebut merupakan sifat penting/ekonomis yang dapat dipergunakan sebagai indikator seleksi (Handiwirawan dan Subandriyo, 2004).Pubertas sapi Bali dicapai pada kisaran umur 20–24 bulan untuk sapi betina sedangkan pada sapi jantan dicapai pada umur 24–28 bulan (Pane,1991).Beberapa peneliti telah melaporkan bahwa sapi Bali mempunyai tingkat kesuburan yang sangat baik, walaupun dalam kondisi lingkungan yang kurang baik sapi Bali masih mampu mempertahankan sifat ini. Menurut Pane (1991) tingkat kebuntingan (conception rate) sapi Bali mencapai 85,9%, persentase beranak berkisar antara 70%-81%,meskipun tidak jelas namun terdapat bulan-bulan dimana banyak terjadi perkawinan. Pane (1991) melaporkan bahwa terdapat kenaikan perkawinan
16 pada bulan Agustus sampai Januari dan tertinggi pada bulan Oktober dan Nopember, sementara itu bulan Pebruari sampai dengan Juni merupakan bulan-bulan dengan perkawinan lebih rendah dan bulan dimana perkawinan paling rendah yaitu pada bulan Mei.
Spermatogenesis
Menurut Russell (1990) proses spermatogenesis merupakan proses yang kompleks dan berlangsung terus menerus untuk menghasilkan spermatozoa yang haploid dari suatu sel spermatogonia yang diploid. Proses ini terdiri dari tiga tahap, yaitu tahap proliferasi (spermatositogenesis), tahap miosis dan fase diferensiasi (spermiogenesis). Proses proliferasi sel induk spermatogonia tipe A yang belum berdeferensiasi akan mengalami mitosis untuk menghasilkan dua spermatogonia tipe A yang sama. Bagian penting dari fase ini adalah fase ketika spermatogonia akan didaur ulang, karena ada beberapa spermatogonia hasil pembelahan yang tidak berkembang dan mengalami degenerasi dan terjadi apoptosis sel, sehinggamemberi tempat bagi spermatogonia yang lain yang tidak mengalami degenerasi (Senger, 2003).
Proses meiosis dihasilkan spermatosit sekunder dari spermatosit primer. Selama fase ini, keragaman genetic yang akan dibawa oleh spermatozoa matang nantinya bergantung pada replikasi DNA dan crossing over, sehingga tidak ada dua sperma yang memiliki sifat identik. Pada fase ini, dihasilkan spermatid yang bersifat haploid (n). Pada proses diferensiasi atau spermiogenesis, spermatid yang semula berbentuk bulat akan mengalami transformasi bentuk dengan keberadaan kepala yang mengandung materi genetik, ekor dan midpiece yang mengandung mitochondrial helix. Keseluruhan germ-cell yang belum dewasa akan berada pada membrane basal tubuli seminiferi (Senger, 2003).
Spermatogenesis dipengaruhi oleh faktor-faktor endogen dan eksogen. Faktor endogen meliputi hormonal, psikologis, dan genetik. Faktor eksogen dapat berupa bahan kimia dan obat-obatan, suhu, radiasi sinar-X, getaran ultrasonic, vitamin, gizi, trauma dan peradangan. Berlangsungnya spermatogenesis pada tubulus seminiferus melibatkan hipotalamus, hipofisis dan testis. Gonadotropin Releasing Hormone (GnRH) hipotalamus merangsang hipofisis anterior untuk mensekresikan Luteinizing Hormone (LH) dan Follicle Stimulating Hormone (FSH).
17 LH memberikan rangsangan untuk perkembangan sel Leydig yang akan memproduksi hormon testosteron, sedangkan FSH berpengaruh langsung terhadap perkembangan sel sertoli dalam tubulus seminiferus dan meningkatkan sintesis protein pengikat hormon androgen atau Androgen Binding Protein (ABP). ABP merupakan glikoprotein yang mengikat testosteron.Testosteron yang dihasilkan oleh sel Leydig diangkut dengan konsentrasi yang tinggi ke tubulus seminiferus (Lachland et al., 1996).
