BCG
The effect of Sambiloto
(
Andrographis paniculata
)
and Temulawak
(
Curcuma
xanthorriza
)
extract onT
HCD4+cell of DDY mice induced with BCG
Elrade Rofaani*, Tarwadi*, Sri Hartini**, Sriningsih*, Fifit Juniarti*, Churiyah* *Pusat Teknologi Farmasi dan Medika (PTFM) - BPPT
**Instalasi Patologi Klinik RS. Kanker Dharmais PTFM, Jl. MH. Thamrin No. 8 BPPT Gd. II lt. 15 Jakarta
Telp/Fax : 021-3169505
e-mail: elrade_ms2000@yahoo.com.com
ABSTRAK
Temulawak (Curcuma xanthorrhiza) dan Sambiloto (Andrographis paniculata) merupakan tanaman obat Indonesia yang khasiatnya sudah banyak diketahui dan dimanfaatkan untuk kesehatan secara turun temurun, salah satunya sebagai imunostimulan atau peningkat daya tahan tubuh. Tujuan penelitian adalah untuk
mengetahui efikasi dari pengembangan formula herbal temulawak dan sambiloto dalam meningkatkan daya
tahan tubuh, yaitu melalui peningkatan jumlah sel Th CD4+. Penelitian dilakukan menggunakan hewan coba
mencit jantan galur ddY (deutch democratic Yokohama) yang diinduksi dengan 0,1 ml vaksin BCG i.p. pada hari pertama dan ketujuh, pemberian ekstrak selama 10 hari, kemudian pada hari terakhir (H-10) dilakukan pengukuran kadar CD4+ menggunakan flowsitometer. Hewan coba dikelompokkan menjadi 7 kelompok,
masing-masing kelompok terdiri dari 5 ekor. Kelompok pertama dan kedua diberi ekstrak sambiloto, temulawak secara oral dengan dosis 3 mg/20 g bb. Kelompok ketiga dan keempat formula ekstrak temulawak dan sambiloto dengan dosis 6 dan 30 g/20 gbb. Sedangkan kelompok lima, enam dan tujuh adalah kelompok kontrol positif, negatif dan pembawa. Hasil menunjukkan bahwa pemberian ekstrak maupun formula temulawak dan sambiloto mampu meningkatkan jumlah sel Th CD4+ dibanding terhadap kontrol pembawa
(p<0,05). Populasi sel Th CD4+ ekstrak sambiloto (4,19x103/ml) tertinggi dibandingkan dengan kelompok
lainnya (II. 2,34x103/ml; III. 2,13x103/ml; IV. 2,70x103/ml), positif (2,56x103/ml), dan pembawa (3,21x103/
ml). Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa pemberian ekstrak maupun formula dari temulawak dan sambiloto mampu meningkatkan jumlah sel Th CD4+ jika dibandingkan dengan kontrol pembawa (p<0,05).
ABSTRACT
Temulawak (Curcuma xanthorriza) and Sambiloto (Andrographis paniculata) are known as Indonesian medicinal
plant that has many properties and used for health for generations, one of them as an immunostimulant or
endurance enhancer. The research objective was to determine the efficacy of herbal formulas development of
temulawak and sambiloto in improving endurance, i.e.by increasing the number of Th CD4+ cells. The study was
conducted using experimental animals ddY strain male mice (deutch democratic Yokohama) induced with 0.1 ml i.p. BCG vaccine on the first day and the seventh, the extract was administered for 10 days. At the last days (H-10) levels of Th CD4+ was measured using flowcytometer. Experimental animals were grouped into 7 groups, each group consists of 5 mices. The first and second groups were given extracts of sambiloto, temulawakorally at a dose of 3 mg/20 g bw. The third and fourth groups were administered with formula extracts of javanese turmeric and sambiloto with a dose of 6 and 30 g/20 g bw. While group of five, six, and seven are the positive control group,
negative and carrier. Results showed that the extract of javanese turmeric and sambiloto formula increased
the number of Th CD4+ cells compared to the carrier control (p<0.05). Population of Th CD4+ cells of sambiloto extract group (4.19x103/ml) was the highest, compared with the other groups (II. 2,34x103/ml; III. 2,13x103/ml;
IV. 2,70x103/ml), positive (2.56x103/ml), and carrier (3.21x103/ml). It can be concluded that the single extract
or formula extract of temulawak and sambilotowere able to increase the number of Th CD4+ cells compared with
carrier control (p <0,05).
