UJI TOKSISITAS FRAKSI DARI SPONGS LAUT Xestospongia DENGAN METODE BRINE SHRIMP TEST (BST)

(1)

UJI TOKSISITAS FRAKSI DARI SPONGS LAUT

Xestospongia

DENGAN METODE

BRINE SHRIMP

TEST

(BST)

Oleh:

FRANSISCHA GALUH KARTIKASARI 1506100002

Dosen Pembimbing:

Awik Puji Dyah Nurhayati S.Si, M.Si

Drs. Agus Wahyudi M.S

(2)

LATAR BELAKANG

keanekaragaman hayati laut Indonesia

melimpah

Spons Genus Xestospongia metabolit sekunder

Alkaloid, polycyclic Quinones dan hydroquinones, derivate

polyacetylenic, aminoalkohol, dan

sterol (aragusterol) (Laurent et

al,2006), oxaquinoleridinesl,

β-Carbdine, terpenoid, laktones (Kondracki et al,1992) mempertahankan

diri dari predator

memiliki aktivitas farmakologis

dapat dipisahkan melalui metode Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Fraksi-fraksi

Diuji ketoksikannya dengan metode Brine

Shrimp Test (BST) Menggunakan

Artemia salina

Uji pendahuluan antikanker

(3)

Menguji toksisitas dari fraksi yang didapat dari ekstrak

Xestospongia dengan metode Brine Shrimp Test (BST)

Batasan masalah dalam penelitian ini antara lain: 1. menguji secara kualitatif senyawa Xestospongia

2. menguji toksisitas dari fraksi dari hasil KLT pada Xestospongia

Tujuan dari penelitian ini antara lain:

1. untuk mengetahui jenis senyawa dari Xestospongia secara kualitatif

2. untuk mengetahui toksisitas dari fraksi Xestospongia dengan menggunakan metode Brine Shrimp Test (BST)

Permasalahan

Batasan masalah

(4)

Manfaat dari penelitian ini diharapkan dapat

digunakan

sebagai

pengembangan

alternatif

pengobatan

antikanker

dengan

menggunakan

produk dari spons laut.

(5)

METODOLOGI

Waktu Dan Tempat Penelitian

Penelitian dilaksanakan pada bulan April-Juli 2010. Uji

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) dan Kromatografi lapis

Tipis Preparatif (KLTP) dilakukan di labolatorium Kimia

Sintesis

Fakultas

Farmasi

UNAIR,

Uji

kualitatif

dilakukan

diLabolatorium

Farmakognosis

Fakultas

Farmasi UNAIR dan uji Brine Shrimp Test (BST)

dilakukan di Labolatorium Zoologi Biologi ITS.

(6)

Cara Kerja

1. Isolasi Senyawa Bioaktif

Ekstrak kasar Xestospongia dari labolatorium zoologi

biologi ITS yang telah kering diambil 1

gr

dilarutkan etanol ±2

ml

Larutan ekstrak dalam etanol, ditotolkan pada pelat KLT menggunakan pipa kapiler dengan

jarak ± 1 cm dari dasar

Setelah totolan kering,lempengan dimasukkan ke dalam bejana dan dielusi hingga jarak ± 1 cm dari

tepi atas dengan fase gerak yang sesuai

kemudian di deteksi dengan sinar UV 254 nm dan UV 365 nm

(7)

2. Uji Kualitatif

disemprot dengan anisaldehid, uap amoniak, besi (III) klorida, Lieberman-Buchard dan

Dragendorff.

Dihitung nilai Rf (Retardation Factor) dengan menggunakan rumus: Rf = Jarak yang ditempuh substansi

Jarak yang ditempuh oleh pelarut senyawa yang terpisahkan.

(8)

3. Isolasi Senyawa dengan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP)

Ekstrak Xestospongia sp. yang dilarutkan

dalam ethanol

dielusi dengan fase gerak yang didapat dari

Kromatografi lapis Tipis (KLT) hingga jarak ± 2 cm dari tepi

atas ditotolkan pada Plat KLTP

berupa garis lurus menggunakan pipa kapiler dengan jarak ± 2 cm dari dasar

Senyawa yang berupa fraksi dikerok dengan menggunakan spatula berdasarkan nilai Rf yang

didapat dari KLT

dilarutkan dalam etanol dan disaring dengen

kertas saring Hasil penyaringan

dikeringkan dalam aerator Hasil berupa fraksi

(9)

2. Uji Toksisitas

Fraksi yang didapat dari hasil Kromatografi Lapis Tipis

Preparatif (KLTP)

dibuat dalam konsentrasi 1000 ppm, 500 ppm, 250 ppm, 100 ppm, 10 ppm dan 0 ppm (kontrol) 1000 ppm 500 ppm 250 ppm 100 ppm 10 ppm kontrol 25 ml+75 ml 50 ml+50 ml 10 ml+90 ml 1 ml+99 ml ditimbang

(10)

