Escherichia coli YANG DIISOLASI DARI KUCING DAN

(1)

DETEKSI GEN PENYANDI RESISTENSI ANTIBIOTIK PADA

Escherichia coli

YANG DIISOLASI DARI KUCING DAN

LINGKUNGAN KLINIK HEWAN DI KOTA BOGOR

Yamin Yaddi

(B253180051)

Prof. Dr .drh. Fachriyan Hasmi Pasaribu

_{Dr. drh. Safika, M.Kes}

Komisi Pembimbing:

PRASEMINAR

PROGRAM STUDI MIKROBIOLOGI MEDIK

SEKOLAH PASCASARJANA

IPB UNIVERSITY

(2)

intestinal

intraintestinal

ekstraintestinal

Patogen

Peningkatan

populasi

Berada di luar

habitatnya

LATAR BELAKANG

Makanan

Lingkungan

Flora normal

(3)

IntraIntestinal

**

EkstraIntestinal

*

UTI

SEPEC

PYOMETRA

PROSTITIS

Patogen

EPEC

ETEC

EHEC

EAEC

EIEC

LATAR BELAKANG

VAGINITIS

**(Mitchell dan Gu 2010)

Antibiotik

Infeksi primer/ sekunder

Seleksi bakteri

resisten

(Nam et al. 2010;

Rini et al. 2017)

Inang

Peningkatan populasi bakteri

resisten (Bryan et al. 2004)

Lingkungan

Cemaran bakteri resisten di

lingkungan

(Ishii dan Sadowsky 2008)

*(Gyles et al. 2010)

Penggunaan antibiotik yang

irasional (Papic 2013; Bourely

(4)

Tujuan Penelitian

LATAR BELAKANG

1. Mengisolasi Escherichia coli dari kucing dan lingkungan dari klinik

hewan di Kota Bogor

2. Mengukur tingkat resistensi Escherichia coli terhadap antibiotik

golongan tetrasiklin (OTC, TE, DO), kuinolon (CIP, ENR) dan β-laktam

(AMP, AML)

3. Mendeteksi gen penyandi resistensi antibiotik isolat Escherichia coli

yang menunjukan resisten dan intermediate pada uji resistensi

(5)

METODE PENELITIAN

September 2019 – September 2020

➢ Isolasi, identifikasi dan uji resistensi (Lab Bakteriologi)

➢ Deteksi gen penyandi resistensi (Lab terpadu, Divisi Mikrobiologi Medik,

FKH-IPB)

84 sampel

64 sampel usap

rektal

20 sampel usap

lingkungan

10 sampel usap lantai

ruang pemeriksaan

10 sampel usap saluran

pembuangan

(6)

TSA

Biokimia

Koloni Spesifik

Hijau metalik

EMBA

TSIA

Fermentasi

Karbohidrat

Urea

Simmons

Citrate Agar

MR-VP broth

Sulfida Indol

Motility

I M

V

i

C

Isolasi dan Identifikasi

Gram negatif

Merah/ batang

Ektraksi DNA

Presto

TM

_{Mini gDNA bacteria kit (Geneaid)}

Gen target (

gen

uspA,

884 bp

*)

(F) 5′-CCGATACGCTGCCAATCAGT-3′

(R) 5′-ACGCAGACCGTAGGCCAGAT-3′

Vol total reaksi 25 μl :

(12 μl Mytaq

TM

_{HS Red Mix}

3 μl template DNA

2 μl primer forward

2 μl primer reverse

6 μl ddH2O

Master Mix PCR

1 Predenaturasi 95 °C, 3 Menit

Amplifikasi DNA 30 siklus :

Denaturasi 95 °C, 30 detik

Annealing 58 °C, 15 detik

Ekstensi 72 °C, 1 menit

Ekstensi akhir 72 °C, 5 menit

Thermocycler

2 Gel elektroforesis 1% agarosa

TEA buffer 1 (×)

Pewarnaan 1 μl FloroSafe DNA Stain

Leader DNA 100 bp

Visualisasi

3 *Chen dan Griffiths 1998

METODE PENELITIAN

Makroskopis, Mikroskopis,

Biokimia

Molekuler

(7)

Uji Resistensi Antibiotik

Metode Disk Diffusion Kirby-bauer

Isolat (+) E.coli

Mcfarland 0,5

(1.5 x 10

8

_CFU/ml)

1 ml suspensi

Pada

Muller-Hilton

Disk diffusion

Antibiotik MHA

Pembacaan Hasil

TSA

NaCl Fisiologis

* CLSI 2018

(8)