Keywords: temulawak, sambiloto, immunostimulant, CD4 + Th cells
PENDAHULUAN
Sel Th CD4+ (Cluster of Differentiation 4) adalah molekul protein yang terekspresikan di permukaan sel Thelper, Treg, monosit, makrofag dan dendritik. CD4 dewasa disebut juga sel Th CD4+. Sel Th CD4+ digunakan sebagai salah satu parameter utama untuk mendeteksi adanya infeksi HIV pada pasien karena CD4 berfungsi sebagai molekul target HIV. Molekul protein permukaan amplop HIV gp120 berikatan kuat dengan CD4. Ikatan ini menyebabkan adanya pergeseran konformasi co -reseptor yang terekspresi pada sel inang. Adanya infeksi HIV menyebabkan turunnya jumlah sel limfosit Thelper CD4+ secara drastis, hal ini yang mengantarkan infeksi pada tahap simfotik atau
acquired immunodeficiency syndrome (AIDS).
Menurut WHO, kategori seseorang yang memiliki jumlah CD4+ antara 500-1.600 adalah normal,
sementara jika kurang dari < 200 adalah positif HIV. Intravesical Bacillus Calmette-Guerin (BCG) merupakan imunoterapi yang sangat efektif untuk kanker. Intravesical BCG menghasilkan respon sel yang termediasi secara signifikan dalam ginjal. Hal ini ditunjukkan oleh ada dan meluasnya sel limfosit T, dan menurunnya sejumlah sitokin yang berasosiasi dengannya. Sebagai tambahan, BCG memiliki mekanisme imunitas pada profil sel Th1-sitokin, yang sangat penting dari pengaruh tumor. Fungsi ini tergantung juga pada sel CD4+, CD8+, dan Natural
Killer.
senyawa aktif dalam sambiloto yang terkenal dengan grup diterpenoid, yaitu andrografolid (AP1), 14-deoksi-11,12-didehidroandrografolid (AP3) dan neoandrografolid (AP4) (Pholpana, 2004). Kumar et al.(2004) melaporkan bahwa sambiloto memiliki potensi aktivitas antikanker dan imunostimulan. Fraksi diklorometan pada konsentrasi rendah menghambat sel kanker usus besar HT-29 dan mampu meningkatkan proliferasi sel limfosit. Selain itu, ketiga senyawa utama sambiloto tersebut, yaitu andrografolid menunjukkan aktivitas anti virus Herpes Simplex Virus 1 (HSV-1) (Wiart et al., 2005). Andrografolid berperan dalam mekanisme transduksi sel dari virus dengan mempengaruhi reproduksi enzim (Nanduri, 2003). Penelitian lain menemukan bahwa andrografolid mampu memodulasi antigen imunitas spesifik dan non-spesifik, seperti sel NK, makrofag dan sitokin (Peng etal., 2002). Efek imunostimulasi andrografolid berupa peningkatan proliferasi sel dan IL-2 (Rajagopal et al., 2003). Pada tahun 2000, Calabrese dan rekannya telah menguji andrografolid di fase klinik I terhadap pasien HIV, hasil menunjukkan bahwa andrografolid meningkatkan jumlah sel limfosit Thelper CD4+ pada dosis 5,10, 15, dan 20 mg/kg BB selama 3 minggu perlakuan. Dengan hal ini maka kemungkinan andrografolid menghambat HIV melalui disregulasi siklus sel, yang pada akhirnya bisa meningkatkan kadar limfosit CD4+ dari pasien yang terinfeksi HIV, namun indikasi lain menunjukkan bahwa tidak adanya perubahan kadar RNA HIV-1 pada plasma darah pasien HIV.
