FERTILISASI DAN PERKEMBANGAN OOSIT SAPI HASIL IVF DENGAN SPERMA HASIL PEMISAHAN
(Fertilization and Development of Oocytes Fertilized in Vitro with Sperm after Sexing)
EKAYANTI M.KAIIN,M.GUNAWAN,SYAHRUDDIN SAID danBAHARUDDIN TAPPA Pusat Penelitian Bioteknologi-LIPI, Jl. Raya Bogor km. 46, Cibinong 16911
ABSTRACT
The aim of this study is to know the in vitro fertilization of sperm after sexing. PO bull sperm was separated with Bovine Serum Albumin (BSA) column 5 to 10% into X or Y sperm. Oocytes of BX cows was maturated in TCM-199 + 10% calf serum (CS) for 22-24 hours in CO2 incubator 5% temperature 38oC. In vitro fertilization have been done in BO + BSA medium for 6-7 hours. Than zygote was cultured in CR1aa medium until embryos reached morulae or blastocyst stage. The sperm after sexing quality were 45% motility for X sperm and 40% for Y sperm. Oocytes that reached 2-cell embryos stage was 27,3% fertilized with X sperm and 27,6% with Y sperm. X embryos have developed to morulae or blastocyst was 42,2% and Y embryos were 51,2%. It is concluded that sperm after sexing have a capability to fertilize the oocytes and zygotes become two cell embryos and developed to morulae or blastocysts.
Key words: in vitro fertilization, sperm sexing, oocytes, embryo
ABSTRAK
Telah dilakukan penelitian untuk menguji kemampuan fertilisasi sperma hasil pemisahan secara in vitro.
Sperma sapi PO pembawa sifat betina (X) dan jantan (Y) dipisahkan dengan menggunakan kolom BSA 5- 10%. Oosit sapi BX dimaturasi dalam media TCM-199 + 10% CS selama 22-24 jam di dalam inkubator CO2 5%, temperatur 38oC. Fertilisasi in vitro dilakukan dalam media BO+ BSA selama 6-7 jam. Kultur zigot dilakukan dalam media CR1aa sampai embrio mencapai tahap perkembangan morula/blastosis. Hasil pengujian terhadap kualitas sperma hasil pemisahan menunjukkan bahwa motilitas sperma X (45%) dan sperma Y (40%) masih dalam kisaran yang layak untuk digunakan pada proses inseminasi buatan (IB). Oosit yang berkembang mencapai tahap 2 sel sebanyak 27,3% yang difertilisasi oleh sperma X dan sebanyak 27,6%
difertilisasi oleh sperma Y. Embrio X yang berkembang mencapai tahap morula/ blastosis sebanyak 45,2%, sedangkan embrio Y sebanyak 51,2%. Berdasarkan hasil tersebut dapat disimpulkan bahwa sperma hasil pemisahan mampu memfertilisasi oosit dan kemudian zigot dapat tumbuh mencapai tahapan embrio praimplatasi yang lebih lanjut.
Kata kunci: Fertilisasi in vitro, sperma hasil pemisahan, oosit, embrio
PENDAHULUAN
Peningkatan populasi ternak di Indonesia perlu didukung oleh berbagai faktor, salah satu di antaranya adalah reproduksi ternak.
Berbagai teknologi reproduksi dan teknologi pakan perlu diterapkan untuk meningkatkan keberhasilan angka kebuntingan dan kelahiran anak sapi.
Pemisahan spermatozoa merupakan salah satu upaya efisiensi dalam mengubah rasio spermatozoa X dan Y. Salah satu yang
dianggap baik yang dilakukan untuk memisahkan sperma sapi adalah metode pemisahan dengan menggunakan kolom albumin (Bovine Serum Albumin, BSA) yang menghasilkan 75−80% sperma Y. Penggunaan metode pemisahan dengan kolom albumin ini menghasilkan pemisahan terbaik untuk sperma sapi dan manusia (KRZYZANIAK dan HAFEZ, 1993).
Percepatan populasi melalui IB dapat didukung oleh teknologi pemisahan sperma X dan sperma Y sehingga dapat diperoleh jenis
kelamin anak sesuai harapan. Untuk memenuhi kebutuhan akan daging, maka diperlukan banyak anak sapi jantan untuk penggemukan sehingga IB dengan menggunakan straw sperma Y diharapkan dapat mempercepat pemenuhan kebutuhan bibit jantan dibandingkan jika IB dengan menggunakan straw semen biasa. Demikian juga untuk memperoleh ternak betina pada sapi perah kita dapat menggunakan straw X pada IB, sehingga dapat diperoleh lebih banyak ternak sapi perah betina yang dapat memproduksi susu.