Telur Artemia salina

ditetaskan dalam wadah yang berisi 500 ml air laut

dengan kepadatan 5 g/L

diaerasi selama 48 jam

Setelah menetas, diberi pakan berupa ragi dengan konsentrasi 3 mg dalam 5 ml air

laut sebanyak 1 tetes

Telur menetas dalam jangka waktu 24-36 jam

Larva umur 48 jam

(11)

3. Uji Brine Shrimp Test (BST) kontrol 1000 ppm 500 ppm 250 ppm 100 ppm 10 ppm diambil 1 ml diambil 1 ml diambil 1 ml diambil 1 ml diambil 1 ml diambil 1 ml

Pada fraksi hasil Kromatografi lapis Tipis (KLT)

5 ml air laut 5 ml air laut 5 ml air laut 5 ml air laut 5 ml air laut 5 ml air laut

(12)

masing-masing tabung reaksi

dimasukkan 10 ekor larva Artemia salina umur 48 jam

diamati jumlah Artemia salina yang mati dengan kaca pembesar selama 24 jam

dilakukan 3 kali ulangan

(13)

Rumus yang digunakan:

Jumlah Larva yang mati

%Kematian = x 100%

Jumlah hewan yang diuji

(Meyer et al.,1982)

Rumus yang digunakan:

Jumlah larva yang mati – jumlah larva yang mati pada kontrol

%kematian = x 100%

Jumlah Hewan uji

(Meyer et al.,1982)

ditentukan besarnya LC₅₀ yang dihitung dengan analisis probit menggunakan

MINITAB

hasil

Bila pada kontrol ada larva yang mati

Bila pada kontrol tidak ada larva yang mati

(14)

Rancangan Penelitian dan Analisis Data

Penelitian menggunakan rancangan eksploratif dengan memberi perlakuan konsentrasi ekstrak spons sebesar 1000 ppm, 500 ppm, 250 ppm, 100 ppm,10 ppm dan 0 ppm sebagai kontrol. Masing-masing perlakuan diulang sebanyak 3 kali.

Data Hasil

Tabel Analisa Kualitatif Jenis Senyawa

Jenis Senyawa Warna

terpenoid Merah atau ungu

steroid biru

fenolik biru ungu

flavonoid warna jingga sampai merah

(15)

Persentase kematian A. salina kemudian dilakukan analisis probit untuk mengetahui nilai LC₅₀. Analisis probit menggunakan program MINITAB. Suatu ekstrak dianggap memiliki aktivitas toksik dan berpotensi untuk diteliti lebih lanjut jika harga LC₅₀ < 1000 ppm (Meyer

et al.,1982).

(16)

Hasil KLT diperoleh spot fraksi sebanyak 4, dengan pelarut kloroform dan aseton (5:1) (v/v)

Kloroform memiliki tingkat kepolaran yang lebih rendah dari pada aseton sehingga gabungan keduanya menghasilkan kepolaran yang berbeda  Kepolaran yang dihasilkan dari gabungan kedua pelarut rendah sehingga senyawa yang dapat larut pada pelarut tersebut juga memiliki tingkat kepolaran yang rendah

Plat KLT yang telah dielusi dengan pelarut kloroform dan aceton (5:1) (v/v) berpendar ketika diamati dengan UV pada panjang gelombang 254 nm  memiliki energi relatif lebih kuat daripada 365 nm

(17)

Spot noda (fraksi) berpendar pada panjang gelombang 254 nm

Spot noda (fraksi) tidak berpendar pada panjang gelombang 365 nm

Fraksi 4 Fraksi 3

Fraksi 2 Fraksi 1

Hasil pada Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

(18)

Jenis senyawa pada spot fraksi yang telah diperoleh adalah senyawa terpenoid yang ditandai dengan adanya warna ungu setelah dilakukan penyemprotan dengan reagen anisaldehid (Tabel 4.1).

Tabel 4.1. Hasil kualitatif jenis senyawa

Jenis Senyawa Warna Hasil Uji

terpenoid Merah atau ungu +

steroid biru

-fenolik biru ungu

-flavonoid warna jingga sampai merah

(19)

-Hasil pada Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Hasil penyemprotan dengan Liberman Buchart Hasil penyemprotan dengan Dragendroff Hasil penyemprotan dengan anisaldehid Hasil penyemprotan dengan besi (III) klorida

Hasil

penyemprotan dengan uap amonia

(20)

Dari harga Rf yang di dapat dari KLT yaitu ½

Nilai Rf yang didapat dari KLT sama dengan Nilai Rf pada

Kromatografi lapis Tipis preparatif (KLTP) yang digunakan

untuk mengambil senyawa pada KLTP

Rf menunjukkan perjalanan senyawa yang dipisahkan

relative terhadap perjalanan pelarut

(21)

Hasil uji toksisitas fraksi spons laut Xestospongia menujukkan % kematian terhadap larva Artemia salina yang ditunjukkan dalam Tabel 4.2

Tabel 4.2. Hasil Uji Brine Shrimp Test (BST) untuk fraksi yang didapat dari Kromatografi Lapis Tipis (KLT)