Temulawak atau Curcuma xanthor-rhiza memiliki tiga (3) senyawa utama, yaitu
demethoxycurcumin, bisdemethoxycurcumin dan
curcumin (Rusley et al., 2007). Curcumin dan
curcuminoid telah dilaporkan memiliki poten-si menghambat replikapoten-si HIV (Liet al., 1993). Penghambatan curcumin ini melalui mekanisme penghambatan produksi p24 (protein inti HIV) dan transkripsi gen Tat (Mazumberet al., 1995).
Sambiloto dan temulawak adalah salah satu tanaman obat Indonesia yang memiliki banyak potensi dan manfaat untuk kesehatan masyarakat. Oleh karena itu, perlu adanya pembuktian secara ilmiah terhadap khasiat-khasiat sambiloto dan temulawak terutama terhadap peningkatan atau modulasi sistem imunitas, baik dalam rangka melawan infeksi virus maupun penyebaran sel kanker atau sel kanker yang disebabkan oleh infeksi virus. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui khasiat ekstrak etanol sambiloto dan temulawak dalam meningkatkan atau memodulasi sistem imunitas selular spesifik, yaitu sel limfosit Th CD4+ pada hewan coba mencit yang diinduksi dengan BCG i.p.
METODE PENELITIAN
Penyiapan simplisia dan ekstrak
kemudian dikeringkan menggunakan rotavapor pada suhu 40°C selama 7 jam, dan akhirnya diperoleh 30-40 g ekstrak kental sambiloto dan temulawak. Ekstrak tersebut digunakan dalam penelitian untuk mengevaluasi aktivitas imunitas (sel limfosit Th CD4+) hewan coba mencit galur ddY.
Penyiapan hewan coba
Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit galur deutch democratic Yokohama (ddY) jantan sebanyak 28 ekor yang memiliki berat badan 20-30 g. Hewan coba dikelompokkan menjadi 7 dan masing-masing kelompok terdapat 5 ekor mencit. Sebelum penelitian diperhitungkan, hewan coba dipelihara (aklimatisasi) selama seminggu untuk menyesuaikan kondisi atmosfer ruangan coba dengan diberi makan dan minu secara teratur sesuai kaidah penelitian dan berat badan tetap dikontrol tiap seminggu sekali. Pada H-1 dan H-7, hewan coba diinduksi dengan 0,1 ml vaksin BCG i.p., kecuali kelompok kontrol pelarut. Kelompok I dan II masing-masing diberi ekstrak sambiloto dan temulawak secara oral dengan dosis 3 mg/20 gbb (150 g/kg bb) selama 10 hari. Sedangkan kelompok III dan IV diberi perlakuan formula ekstrak sambiloto dan temulawak dengan dosis 6 dan 30 mg/20 g bb (300 dan 1.500 g/kg bb). Kelompok V adalah kontrol positif yang mendapatkan ekstrak produk komersial. Kelompok VI dan VII tidak diberi ekstrak, namun hanya kontrol negatif dan pelarut pembawa. Penghitungan sel limfosit Th CD4+
Penghitungan CD4+ dilakukan pada hari ke-10 setelah induksi BCG i.p. dan pemberian ekstrak atau formula ekstrak. CD4+ diukur
dari sampel darah hewan coba menggunakan kit reagen flowsitometriCD4PE/CD8FITC/ CD3PECy7 (produk BD), yang dilakukan di RS Kanker Dharmais, Jakarta. Sebanyak 0,5 ml sampel darah hewan coba ditempatkan pada tabung yang telah terisi 10% heparin untuk menghindari pembekuan darah. Sebanyak 20µl poliklonal antibodi CD4PE/CD8FITC/ CD3PECy7 dan 20 µl sampel darah hewan coba dihomogenkan dan diinkubasi pada ruang gelap selama 15 menit, dan ditambahkan larutan pelisis darah sebanyak 460 µl. Kemudian sampel siap untuk dianalisis kadar CD4+nya pada instrumen flowsitometri. Data yang diperoleh diolah menggunakan program CellQuestPro. Analisis statistik
