PERCOBAAN VIII
BRINE SHRIMPS LETHALITY TEST (BSLT)
1. TUJUAN :
Terampil dalam melakukan uji toksisitas akut dengan metode BSLT (Brine Shrimp Letality Test).
Mengetahui cara perhitungan LC50 dengan metode BSLT (Brine Shrimp Letality Test).
Mampu melaksananakan pengujian toksisitas secara in vitro dengan metode BSLT (Brine Shrimp Letality Test).
Mampu menetapkan LC50 sebagai parameter ketoksikan akut berdasarkan analisa probit.
2. LANDASAN TEORI
Toksisitas dari suatu senyawa secara umum dapat diartikan kepada potensi dari suatu senyawa kimia untuk dapat menyebabkan kerusakan ketika senyawa tersebut mengenai atau masuk kedalam tubuh manusia. Suatu senyawa kimia dikatakan bersifat racun akut jika senyawa tersebut dapat menimbulkan efek racun dalam jangka waktu yang singkat, dan bersifat kronis jika senyawa tersebut dapat menimbulkan efek racun dalam jangka waktu yang panjang (karena kontak yang berulang-ulang walaupun dalam jumlah yang sedikit).
Uji ini mengamati mortalitas larva udang yang di sebabkan oleh senyawa uji. Senyawa yang aktif akan menghasilkan mortalitas yang tinggi.Uji toksisitas dengan metode BSLT ini memiliki spectrum aktifitas farmakologi yang luas, prosedurnya sederhana, cepat dan tidak membutuhkan biaya yang besar, serta hasilnya dapat di percaya. Disamping itu metode ini sering dikaitkan dengan metode penapiasan senyawa antikanker.Dengan alasan-alasan tersebut,maka uji ini sangat tepat digunakan. Peranan antioksidan sangat penting dalam meredam efek radikal bebas yang berkaitan erat dengan terjadinya penyakit degeneratif seperti tekanan darah tinggi, jantung koroner, diabetes dan kanker yang didasari oleh proses biokimiawi dalam tubuh. Radikal bebas yang dihasilkan secara terus menerus selama proses metabolisme normal,dianggap sebagai penyebab terjadinya kerusakan fungsi sel-sel tubuh yang akhirnya menjadi pemicu timbulnya penyakit degeneratif.
Uji Toksisitas dengan Metode BSLT digunakan untuk mempelajari toksisitas sampel secara umum dengan menggunakan telur udang (Artemia salina Leach). Penetasan Larva Udang, disiapkan bejana untuk penetasan telur udang. Di satu ruang dalam bejana tersebut diletakkan lampu untuk menghangatkan suhu dalam penetasan, sedangkan di ruang sebelahnya diberi air laut. Kedalam air laut dimasukkan + 50-100 mg telur udang untuk ditetaskan. Pada bagian telur ditutup dengan aluminium foil, dan lampu dinyalakan selama 48 jam untuk menetaskan telur. Diambil larva udang yang akan diuji dengan pipet.
Brine Shrimp Lethality Test (BST) adalah salah satu metode skrining untuk menentukan sifat toksik suatu senyawa atau ekstrak secara akut dengan menggunakan hewan coba
Artemia salina.
Klasifikasi Artemia salina adalah sebagai berikut: Filum : Arthropoda
Kelas : Crustacea
Bangsa : Anostraca
Suku : Artemidae
Marga : Artemia
Jenis : Artemia salina
ekstrak atau senyawa. Metode ini merupakan metode uji hayati yang sederhana, cepat, murah, dan dapat dipercaya. Daya toksisitas suatu senyawa dapat diketahui dengan menghitung jumlah kematian larva Artemia salina dengan parameter Lethal Concentration 50 (LC50). Suatu ekstrak dinyatakan bersifat toksik menurut metode BST ini jika memiliki LC50 kurang dari 1000 Pg/ml. Cara yang dilakukan yaitu dengan menghitung semua hewan yang hidup dan hewan yang mati. Kemudian menghitung Rasio kematian dengan membagi jumlah hewan yang mati dengan hewan yang hidup. Yang terakhir adalah menentukan persen kematian dengan cara rasio kematian dikali 100.
Penggunaan Artemia salina Leach dalam uji sitotoksis dengan metoda BSLT ini mempunyai beberapa keuntungan,antara lain telur mudah didapat,murah,mudah disimpan dalam selang beberapa tahun ditempat yang kering dan tidak memerlukan kondisi aseptis yang khusus,serta memeliki sensitifitas yang lebih tinggi terhadap senyawa toksik bila dibanding orgisme laut lainnya.
Variabel yang penting diperhatikan untuk membiakkan Artemia salina Leach ini adalah temperatur,salinitas,pH,cahaya dan oksigen. Temperatur optimal untuk penetasan kista ini adalah 25-30ºC,kadar salinitas 30-35 ppt,dan pH yang diperlukan adalah 8-9,jika pH dibawah 5 atau diatas 10 udang tersebut akan mati. Cahaya yang minimal sangat dibutuhkan dalam proses penetasan dan akan menguntungkan bagi pertumbuhannya. Selain itu suplay oksigen harus tetap dijaga agar naupli dapat hidup dan berkembang.