Rendahnya motilitas sperma X atau Y hasil pembekuan menjadi kendala untuk digunakan dalam IB (TAPPA et al., 2000).
Penggunaan sperma hasil pemisahan pada fertilisasi in vitro dapat membuktikan bahwa embrio yang berkembang merupakan embrio jantan jika difertilisasi dengan sperma Y atau embrio betina jika dibuahi dengan sperma X.
Hal tersebut dapat dibuktikan dengan melakukan karyotiping embrio paruh, yang memerlukan waktu relatif singkat untuk mengetahui hasil yang diinginkan dibandingkan jika difertilisasi secara in vivo yang membutuhkan waktu yang lebih lama untuk mengetahui hasilnya menjadi anak sapi jantan atau betina.
Pada penelitian ini, fertilisasi in vitro dilakukan untuk menguji kemampuan fertilisasi sperma beku hasil pemisahan dengan kolom BSA 5−10%.
MATERI DAN METODE Koleksi ovarium dan pengumpulan oosit
Ovarium sapi BX dikoleksi dari sapi yang dipotong di RPH dan dipisahkan bagian-bagian lain seperti lemak, oviduk dan jaringan lain.
Ovarium dibawa ke laboratorium menggunakan termos berisi larutan NaCl fisiologis yang ditambah dengan antibiotik dengan temperatur 25−30°C.
Di laboratorium, ovarium kemudian dicuci kembali dengan NaCl fisiologis hangat dan dikeringkan dengan kertas tisu steril. Media aspirasi (DPBS + 3% Calf Serum, CS) dihangatkan terlebih dahulu di dalam water bath 37°C. Oosit diaspirasi dengan menggunakan syringe 10ml dengan jarum ukuran 18 G yang berisi sedikit media aspirasi.
Folikel ovarium yang berukuran 1-5 mm diaspirasi dan cairan yang tertampung di dalam syringe dimasukkan ke dalam cawan petri steril. Pencarian oosit dilakukan di bawah mikroskop stereo.
Maturasi oosit, fertilisasi dan kultur in vitro Oosit yang terkoleksi dan mempunyai kualitas sangat baik dan baik (A dan B) kemudian dicuci dalam media maturasi TCM 199 + 10% CS + penambahan hormon E2, hCG dan FSH. Oosit tersebut dimasukkan ke dalam spot media maturasi yang sebelumnya telah diekuilibrasi di dalam inkubator CO2 5%, temperatur 38°C dan dikultur selama 22−24 jam.
Sebelum dilakukan fertilisasi, sperma beku X atau Y sapi PO yang telah dipisahkan dengan menggunakan kolom BSA 5-10%
dithawing dan masing-masing diperiksa motilitasnya. Motilitas sperma di atas atau sama dengan 40% digunakan untuk memfertilisasi oosit secara in vitro. Sperma X atau Y yang telah dithawing kemudian dimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi, ditambah media Semen Washing Solution, SWS dan disentrifugasi dengan kecepatan 1800 rpm selama 5 menit pada temperatur 27°C. Supernatan dibuang, kemudian endapan sperma (0,5 ml) ditambah dengan media Semen Dilution Solution, SDS sampai konsentrasi 1 x 106/ml. Di dalam cawan petri dibuat spot berisi 100 µl SDS berisi sperma X atau Y, kemudian ditutupi dengan mineral oil dan dinkubasi selama 1 jam.
Setelah itu dilakukan pencucian oosit yang telah dimaturasi dengan menggunakan media Oocyte Washing Solution, OWS. Oosit yang telah dicuci kemudian ditempatkan ke dalam spot SDS + sperma (10 oosit/spot) dan dikultur selama 6−7 jam di dalam inkubator CO2.
Setelah itu, oosit yang difertilisasi kemudian dicuci dengan media kultur CR1aa + 5% CS sambil dihilangkan sel-sel kumulusnya dengan menggunakan pipet. Zigot kemudian dimasukkan ke dalam spot media kultur dan dimasukkan ke dalam inkubator CO2 5%, temperatur 38°C. Pengamatan perkembangan embrio dari tahap 2 sel sampai morula/blastosis dilakukan setiap hari.
HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil pengamatan terhadap kualitas sperma beku yang telah dipisahkan (X atau Y) ditampilkan pada Tabel 1.