Rerata dan standard error dari rerata hasil olah data CD4+ dihitung untuk melihat adanya perubahan peningkatan atau penurunan jumlah sel limfosit Th CD4+. Analysis of variance (ANOVA) juga digunakan untuk mengetahui adanya tingkat perbedaan antar kelompok.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Sampel darah dan reagen CD4PE/ CD8FITC/CD3PECy7 yang telah dihomogenkan dan diinkubasi pada ruang gelap selama 15 menit untuk memberi waktu poliklonal antibodi tersebut berinteraksi dengan antigen sampel darah yang terekspresikan karena induksi BCG i.p. dan pemberian ekstrak selama 10 hari. Plot sitogram forward dan side scattering digunakan untuk mengalokasikan populasi sel leukosit (R1) yang dilanjutkan dengan analisis plot sitogram flouresen label yang terdapat pada poliklonal antibodi. Kit reagen poliklonal antibodi digunakan dalam analisa CD4+. Poliklonal antibodi terdiri dari CD3 yang dikonjugasi dengan label PECy7. Antibodi CD3PECy7 akan berinteraksi dengan antigen CD3 sel leukosit (R3). Sel leukosit yang positif CD3PECy7 kemudian disubstraksi agar diperoleh CD4PE positif dan CD8FITC positif. CD4+ adalah sel yang positif CD3PECy7 dan CD4PE (R4) dan CD8+ adalah CD3PECy7 dan CD8 positif (R5). Sementara R2 adalah trucont bead, yang digunakan sebagai standar jumlah bead
sebanyak 1.000 events persatuan waktu (Gambar 1.).
Gambar 1. Plot sitogram flowsitometri poliklonal
antibodi CD4PE/CD8FITC/CD3PECy7 sampel darah hewan coba mencit ddY
Tiga parameter telah didapatkan dari analisa flowsitometri diatas, yaitu jumlah sel limfosit yang mengekspresikan antigen CD3, CD4, dan CD8. Sementara yang digunakan dalam penelitian ini hanya melihat parameter CD4, yaitu CD4+. Meskipun antara CD3 dan CD4 akan berkorelasi positif secara linier. Hasil data CD3 dan CD4+ hewan coba mencit yang telah diinduksi dengan BCG i.p. dan diberi ekstrak maupun formula selama 10 hari bisa ditemukan pada Tabel 1 dan Gambar 2.
Tabel 1. Jumlah CD3+ dan CD4+ masing-masing
kelompok perlakuan
Kelompok Jumlah (x103sel/ml)
CD3 CD4
K1 7,57 4,19
K2 4,30 2,34
K3 3,63 2,13
K4 4,54 2,70
K5 4,77 2,56
K6 6,11 3,21
K7 3,82 1,97
Gambar 2. Jumlah CD3 dan CD4+ hewan coba mencit
Dari Tabel 1 dan Gambar 2 diatas, hasil menunjukkan bahwa kontrol negatif, yaitu kelompok hewan coba yang hanya diinduksi dengan 0,1 ml BCG i.p. memiliki jumlah CD3 dan CD4+ sebesar 6,11 dan 3,21 x 103 sel/ml. Jumlah ini lebih tinggi jika dibandingkan dengan kontrol pelarut pembawa ekstrak, yaitu CMC-Na (3,82 dan 1,97 x103 sel/ml), perbedaan ini sangat bermakna (p<0.05). Demikian pula dengan kelompok lain kecuali sambiloto, yaitu ekstrak 3 mg/20 gbb temulawak; formula pada dosis 6 dan 30 mg/20 gbb lebih rendah dibanding dengan kontrol negatif BCG i.p. secara bermakna (p<0,05). Hal ini mengindikasikan bahwa dengan induksi BCG i.p. sebagai dasar standar jumlah ekspresi CD4+ dan pemberian ekstrak temulawak dan formula ekstrak tidak mampu meningkatkan jumlah CD3 dan CD4+ hewan coba mencit. Dengan kata lain, induksi BCG i.p. sendiri dapat memodulasi ekspresi CD4+ lebih kuat dibandingkan dengan induksi BCG i.p. yang dilengkapi dengan pemberian ekstrak temulawak maupun formulasinya di dosis rendah maupun tinggi. Kurkumin yang terdapat pada ekstrak temulawak dalam etanol 96% tidak bekerja dengan baik dalam memodulasi CD3 dan CD4+. Namun ditemukan bahwa formulasi sambiloto dan temulawak pada dosis tinggi (30 mg/20gbb) memiliki CD3 dan CD4+ yang hampir setingkat dengan produk komersil yang ada di pasaran. Jika pengaruh BCG i.p. dihilangkan, ada potensi besar pada formula yang diberikan dibanding dengan ekstrak tunggal temulawak dan formula dosis rendah (3 mg/20 gbb). Meskipun, pada ekstrak tunggal temulawak juga menghasilkan tingkat CD3 dan CD4+ yang tidak berbeda nyata
(p<0,05) terhadap formula dosis tinggi dan produk komersil. Hal ini mengindikasikan bahwa kurkumin pada ekstrak etanol 96% tidak banyak berpengaruh ketika diberikan secara tunggal maupun bersinergi dengan andrografolid sambiloto.