Konsentrasi Pengulangan

Jumlah larva Artemia yang diuji

Jumlah Larva

Artemia yang Mati jumlah rata-rata

% kematian 0 0 0 1 2 3 10 10 10 0 1 2 3 1.00 10 10 10 10 1 2 3 10 10 10 2 5 3 10 3.33 23.3 100 100 100 1 2 3 10 10 10 3 4 4 11 3.67 26.7 250 250 250 1 2 3 10 10 10 5 4 4 13 4.33 33.3 500 500 500 1 2 3 10 10 10 6 4 4 14 4.67 36.67 1000 1000 1000 1 2 3 10 10 10 5 6 6 17 5.67 46.67

Hasil uji Toksisitas Fraksi Xestospongia sp. dengan Metode

(22)

Grafik 4.1 Probability plot untuk jumlah larva Artemia yang mati Konsentrasi P e rc e n t 7500 5000 2500 0 -2500 -5000 99 95 90 80 70 60 50 40 30 20 10 5 1 Table of Statistics Mean 692.329 StDev 1027.53 Median 692.329 IQ R 1386.11

Probability Plot for Jumlah Larva Artemia yang Mati

Probit Data - ML Estimates Normal - 95% CI

(23)

Larva Artemia yang mati pada kontrol larva pada kondisi yang lemah tidak dapat beradaptasi saat dipindahkan dari media air laut dari tempat penetasan ke dalam media air laut di botol ampul.

Larva Artemia yang mati pada kontrol mengalami penurunan aktivitas.

Semakin lama, Artemia dalam kontrol semakin lemah dan terus berada di dasar tabung.

Larva Artemia dengan perlakuan fraksi (ppm) mengalami disorientasi

gerak (gerakannya tidak teratur)

Semakin tinggi nilai konsentrasi fraksi ekstrak mortalitas Artemia juga

semakin tinggi (Tabel 4.1)

Harbourne (1994) semakin tinggi konsentrasi ekstrak, maka sifat toksiknya akan semakin tinggi.

(24)

Dari hasil perhitungan Analisa Probit dengan menggunakan MINITAB, didapat nilai LC₅₀ pada ekstrak fraksi Xestospongia ini adalah 692.329 ppm.

Meyer (1982) suatu ekstrak bersifat toksik bila nilai LC₅₀ ≤1000 ppm sehingga ekstrak dari fraksi Xestospongia dapat dikatakan toksik.

Terpenoid bersifat toksik pada sebagian besar komponen terpenoid memiliki struktur lipofilik menyebabkan kerusakan membran sel sehingga menyebabkan kematian sel.

(25)

Sifat nonpolar terpenoid mudah menembus membran sel atau membran organel dalam sel pada sisi hidrofobik membentuk struktur misel terbentuknya ikatan antara senyawa nonpolar (terpenoid) dengan bagian nonpolar dari membran sel

menyebabkan permeabilitas membran sel terganggu.

Terpenoid memiliki efek sinergis bagi toksin lain dengan bertindak sebagai solven untuk memfasilitasi toksin bergerak melalui membran (Dudareva dan Gershenzon, 2007 dalam Imaria,2008).

(26)

 Terpenoid merusak DNA merusak ikatan dalam DNA menjadi DNA Single-strand dan dapat menghambat proses mitosis sel (Sladić dan Gašić, 2006)

 Senyawa bioaktif sebagai zat toksik dapat masuk melalui membran sel larva Artemia (secara difusi), membran sel : untuk mengatur perpindahan zat ke dalam dan keluar sel pada organela sel

 Senyawa toksik masuk menyebabkan terjadinya perusakan atau modifikasi permeabilitas membrane dan mengacaukan system perpindahan zat dengan cara turut campur dalam pembawa dan produksi ATP mengganggu proses biokimiawi dan fisiologi (Connell dan Miller,1995)

(27)

Masuknya zat toksik melalui saluran pencernaan Artemia bersifat

penyaring tidak selektif (non selective filter feeder) sehingga apa saja yang dapat masuk mulut artemia seakan-akan menjadi makanannya

(Isnansetyo dan Kurniastuty,1995 dalam Widyastuti,2005)

Senyawa yang masuk dapat berinteraksi dengan target (misalnya enzim,lemak, membran sel, asam nukleat) mempengaruhi

mekanisme tubuh yang akhirnya dapat menyebabkan kematian (Connell dan Miller,1995)

(28)

Masuknya senyawa toksik melalui pernafasan saat pertukaran gas melewati permukaan permeable pada bagian tengah tempat keluarnya di thoraciz appendages

Metabolisme sekunder yang bersifat polar relatif lebih toksik daripada yang bersifat non polar (Nurhayati et al.,2006)

Senyawa metabolit sekunder yang bersifat polar alkaloid dan flavonoid

Senyawa yang bersifat non polar terpenoid dan steroid (Sastroamidjojo dalam Nurhayati et al.,2006)

UJI TOKSISITAS FRAKSI DARI SPONGS LAUT Xestospongia DENGAN METODE BRINE SHRIMP TEST (BST)