Deteksi Gen Penyandi

Resistensi

Sumber:

a

_{Randal et al. (2004),}

b

_{Robicsek et al. (2006),}

c

_{Colomb et al. (2003),}

d

_{Van et al. (2008),}

e

_{Lyimo et al. 2016.}

Tetrasiklin

Kuinolon

(9)

HASIL DAN

PEMBAHASAN

Isolasi dan Identifikasi

*Ijong dan Dien 2011

EMBA

Biokimia

Asal kucing

Asal

lingkungan

87,50 % (56) E. coli

55% (11/20) pertumbuhan koloni

35% (7/20) koloni dugaan E. coli

(20% (4) UP & 15% (3) UL)

Morfologi

100% (71) Gram negatif

Asal kucing

Asal lingkungan

35% (7) E. coli

100% (64) diduga E. coli

(10)

Konfirmasi

E.coli

dengan PCR

23 isolat usap rektal

A

B

Kelangsungan hidup E. coli selama masa

pertumbuhan,

membantu

adhesi

dan

motilitas (Mishra et al.2017) yang diinduksi

akibat tekanan dari lingkungan (Nacin et al.

2005).

Produksi protein sitoplasmik saat hambatan

pertumbuhan. Transkripsi dari gen uspA

dihentikan

bila

kebutuhan nutrien

telah

terpenuhi

(Nystrom dan Neidhardt 1992 )

7 isolat usap lingkungan

Gen uspA

30 isolat positif gen uspA 884 bp

bp bp bp bp bp bp bp bp

(11)

Uji Resistensi

Permeabilitas dinding sel

(Giguere et al. 2013)

Sintesis protein

(Markley danWencewicz 2018)

Sintesis asam nuleat

(Bradley dan Jackson 2006)

Mekanisme Resistensi

• Biokimia: enzimatik (inaktivasi antibiotik), efflux pumps, dan merubah/

modifikasi target

• Genetik (mutasi dan transfer gen horizontal )

Guilfole 2007

Antibiotik

Hasil uji resistensi

R

I

S

(%)

β-laktam

Ampisilin

_Amoksisilin

22 ₂₀

a

/ 7

_{/ 7}

b

-

₂

a

/ -

_{/ -}

b

₁

1 a

a

_{/ -}

/ -

b

_86,96

95,65

a

_{/ 100}

/ 100

b

Kuinolon

Ciproflokasin

11 a

_{/ 2}

b

₃

a

_{/ 2}

b

₉

a

_{/ 3}

b

_47,83

a

_{/ 28,57}

b

Enrofloksasin

16 a

_{/ 3}

b

₄

a

_{/ 3}

b

₃

a

_{/ 2}

b

_69,57

a

_{/ 42,86}

b

Tetrasiklin

18 a

_{/ 7}

b

₃

a

_{/ -}

b

₂

a

_{/ -}

b

_78,26

a

_{/ 100}

b

Oksitetrasiklin

21 a

_{/ 7}

b

_-

a

_{/ -}

b

₂

a

_{/ -}

b

_91,30

a

_{/ 100}

b

Doksisiklin

11 a

_{/ 4}

b

₉

a

_{/ 3}

b

₃

a

_{/ -}

b

_47,83

a

_{/ 57,14}

b

Keterangan: R (resistant), I (Intermediate), S (Susceptible).

(12)

Jumlah

antibiotik

Jumlah Isolat

Resisten

Persentase (%)

1 -

a

_{/ -}

b

₀

a

_{/ 0}

b

2

1 a

_{/ 1}

b

_4,37

a

_{/ 14,29}

b

3

3 a

_{/ -}

b

_13,04

a

_{/ 0}

b

4

5 a

_{/ 1}

b

_21,73

a

_{/ 14,29}

b

5

4 a

_{/ 3}

b

_17,39

a

_{/ 42,85}

b

6

5 a

_{/ 1}

b

_21,73

a

_{/ 14,29}

b

7

5 a

_{/ 1}

b

_21,73

a

_{/ 14,29}

b

Uji Resistensi

Multiresisten

• Akumulasi gen yang menyandi sifat resisten

terhadap satu antibiotik dalam plasmid

• Peningkatan ekspresi gen penyandi pompa efflux

(Nikaido 2009)

Perpindahan gen resisten

Bakteri Gram negatif (Aleksun dan Levy 2015)

Melalui

- transduksi (bakteriofag)

- konjugasi (plasmid dan transposon)

- transformasi (mutasi DNA)

(Levy dan Marshall 2004)

Keterangan: R (resistant), I (Intermediate), S (Susceptible).

a

_{isolat asal kucing (n=23),}

b

_{isolat asal lingkungan (n=7).}

95,65% (22/23) isolat asal kucing

85,71% (6/7) isolat asal lingkungan

(13)

Deteksi Gen Penyandi

Resistensi

Isolat asal kucing & lingkungan

I

a

II

b

Protein Tet mediator mekanisme efflux, proteksi protein dan inaktivasi enzim (Bryan

et al.