Gambar 1. Proses Spermatogenesis.
Sumber : Cummings (2008)
Sperma
Diferensiasi (Sel Sertoli menyediakan Nutrisi Spermatosit Sekunder Pembelahan Meiosis I Pembelahan Meiosis II Spermatid awal Spermatosit Primer Pembelahan Mitosis Pembelahan Mitosis
Sel Tunas Primordia pada Embrio
Pembelahan Mitosis Sel Batang
Spermatogonia
18
Proses Perkembangan Folikel (Folikulogenesis) dalam Ovarium
Perkembangan folikel atau folikulogenesis terjadi pada masa prenatal dan postnatal. Proses awal perkembanganfolikel terjadi pada masa prenatal. Proses awal perkembangan folikel terjadi pada masa prenatal (Wandji et al., 1996). Folikulogenesis dimulai dengan perekrutan folikel primordial pada folikel yang sedang tumbuh dan berakhir dengan ovulasi atau mati karena atresia. Folikulogenesis dapat dibagi menjadi dua tahap. Tahap pertama, disebut fase preantral atau gonadotropinindependen, ditandai oleh pertumbuhan dan diferensiasi oosit. Tahap kedua, disebut fase antral atau gonadotropin-dependent, ditandai dengan peningkatan yang luar biasa dari ukuran folikel itu sendiri (sampai kira-kira 25-30 mm). Tahap preantral dikendalikan oleh faktor-faktor pertumbuhan yang diproduksi secara lokal melalui mekanisme autokrin / parakrin. Tahap kedua diatur oleh FSH dan LH serta oleh faktor pertumbuhan. Faktor pertumbuhan memberikan pengaruh yang besar karena dapat merangsang proliferasi sel dan memodulasi aksi gonadotropin (Williams dan Erickson, 2012).
Gambar 2.Proses Folikulogenesis.
Sumber : (Picton et al., 1998)
Proses folikulogenesis terjadi dalam korteks ovarium. Folikulogenesis dapat dianggap sebagai proses untuk mencapai tingkat yang lebih tinggi dari organisasi melalui proliferasi sel dan cytodiferensiasi. Proses ini mencakup empat peristiwa perkembangan utama: 1) perekrutan folikel primordial, 2) perkembangan folikel preantral, 3) seleksi dan pertumbuhan folikel antral, dan 4) atresia folikel (Williams dan Erickson, 2012). 1 Pembentukan folikel primordia (35 µm) 2 Pengerahan dan pertumbuhan folikel (46-200 µm) 3 Pembentukan rongga antral (200-500 µm) 4 Pertumbuhan dan Pematangan folikel de Graaf
(>6000 µm) Pengembangan antrum Perkembangan Folikel 1 PGC 2 Oogonia 3 Permulaan Meiosis 4 Oosit diploid (2n4C) Perkembangan Oosit 5
Pertumbuhan oosit secara meiosis : Replikasi dan redistribusiorganel sitoplasma Transkripsi, translasi, dan Pentimpanan mRNA
Sintesis zona pellucida
6 Oosit Matang
(2n4C)
Blokade Meiosis (Diplotene pada Profase I
19 Folikel primordial mengandung oosit yang berada dalam tahap profase I, tetapi belum menyelesaikan pembelahan meiosis pertamanya sampai mencapai masa pubertas. Folikel yang mengandung oosit akan mengalami perkembangan ketika hewan mencapai masa pubertas. Sel epitel yang mengelilingi oosit berubah menjadi epitel kubus sebaris dan disebut dengan folikel primer (Wandji et al., 1996).Folikel primer berkembang menjadi folikel sekunder dengan karakteristik telah bertambahnya sel epitel yang mengelilingi oosit sampai dengan 5 lapis sel. Zona pelusida mulai terbentuk pada folikel sekunder, sebagai suatu lapisan tipis di sekeliling oosit (Rachmawati, 2011).