Sperma beku yang digunakan dalam penelitian ini mempunyai kualitas yang memenuhi standar Post Thawing Motility (PTM) yaitu lebih besar atau sama dengan 40%
(ANONIMOUS, 2000). Motilitas atau daya gerak merupakan ukuran kemampuan sperma untuk memfertilisasi oosit yang berada jauh di dalam saluran reproduksi betina (SALISBURY dan VAN DEMARK, 1985).
Tabel 1. Kualitas sperma hasil thawing yang digunakan pada fertilisasi in vitro
Sperma Motilitas Persentase
sel hidup Abnormalitas Tanpa
pemisahan (kontrol)
50% 51,3 % 7,4 %
X 45% 36,3% 8,7 %
Y 40% 30,5% 8,1%
Nilai persentase sel hidup sperma yang digunakan pada penelitian ini masih dalam kisaran normal, walaupun persentase sel hidup sperma X dan Y cenderung lebih rendah.
Kemungkinan disebabkan adanya perlakuan terhadap sperma selama pemisahan. Selama proses pembekuan 20−80% sperma akan mati, jika persentase sel hidup sangat rendah maka peluang sperma memfertilisasi oosit menjadi lebih kecil (TOELIHERE, 1993).
Persentase abnomalitas sperma menunjukkan kualitas sperma yang baik dengan nilai abnormalitas lebih rendah dari 20%. Hal tersebut berkaitan dengan fertilitas karena jika abnormalitas di atas 20% maka dapat dikatakan infertil (HAFEZ dan HAFEZ, 2000).
Berdasarkan data pada Tabel 2, terlihat terjadinya penurunan yang nyata (P<0,05) pada jumlah oosit yang dapat membelah menjadi embrio tahap 2 sel pada oosit yang difertilisasi dengan sperma X (27,3%) maupun sperma Y (27,6%) dibandingkan dengan kelompok kontrol (47,2%). Hal tersebut diduga berkaitan dengan kualitas sperma yang digunakan yaitu sperma hasil pemisahan memiliki motilitas yang cenderung lebih rendah dibandingkan
dengan sperma tanpa pemisahan (Tabel 1).
Walaupun demikian, sperma hasil pemisahan masih mampu memfertillisasi oosit dan berkembang mencapai embrio tahap 2 sel.
Pada perkembangan embrio lebih lanjut mencapai tahap morula/blastosis, tidak ada perbedaan yang nyata antara oosit yang difertilisasi dengan sperma yang telah dipisahkan (X= 45,2%; Y=51,2%) atau tanpa pemisahan (51,7%). Hal ini disebabkan jenis sperma sudah tidak berpengaruh lagi terhadap perkembangan embrio, tetapi proses kultur embrio (perlakuan media, dll.).
Penelitian sebelumnya dengan menggunakan sperma sapi PO tanpa pemisahan yang diproduksi di laboratorium Reproduksi dan Genetika Ternak menghasilkan embrio tahap 2 sel sebanyak 24% dengan perlakuan konsentrasi sperma 7x 106 sel/100 µl (CAHYONO, 2002). Hasil penelitian ini menghasilkan persentase zigot yang membelah menjadi 2 sel lebih baik walaupun menggunakan sperma X atau Y beku hasil pemisahan yang kualitasnya lebih rendah dari sperma beku tanpa pemisahan.
Uji coba penggunaan sperma sapi PO beku hasil pemisahan pada proses IB ternak sapi juga telah dilakukan dan menghasilkan induk sapi yang bunting dan melahirkan anak dengan jenis kelamin sesuai dengan jenis sperma yang di-IB-kan (KAIIN et al., 2003). Hal ini memperkuat bahwa sperma beku yang telah dipisahkan dengan kolom BSA 5-10% yang dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Reproduksi dan Genetika Ternak, Puslit Bioteknologi−LIPI, selain mampu memfertilisasi secara in vitro juga mampu memfertilisasi secara in vivo. SEIDEL et al.
(1999) menginseminasi sperma X beku dan cair yang dipisahkan dengan flowsitometer terhadap induk resipien sapi Angus menghasilkan 100% lahir anak sapi betina pada perlakuan IB dengan semen cair dan 94%
betina pada perlakuan IB dengan sperma beku.
Pemisahan sperma X dan Y yang digunakan pada penelitian ini menggunakan metoda kolom BSA 5−10%. Berdasarkan hasil pewarnaan terhadap apusan sel sperma yang telah dipisahkan, pemisahan dengan kolom BSA tersebut telah memisahkan sperma X sebesar 71,2% dan sperma Y sebesar 76,6%
(KAIIN et al., 2003).