2004)

Protein qnr

melindungi DNA gyrase dan topoisomerase IV (Rezazadeh

et al

. 2016), berperan dalam inaktivasi

antibiotik dan penurunan konsentrasi intraseluler (efflux pumps) (Baguy et al. 2014)

Beta-Lactamase (

bla

) Enzim Beta-lactamase

menonaktifkan cincin karbon/nitrogen (Paterson dan Bonomo 2005).

(14)

Deteksi Gen Penyandi

Resistensi

Isolat asal lingkungan

▪ Sumber air (Sarker et al. 2019)

▪ lingkungan peternakan sapi (Sobur et al. 2019)

▪ lingkungan klinik hewan (Tuerena et al. 2016)

(15)

Deteksi Gen Penyandi

Resistensi

Amplifikasi Gen ESBL

Isolat asal kucing(A)

8,70% gen ESBL

- gen blaCTXM (866 bp), gen blaSHV (768) gen blaTEM (516) 2 isolat

- gen blaCTXM (866 bp), gen blaTEM (768) 1 isolat

- gen blaSHV (768) gen blaTEM (516) 1 isolat

Isolat asal lingkungan (B)

14,29% gen ESBL

- gen blaCTXM (866 bp) dan gen blaTEM (516) 1 isolat

- gen blaSHV (768) negatif

A

B

Transfer gen horizontal dalam satu spesies maupun

berbeda (Manoharan

et al.

2011).

(16)

KESIMPULAN DAN SARAN

Kesimpulan

1. Escherichia coli dapat diisolasi dari kucing dan lingkungan klinik

hewan di Kota Bogor

2. Isolat Escherichia coli dari kucing dan lingkungan menunjukan

resisten terhadap antibiotik golongan β-laktam, kuinolon dan

tetrasiklin dengan variasi yang berbeda pada setiap golongan dan

klinik (terdapat isolat yang multiresisten)

3. Gen blaTEM, blaCTXM, tetA dan qnrS terdeteksi pada isolat asal

kucing dan lingkungan, sedangkan gen blaSHV hanya terdeteksi

pada isolat asal kuncing

(17)

Saran

KESIMPULAN DAN SARAN

Perlu adanya regulasi yang mengatur tentang standar penggunaan

antibiotik dalam penanganan kasus infeksius maupun non infeksius

pada klinik hewan.

Diperlukan penelitian lanjutan untuk mengukur tingkat resistensi

Escherichia coli isolat hewan kesayangan lainnya (anjing) terhadap

antibiotik yang sering digunakan di klinik hewan serta mengukur

tingkat homologi gen penyandi resistensi antara hewan, lingkungan,

karyawan serta pemilik hewan.

(18)

DAFTAR PUSTAKA

Adelowo O, Fagade O. 2009. The tetracycline resistance gene tet39 is present in both

Gram‐negative and Gram‐positive bacteria from a polluted river, Southwestern Nigeria. Lett Appl Microbiol: SFAM. 48:167–72.

Baguy OM, Nathalie GK, David CN, Daniel SN, Julien CK, Rose KN, Djeneba OG, Valerie G, Bertin TK, Mireille D. 2014. Firs Report of qnr Genes in Multidrugs Resistant (ESBL) Enterobacteria Isolated from Different Ecosystem in Abidjan, Ivory Coast. AASCIT.1(4):170–175.

Bourley C, Coeefic T, Caillon J, Thibaut S, Cazeau G, Jouy E, Jarrige N, Chauvin C, Madec JY, Haenni M, Leblond A, Gay E. 2020. Trends in Antimicrobial Resistance among Escherichia coli from Defined Infections in Humans and Animals. JAC.75(6):1525– 1529.

Bradley JS, Jackson MA. 2006. The use of systemic fluoroquinolones. J Pediatr. 118:1287–1292. Bryan A, Shapir N, Sadowsky MJ. 2004. Frequency and Distribution of Tetracycline Resistance Genes in Genetically Diverse, Nonselected, and Nonclinical Escherichia coli Strains Isolated from Diverse Human and Animal Sources. AEM. 70(4):2503–2507.

[CLSI] Clinical and Laboratory Standards Institute. 2018. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 28th Edition. Wayne (US): Clinical and Laboratory Standards Institute.

Colom KL, Perez J, Alonso R, Fernandez AA, Larino R, Cisterna R. 2003. Simple and Reliable Muliplex PCR Assay of Detection of blaTEM, bla (SHV) and blaOXA-1 Genes Enterobacteriacea. FEMS Mikrobiol Letters. 223(2):147–151.