Hal yang lebih baik ditunjukkan oleh ekstrak etanol 70% sambiloto, dengan dosis 3 mg/20gbb meningkatkan jumlah CD3 dan CD4+ berbeda nyata (p<0,05) terhadap kelompok hewan coba yang diberi temulawak, formula dan kontrol positif, negatif maupun pelarut pembawa. Kemungkinan besar andrografolid berperan besar dalam peningkatan CD4+ ini, dimana telah disebutkan bahwa andrografolid mampu memodulasi antigen imunitas spesifik dan non-spesifik, seperti sel NK, makrofag dan sitokin (Peng et al., 2002). Efek imunostimulasi andrografolid yaitu meningkatkan proliferasi sel dan IL-2 (Rajagopal et al., 2003).
KESIMPULAN
Dengan demikian, dapat disimpulkan bahwa ekstrak sambiloto dengan kandungan andrografolidnya bisa bekerja dengan baik dalam memodulasi imunitas spesifik sel limfosit Th CD4+ ketika diberikan secara tunggal. Dan, andrografolid ini tidak bersinergi bagus dengan kurkumin ekstrak etanol 96% temulawak terhadap modulasi CD4+.
UCAPAN TERIMA KASIH
DAFTAR PUSTAKA
Kumar RA., K. Sridevi K., Kumar NV., Nanduri S., Rajagopal S. 2004. Anticancer and immunostimulatory compounds from
Andrographis paniculata.Journal of
Ethnopharmacology, 92: 292-295.
Li CJ., Zhang LJ., Dezube BJ., CrumpackerCS., and Pardee AB. 1993.Three inhibitors of type 1 human immunodeficiency virus long terminal repeated-directed gene expression and virus replication. Proc. Natl. Acad. Sci., 90:1839-1842.
Mazumder A., Raghavan K., Weinstein J., Kohn KW., and Pommier Y. 1995. Inhibition of human immunodefndrographis aniciency virus type-1 integrase by curcumin.
Biochem Pharmacol., 49(8):1165-1170.
NanduriS., Rajagopal S., Pothukuchi S., Bhadramma S., Pillai K., and Chakrabati R. 2003. United States Patent 6576662.
Compound having anticancer activity: Process of their preparation and pharmaceuticalcompositions containing them (US Patent Issued on June, 10, 2003). PholphanaN.,Rangkadilok N., Thongnest
S., Ruchirawat S., Ruchirawat M., and Satayavivad J. 2004.Determination and Variation of Three ActiveDiterpenoids in
Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees.
Phytochem. Anal., 15:365-371.
Rajagopa S., Kumar RA., Deevi DS., Satyanaraya C., Rajagopalan R. 2003.Andrografolid, a potential cancer therapeutic agents isolated from Andrographis paniculata. J. Exp. Ther.
Oncol. 3(3):147-158.
Ruslay S.,Abas F.,Shaari K., Zainal Z., Maulidiani,
Sirat H., Israf DA., Lajis NH., Sharin. 2007. Characterization of the components present in the active fractions of health gingers (Curcuma xanthorrhiza and
Zingiber zerumbet) by HPLC–DAD–ESIMS.
Food Chemistry, 104: 1183–1191.
Wiart C., Kumar K., Yusof MY., Hamimah H., Fauzi ZM. and Sulaiman M. 2005. Antiviral Properties of Ent-labdene Diterpenes of