Dalam pengujian sitotoksis dengan metode BSLT ini digunakan larutan sampel dengan tiga variasi konsentrasi bisa digunakan konsentrasi 1000 µg/ml,100µg/ml dan 10µ/ml. Jika belum mencapai LC50 pada konsentrasi tersebut dapat diturunkan konsentrasinya. Vial dapat digunakan sebagai wadah unruk yang sudah dibuat dalam berbagai konsentrasi tersebut. Vial yang digunakan sebanyak 3 dan masing-masin berisi 10 larva
3. ALAT dan BAHAN ALAT :
Vial Pipet tetes Pipet mikro Hairdrayer Gelas ukur
Wadah tempat larva Artemia
BAHAN :
Larva Artemia
DMSO
Ekstrak Metanol
2) Pipet ekstrak sebanyak 0,5ml kemudian masukkan kedalam vial yang telah disediakan setelah itu vial yang telah diisi ekstrak dikeringkan dengan hairdryer dan masukkan 50ml DMSO dan masukkan 10 ekor larva Artemia kemudiaan ad kan sampai 50ml aquadest.
Kurva nilai probit
0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
0 1 2 3 4 5 6
f(x) = - 0.64x + 5.65 R² = 0.57
Linear () Linear ()
larutansampel
pr
ob
6. PEMBAHASAN
Pada praktikum kali ini, bertujuan untuk melakukan uji toksisitas akut dengan BSLT (Brine Shrimp Letality Test) menggunakan metanol dan DMSO. Dimana, dari uji tersebut kita dapat menetapkan LC50 yang merupakan parameter ketoksikan akut berdasarkan analisa probit. Suatu konsentrasi mematikan (Lethal Consentration) adalah analisa secara statistik yang menggunakan uji Whole Effluent Toxicity (WET) untuk menaksir letalitas sampel effluen. Test akut digunakan di Wisconsin untuk menaksir kondisi “akhir dari pipa” (yaitu, effluen yang tidak dilemahkan, sebagai adanya dibebaskan pada lingkungan) (Casseret dan Doull’s, 1975). Konsentrasi effluen dimana 50% dari organisme mati selama tes (LC50) digunakan sebagai pemenuhan titik terakhir (endpoint) untuk Test Whole Effluent Toxicity (WET) akut. Dalam rangka mangalkulasi LC50, salah satu dari konsentrasi tes harus menyebabkan lebih dari 50% kematian. LC50 yang lebih rendah berarti semakin beracun effluen tersebut. Sebagai contoh, LC50 besar 100% berarti kekuatan penuh effluen tersebut tidak membunuh lebih dari separuh organisme. LC50 sama dengan 50% berarti separuh effluen mempunyai kekuatan membunuh 50% dari organisme tersebut.
yang mati. Dari hasil yang didapatkan pada vial 1 jumlah larva yang mati 1 pada vial 2 jumlah larva yang mati 1dan pada vial 3 jumlah larva yang mati 2.
Dari hasil pengamatan, didapatkan data yang kemudian dapat diolah untuk mendapatkan nilai LC50 (Lethal Concentration 50%) dengan menggunakan metode analisis probit. Hasil pengolahan data dapat dilihat pada bagian hasil. Setelah dilakukan pengolahan data, didapatkanlah hasil LC50 pada larva udang yaitu konsentrasi 1000µm sebesar 63,16%. Berdasarkan teori suatu ekstrak dikatakan toksik berdasarkan metode BSLT jika harga LC50 ≤ 1000 μg/ ml, sedangkan untuk senyawa murni jika LC50 ≤ 30μg/ml (Mayer et al., 1982), maka dapat dinyatakan bahwa ekstrak toksik pada konsentrasi 1000µg sebesar 63,16%.
Faktor yang mempengaruhi hasil yang didapatkan pada praktikum ini dapat disebabkan oleh beberapa hal, seperti konsentrasi/kadar garam dalam larutan air yang digunakan sebagai pengganti air laut tempat hidup larva tidak sesuai hingga menyebabkan banyak larva yang dijadikan blanko mati. Selain itu faktor dari larva itu sendiri yang mungkin masih terlalu lemah atau karena kesalahan dari praktikan yang mengambil larva tersebut tidak hati-hati juga dapat menyebabkan larva pada blanko tidak dapat betahan hidup hingga pada saat pengamatan.
7. KESIMPULAN
Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) adalah salah satu metode uji toksisitas yang banyak digunakan dalam penelusuran senyawa bioaktif yang bersifat toksik dari bahan alam. Dimana pengujian BSLT dilakukan dalam waktu yang relative singkat yakni 24 jam.
DAFTAR PUSTAKA
Mayer BNNR, Ferrigni ML. Brine Shrimp, a convinient general bioassay for active plant constituents. J of Plant Medical Research. 1982;45:31-34.
Carballo JL, Hernandez ZL, Perez P, Garcia MD. Comparison between two brine shrimp assays to detect in vitro cytotoxicity in marine natural products. BMC Biotechnology. 2002;2:1472-6570.
Casarett, L.J. and J. Doull. 1975. Toxycologi. The Basic Science of Poisons. New York. Mac Milla. Publ. Co.Inc.:329-330.
Meyer BN, Ferrigni NR, Putnam JE, Jacobsen LB, Nichols DE, McLaughlin JL. Brine shrimp: A convenient general bioassay for active plant constituents. Planta Med [serial online] 1982 May [cited 2009 January 22]; 45(5): 31-4.
Rice SA, Maness IB. Brine shrimp bioassays: a useful technique in biological investigations. The American Biology Teacher [serial online] 2004 [cited 2009 Feb 7]; 66 (3): 208-215.
c
Chapter 5 : Toxicology Of Plant Materials. [serial online] [cited 2009 Feb 7].
Moongkarndi, P., Kosem, N., Kaslungka, S., Luanratana, O., Pongpan, N., Neungton, N. Antiproliferation, Antioxidation and Induction of Apoptosis by Garcinia mangostana (Mangosteen) on SKBR3 Human Breast Cancer Cell Line. J Ethnopharmacol. 2004, 90, 161-166.