Correia S, Poeta P, Hebraud M, Capelo JL, Igrejas G. 2017. Mechanisms of Quinolone Action and Resistance. JMM. 66:551–559.

Giguère S, Prescott JF, Dowling PM. 2013. Antimicrobial Therapy in Veterinary Medicine, 5th ed. Wiley Blackwell, Ames, Iowa (US).

Gyles CL, Prescott JF, Songer JG, Thoen CO. 2010. Pathogenesis of Bacterial Infection in Animals. Ames (US). Blackwell Pub.

Ijong FG, Dien HA. 2011. Karakteristik bakteri pereduksi merkuri (Escherichia Coli) diisolasi dari perairan pantai teluk manado. Perikanan dan Kelautan Tropis. Vol 7(3): 103-108. Ishii S, Sadowsky MJ. 2008. Escherichia coli in the Environment: Implication for quality and

human health. JSME. 23(2):101–108. doi.org/10.1264/jsme2.23.101.

Leboffe MJ, Burton EP. 2011. A Photographic Atlas for the Microbiology Laboratory. 4th Ed. United States of America (US): Morton Publishing.

Levy SB, Marshall B. 2004. Antibacterial Resistance Worldwide: Causes, Challenges and Esponses. Nat Med. 10(12):122–129.

Lyimo B, Buza J, Subbiah M, Smith W, Call DR. 2016. Comparison of antibiotic resistant Escherichia coli obtained from drinking water sources in northern Tanzania: a cross-sectional study. BMC Microbiol. 16(254):1–10.

Manoharan A, Premalatha K, Chatterjee S, Mathai D. 2011. Correlation of TEM, SHV, CTX-M Estended-spectrum Betalactamases Among Enterobacteriaceae with their in vitro Antimicrobial Susceptibility. IJMM. 29(2):161–164.

Markley JL, Wencewicz TA. 2018. Tetracycline-inactivating Enzymes. Front Microbiol. 9(1058):1–22. Mitchell R, Gu JD. 2010. Enviromental Microbiology 2th Ed. New Jersey (US): Wiley-Blackwell.

Nguyen F, Starosta AL, Arenz S, Sohmen D, Donhofer A, Wilson DN. 2014. Tetracycline Antibiotics and Resistance Mechanisms. Biol Chem. 395(5):559–575.

Nikaido H. 2009. Multidrug resistance in bacteria. Annu Rev Biochem. 78(22):119–146.

Nystrom T, Neidhardt FC. 1992. Cloning, Mapping and Nucleotide Sequencing of a Gene Encoding a Universal Stress Protein in Escherichia coli. Mol Microbiol. 6(21):3187–3198.

Pao SS, Paulsen IT, Saier MH. Major facilitator superfamily. 1998. Microbiol Mol Bio. 62(1):1–34.

Price LB, Graham JP, Lackey LG, Roess A, Vailes R, Silbergeld E.2007. Elevated risk of carrying gentamicin-resistance Escherichia coli among U.S. poulytry workers. EHP. 115(12):1738–1742. Randal LP, Cooles SW, Osborn MK, Piddock LJV, Woodward MJ. 2004. Antibotic Resistance Gene,

Integrons and Multiple Antibiotic Resistance in thirty-five Serotypes of Salmonella enteritica Isolated fromhumans and animals in the. (UK). Antimicrobial Chemoteraphy. 53:208–216.

Rezazzadeh M, Baghchesaraei H, Peymani A. 2016. Plasmid-Mediated Quinolone-Resistance (qnr) Genes in Clinical Isolated of Escherichia coli Collected from Several Hospitasl of Qazvin and Zanjan Provinces, Iran. J PHRP. 7(5):307–312.

Rini SH, Selma S, Max JH. 2017. Resistensi antimikroba dan Penerapan Kebijakan Pengendalian di Rumah Sakit di Indonesia. MPK. 1(2): 131–140.

Riviere JE, Papich MG. 2009. Veterinary pharmacology and therapeutics. 9th ed. New Jersey, Wiley Blackwell (US).

Robicsek A, Strahilevitz J, Sahm DF, Jacoby GA, Hooper DC. 2006. qnr Prevalence in Ceftazidime-Resistant Enterobacteriaceae Isolates from the United States. AAC. 50(8):2872–2874.

Ryan KJ, Ray CG. 2014. Antibacterial Agents and Resistance in Sherris Medical Microbiology. 6th Edition. Mc Graw Hill. New York (US).

Van TTH, Chin J, Chapman T, Tran LT, Coles PJ. 2008. Safety of Raw Meat and Shellfish in Vietnam: an Analysis of Escherichia coli Isolation for antibiotic Resistance and Virulance Genes. ICFMH. 124(3):217–223.

(19)