Folikel tersier merupakan folikel antral yang akan berkembang menjadi folikel de Graaf. Folikel ini memiliki karakteristik telah terbentuknya antrum folikuli, yaitu ruangan yang terbentuk akibat perkembangan sel-sel folikuler.Antrum folikuli pada awalnya terpisah, tetapi kemudian bersatu menjadi suatu ruangan berbentuk bulan sabit. Antrum folikuler terus membesar hingga mendesak sel telur menuju tepian folikel hingga akhirnya terjadi proses ovulasi (Rachmawati, 2011).
Fertilisasi In vitro Maturasi Oosit
Maturasi oosit merupakan proses biologi yang kompleks dimana oosit primer menjadi oosit sekunder yang siap difertilisasi. Proses ini merupakan peristiwa pembelahan meiosis dari profase pada meiosis I ke metaphase pada meiosis II (Tornell et al., 1991).Beberapa faktor yang sangat berkompeten dalam keberhasilan pematangan oosit adalah morfologi kumulus, ukuran folikel, kesehatan folikel, stimulasi ovarium, prosedur penanganan oosit sebelum mulai inkubasi dan lamanya oosit diinkubasi (Sirard dan Blondin, 1996). Menurut Chian et al. (1994) oosit yang matang akan ditandai dengan keadaan oosit yang sulit dipisahkan secara individu dan pengebangan sel-sel kumulus yang melebar dan cerah serta adanya badan kutub I. Fungsi sel kumulus sangat penting pada proses maturasi sel telur secara in vitro.Sel telur yang tanpa kumulus, setelah proses maturasi akan banyak kehilangan protein, sedangkan pada sel telur dengan sel kumulus intact protein akan tertahan. Penghilangan sel-sel kumulus pada awal maturasi In vitro akan menurunkan potensi perkembangan oosit (Maedomari et al., 2007). Kualitas oosit sangat mempengaruhi hasil akhir produksi embrio in vitro, oosit dengan kualitas A dan B saja yang dipilih
20 untuk proses maturasi in vitro. Menurut Saito(1995), oosit yang dikoleksi dikelompokkan dalam tiga kategori yaitu :Kategori A,adalah oosit yang dikelilingi oleh sel-sel kumulus yang banyak (lebih dari 3 lapis) dan kompak dengan ooplasma yang homogeny; Kategori B,adalah oosit yang hanya sebagian permukaan oosit yang dilapisi oleh sel-sel kumulus atau hanya dikelilingi oleh kurang dari 3 lapis sel-sel kumulus dengan ooplasma yang homogeny; dan Kategori C,adalah oosit yang tidak dilapisi oleh sel-sel kumulus (denuded oocyte) atau oosit yang dikelilingi oleh sel-sel kumulus yang sangat sedikit.
Suhu yang ideal untuk maturasi In vitroadalah 38,5°C (NLBC, 2005). Sirard dan Blodin (1996) yang menyatakan bahwa maturasi sel telur secara In vitroberlangsung antara 18-24 jam. Menurut Chian et al.(1994) waktu maturasi yang terlalu lama dapat menghasilkan oosit yang terlalu tua dan mengakibatkan terganggunya proses fertilisasi in vitrodan akan mempengaruhi perkembangan embrio selanjutnya.
Media maturasi yang dikenal memiliki kemampuan baik untuk pematangan oosit secara In vitro adalah TCM-199 dengan berbagai modifikasinya. TCM-199 diperkaya dengan garam earl, sodium bicarbonate, hepes, pyruvate, laktat, asam amino dan vitamin adalah salah satu standar medium untuk pematangan oosit sapi dan domba (Rutledge et al., 1997).Penambahan 5% CO2 perlu dilakukan untuk menjaga media
tetap stabil, serta perlu ditambahkan antibiotika untuk mencegah kontaminasi jasad renik dan pertumbuhan mikroorganisme di dalam medium yang dapat mengganggu perkembangan oosit.