Tabel 2. Perkembangan embrio hasil fertilisasi in vitro dengan menggunakan sperma X atau Y hasil pemisahan
Sperma Jumlah oosit
IVF Jumlah embrio tahap 2 sel
(%) Jumlah embrio tahap morula dan blastosis (%)
Tanpa pemisahan (kontrol) 123 58 (47,2)a 30 (51,7)a
X 154 42 (27,3)b 19 (45,2)a
Y 156 43 (27,6)b 22 (51,2)a
Huruf yang berbeda menyatakan perbedaan yang nyata (P<0,05) Data diuji dengan analisis statistik ANOVA
Embrio tahap morula/blastosis yang diperoleh kemudian dibekukan dan disimpan dalam tangki nitrogen cair untuk perlakuan lebih lanjut (karyotiping atau transfer embrio).
KESIMPULAN DAN SARAN
Berdasarkan penelitian ini, dapat disimpulkan bahwa sperma beku sapi PO hasil pemisahan dengan kolom BSA 5−10% (sperma X dan sperma Y) mempunyai kemampuan fertilisasi yang cukup baik untuk menghasilkan embrio secara in vitro.
Disarankan penelitian lebih lanjut untuk melakukan karyotiping embrio guna membuktikan bahwa embrio yang difertilisasi oleh sperma X menghasilkan embrio betina dan embrio yang difertilisasi oleh sperma Y menghasilkan embrio jantan. Selain itu, perlu dilakukan uji lapangan dengan melakukan IB pada sapi untuk melihat kualitas produksi straw sperma beku hasil pemisahan dan jenis kelamin anak yang dihasilkan.
DAFTAR PUSTAKA
ANONIMOUS. 2000. Petunjuk teknis pengawasan mutu bibit ternak. Direktorat Pembibitan.
Direktorat Jenderal Peternakan. Departemen Pertanian. Jakarta.
CAHYONO,S.E. 2002. Pengaruh Konsentrasi Sperma Pascakapasitasi Terhadap Tingkat Fertilisasi pada Fertilisasi in vitro. Skripsi Sarjana.
Fakultas Peternakan UNPAD, Bandung.
SEIDEL,JR.G.E.,D.G.CRAN,L.A.HERIKHOFF,S.P.
DOYLE and R.D.GREEN. 1999. Insemination of heifers with sexed frozen or sexed liquid semen. http://www.cvmbs.colostate.edu/
physio/abstract/ges9.html
HAFEZ,E.S.E.dan B.HAFEZ. 2000. Reproduction in Farm Animal. 7th ed. Lippincott Williams and Wilkins. Philadelphia. pp. 93, 165-186.
KAIIN, E.M., B. TAPPA, S. SAID, F. AFIATI, M.
GUNAWAN dan N.D.YANTHI. 2003. Aplikasi bioteknologi untuk produksi bibit yang sudah diketahui jenis kelaminnya. Laporan Teknik Proyek Penelitian Bioteknologi. Puslit Bioteknologi-LIPI. pp. 96-116.
KRZYZANIAK,L.T. dan E.S.E.HAFEZ. 1993. X- and –Y chromosome bearing spermatozoa. In:
Reproduction in farm animals. 6th. E.S.E.
HAFEZ. (Ed.). Lea and Febiger. Philadelphia.
SALISBURY, G.W. dan N.L. VAN DEMARK. 1985.
Fisiologi Reproduksi dan Inseminasi Buatan pada Sapi. Terjemahan: J.DJANUAR. Gajah Mada University Press.
TAPPA,B.,I.P.DUGO,R.RAZALI,N.SOLIHATI dan F.
AFIATI. 2000. Pemisahan dan pembekuan spermatozoa pembawa kromosom X dan Y pada sapi. Prosiding Ekspose Hasil Penelitian Bioteknologi Pertanian. Deptan. Jakarta. hlm.
455−461.
TOELIHERE, M.R. 1993. Inseminasi Buatan Pada Ternak. Angkasa. Bandung.
DISKUSI Pertanyaan:
1. Dianjurkan agar embrio hasil IVF diuji, sehingga hasil sexing bisa diketahui.
2. Umumnya nilai % sperma hidup lebih tinggi dibanding % motilitas, tetapi hasil yang diperoleh setelah pemisahan justru sebaliknya, mengapa?
3. Pewarnaan apa yang digunakan untuk penentuan % hidup spermatozoa?
Jawaban:
1. Untuk kesempurnaan penulisan akan diusahakan untuk diamati kembali, karena sampel masih ada.
2. Kemungkinan hal ini disebabkan oleh pengaruh pemisahan.
3. Pewarnaan menggunakan eosin-negrosin.