Kapasitasi Sperma
Kapasitasi sperma adalah rangkaian proses biokimia dan reaksi fisiologis pada spermatozoa (Gordon, 1994). Sedangkan menurut Furuya et al.(1992), kapasitasi adalah perubahan biokimia yang menyebabkan reaksi akrosom (acrosome reaction/AR) pada sperma sebagai respon dari zona pelusida oosit.Menurut Kato dan Iritani (1991) kapasitasi sperma sebelum dilakukan fertilisasi in vitrobertujuan untuk meningkatkan aktivitas dan pergerakan sperma serta untuk menghilangkan sifat stabil dari membran plasma tersebut.
Menurut Gordon (1994) kapasitasi spermatozoa in vitrodapat dilakukan antara lain dengan cara menginkubasi sperma pada medium yang kadar ionik dan pH sesuai,
21 menambah kalsium ionophore atau dilaurylfosfatidylcholine liposome, prainkubasi sperma dengan glycosaminoglycans dan heparin. Konsentrasi sperma lxl06/ml yang telah dikapasitasi dalam BO medium yang ditambahkan 10 µl/ml heparin menyebabkan sperma dapat menembus 85%-95% sel telur (Kato dan Iritani, 1991).
Hasil penelitian Im et al. (1995) menyatakan bahwa pada BO medium digunakan Heparin 0,1 IU/mL dan kafein 5mM sebagai agen kapasitasi, sedangkan pada TALP medium digunakan Heparin 0,1 IU/mL, hypotaurine 10 µM, epinephrine 1 µM dan penicillamine 20 µM sebagai agen kapasitasi sperma. Oosit yang diinseminasi dengan sperma yang dikapasitasi dengan medium fertilisasi yang menggunakan BO medium menghasilkan persentase yang terfertilisasi sebesar 67,4% dan yang membelah 23,3%.
Fertilisasi
Fertilisasi adalah suatu proses yang komplek dimana terjadi penggabungan dua gamet, perubahan jumlah kromosom somatic (n menjadi 2n) dan awal dari pertumbuhan individu baru (Gordon, 1994). Hafez dan Hafez (2000) mendefinisikan fertilisasi sebagai penyatuan materi DNA paternal dan maternal pada embrio. Selanjutnya dijelaskan bahwa proses fertilisasi secara in vivo maupun in vitropada mamalia prinsipnya hampir sama yaitu melalui rangkaian tiga proses yang terdidri dari migrasi sperma pada sel-sel kumulus, penempelan sperma dan migrasi melalui zona pellucida, dan penempelan dan penetrasi sperma pada zona pellucida serta penyatuan garnet. Menurut McGeady et al. (2006) fertilisasi merupakan proses bertemunya sel sperma dengan sel telur. Sel telur diaktivasi untuk memulai perkembangannya dan inti sel dari dua gamet akan bersatu untuk menyempurnakan proses reproduksi seksual. Penetrasi spermatozoa ke dalam membrane vitelin mengaktifasi sel telur untuk melengkapi proses miosisnya dan mengeluarkan badan kutub kedua. Kromosom yang terkandung dalam pronukleus jantan haploid bersatu dengan kromosom dalam pronukleus betina. Proses penyatuan kedua kromososm tersebut disebut dengan singami. Sebagai konsekuensi dari fertilisasi, jumlah kromosom kembali menjadi diploid, jenis kelamin suatu individu ditentukan, dan variasi biologis dihasilkan dari integrasi karakteristik herediter paternal dan maternal.
22 Menurut Sumantri et al. (1997) lama waktu fertilisasi yang baik adalah 5 jam. Semakin lama waktu fertilisasi akan menurunkan persentase pembentukan blastosis yang dihasilkan dan meningkatkan persentase polyspermia. Lama fertilisasi yang tepat akan menghasilkan jumlah oosit yang terfertilisasi menjadi optimal sehingga perkembangan embrio dapat berjalan dengan baik (Chian et al., 1994). Menurut Hunter (1995) ada beberapa faktor yang harus dipertimbangkan agar fertilisasi in vitro dapat berhasil. Faktor-faktor tersebut meliputi : sumber dan kondisi sperma, kualitas oosit yang diperoleh dan pemilihan medium (medium maturasi, fertilisasi dan kultur), volume mikro drop yang yang digunakan untuk biakan dan konsentrasi sperma di dalamnya serta kondisi peralatan dan medium yang benar-benar aseptik untuk menghindari terjadinya kontaminasi.
Kultur Embrio
Embrio berkembang lebih lambat dalam medium kimiawi pada kultur in vitro dibandingkan dengan in vivo, hal ini menunjukkan bahwa saluran reproduksi menjadi faktor spesifik yang diperlukan dalam pertumbuhan dan perkembangan optimal pada sel telur (Pratt, 1987). Kemampuan sel telur untuk bertahan dalam kultur in vitro tergantung pada spesies, tahap perkembangan sel telur, kandungan fisik dan biokimia pada media, suhu penyimpanan, tingkat pendinginan dan penghangatan sel telur, serta teknik penyimpanan dan transfer sel telur.
CR1aa mengandung media minimum dasar penting yang merupakan campuran dari asam amino, vitamin, garam-garam anorganik, ribonucleosides dan deoxyribonucleosides. Komponen utama yang lain dari CR1aa adalah medium basal eagle, yang merupakan campuran suplemen asam amino tambahan, vitamin dan garam-garam anorganik (Rosenkrans et al., 1993; Sagirkaya et al., 2004). Situmorang et al. (1998) melaporkan bahwa perbandingan ko-cultur BOEC (Bovine Oviduct Epithelial Cells) dan CRlaa, mengasilkan angka blastosis pada hari ketujuh dan delapan adalah 10% dan 8,8% untuk zigot yang dikultur dengan BOEC, dibandingkan dengan yang dikultur dalam CRlaa adalah 22% dan 18% masing-masing pada hari ketujuh dan kedelapan.
23
Perkembangan dan Pembelahan Embrio
Proses perkembangan embrional pada mamalia diawali dengan terjadinya pembuahan sel telur oleh sperma sehingga terbantuk zigot. Zigot merupakan bentuk paling awal dari perkembangan hewan dan sering disebut juga sebagai sel telur yang terbuahi. Zigot akan mengalami proses pembelahan secara mitosis yang disebut dengan istilah cleavage. Pembelahan pertama dari satusel menjadi dua sel, masing-masing anak hasil pembelahan disebut blastomer. Masing-masing blastomer selanjutnya akan membelah menjadi 4, 8, 16 sel dan seterusnya (McGeady, 2006).
Gambar 3.Perkembangan Embrio Sapi.
Sumber :Lechniak et al. (2008).
Sel telur yang telah diovulasi akan mengalami beberapa tahapan setelah diaktifasi maupun difertilisasi oleh sel sperma. Sel telur akan berkembang menjadi zigot kemudian melakukan pembelahan awal menjadi 2, 4, dan 8 sel hingga mengalami kompaksi dan disebut dengan morula,kemudian morula berkembang menjadi blastosis yang memiliki stuktur terdiri atas blastosul, Inner Cell Mass (ICM), trofoblast, dan zona pelusida. Selanjutnya blastosis akan keluar dari zona pelusida
Oosit matang Embrio 2 sel Embrio 3-4 sel
24 (hatching) untuk kemudian berimplantasi pada dinding uterus (Hogan, 1994).
Kecepatan pembelahan embrio sangat bervariasi pada spesies hewan. Pada mencit dan mamalia lainnya kecepatan pembelahan tergantung dari strainnya, namun secara umum akan menghabiskan waktu 3,5 hari untuk perkembangan dari mulai tahap pembelahan sel (cleavage)sampai dengan tahap blastosis (Kispert dan Gossler, 2004).
Pada mamalia, pembelahan awal terjadi selama 24 jam kemudian pembelahan selanjutnya terjadi pada interval setiap 12 jam hingga hari ketiga. Berbeda dengan pembelahan in vivo, proses pembelahan pada in vitro mengalami pelambatan sehingga membutuhkan waktu 48 jam setelah fertilisasi. Sinkronisasi pembagian blastomer pun terjadi pada tahap awal sehingga dapat ditemukan tahapan tiga, lima, enam, atau tujuh blastomer pada proses secara in vitro (McGeady et al., 2006).
Pengaruh Persilangan dan Heterosis
Persilangan ada 2 macam yaitu silang dalam (inbreeding) dan silang luar. Silang dalam (inbreeding) adalah persilangan antarternak yang memiliki hubungan keluarga yang lebih dekat jika dibandingkan dengan rataan hubungan kekerabatan kelompok tempat ternak tersebut berada. Hubungan kekerabatan tersebut bisa hubungan langsung maupun hubungan kolateral. Silang dalam mengakibatkan adanya peningkatan derajat homozigositas dan menurunkan derajat heterozigositas. Laju peningkatan homozigositas akibat silang dalam pada suatu individu tergantung dari seberapa dekat hubungan kekerabatan kedua tetuanya(Noor, 2008).
Silang luar merupakan persilangan antarternak yang memiliki hubungan kekerabatan lebih jauh dari rataan hubungan kekerabatan kelompok asal ternak. Silang luar berpengaruh dalam meningkatkan proporsi gen-gen heterozigot dan menurunkan proporsi gen homozigot. Pada umumnya heterozigositas akan meningkatkan daya hidup embrio yang akan meningkatkan jumlah anak per kelahiran. Pada babi, peningkatan litter size dapat meningkat 0,5-1 anak per kelahiran. Peningkatan ini disebabkan oleh heterosis pada ternak hasil persilangan yang tetuanya adalah ternak murni. Pada sapi dan domba perhitungan berdasarkan jumlah anak yang dilahirkan per 100 betina yang dikawinkan. Peningkatan sifat ini dapat mencapai 5%-10% pada sapi hasil persilangan.
25
Kelahiran Ganda (Twinning)
Kelahiran ganda bertujuan untuk meningkatkan efisiensi biologis dan ekonomis dari ternak sapi betina.Berbagai penelitian melaporkan bahwa kelahiran ganda dapat meningkatkan efisiensi biologis dan ekonomis pada sapi potong sebesar 20%-25% (Gordon, 1994). Program kelahiran ganda adalah salah satu inovasi rekayasa bioteknologi yang diharapkan bisa mempercepat peningkatan populasi ternak sapi potong sekaligus upaya untuk menghasilkan sapi potong dengan kualitas genetik unggul. Program kelahiran ganda (twinning) dapat dilakukan melalui kombinasi Inseminasi Buatan (IB) dan Transfer Embrio (TE) atau dengan TE dua embrio(Suzuki et al., 1994). Suzuki et al. (1994) melaporkan bahwa TE baik menggunakan embrio yang diproduksi secara in vivo maupun in vitro, pada resipien yang telah di IB sebelumnya merupakan metode yang paling efektif untuk meningkatkan jumlah pedet.
Lu dan Polge (1991) melaporkan bahwa keberhasilan tingkat kebuntingan sebesar 77% dan keberhasilan tingkat kelahiran ganda sebesar 65%. Balai Embrio Ternak (2011) melaporkan bahwa keberhasilan tingkat kebuntingan sebesar 36,78% dan keberhasilan tingkat kelahiran ganda sebesar 43,52%.
