Lampiran 1 Seleksi Tahap 1: Rata-rata tinggi tanaman, panjang akar, bobot basah dan bobot kering brangkasan ketimun setelah diinduksi oleh cendawan endofit
No. Spesies cendawan Kode
Isolat Tempat pengambilan sampel
Tinggi Tanaman (cm) Panjang akar (cm) Bobot basah Brangkasan (g) Bobot kering Brangkasan (g)
1 Kontrol 12.43a 5.77a 1.65a 0.56a
2 Gliocladium sp. GliACT1* Selopampang, Temanggung 20.70ef 19.17c 3.22d 0.62a 3 Gliocladium sp. GliACT2 Selopampang, Temanggung 15.20a-d 11.67ab 2.55b-d 0.89b 4 F. solani FsCB1 Bantar Kambing, Bogor 17.30a-f 11.27ab 2.38bc 0.61a 5 F. solani FsCB2 Bantar Kambing, Bogor 16.92a-e 9.50ab 2.51b-d 0.59a 6 F. solani FsCB3 Bantar Kambing, Bogor 18.25b-f 7.93ab 2.45bc 0.59a 7 F. oxysporum FoCJ1 Gumuk Mas, Jember 18.90c-f 9.17ab 2.68b-d 0.59a 8 F. solani FsCB4* Bantar Kambing, Bogor 22.12f 10.1ab 3.22d 0.62a 9 F. oxysporum FoCJ2 Gumuk Mas, Jember 19.73d-f 9.63ab 3.02cd 0.62a 10 F. oxysporum FoCJ3 Gumuk Mas, Jember 20.58ef 9.90ab 2.80b-d 0.61a 11 F. oxysporum FoCJ4 Gumuk Mas, Jember 16.77a-e 10.13ab 2.40bc 0.59a 12 F. oxysporum FoCJ5 Gumuk Mas, Jember 18.30b-f 11.50ab 2.89b-d 0.61a 13 F. oxysporum FoCJ6 Gumuk Mas, Jember 15.63a-e 7.70ab 2.34bc 0.57a 14 F. oxysporum FoCJ7 Gumuk Mas, Jember 17.23a-f 9.60ab 2.95b-d 0.60a 15 Colletotrichum sp. CgCB1 Bantar Kambing, Bogor 15.37a-d 9.03ab 2.25ab 0.59a 16 Colletotrichum sp. CgCB2 Bantar Kambing, Bogor 16.82a-e 10.60ab 2.68b-d 0.60a 20 Colletotrichum sp. CgCB3 Bantar Kambing, Bogor 14.03a-c 13.87b 2.27ab 0.59a 21 Colletotrichum sp. CgCB4 Bantar Kambing, Bogor 13.50ab 9.93ab 2.60b-d 0.60a
Keterangan: Angka yang diikuti oleh huruf yang sama di dalam lajur yang sama tidak berbeda nyata setelah perhitungan uji Duncan (α=0,05) * Isolat terseleksi
Lampiran 2 Seleksi Tahap 2: Rata-rata tinggi tanaman, panjang akar, bobot basah dan bobot kering brangkasan ketimun setelah diinduksi oleh cendawan endofit
No. Spesies cendawan Isolat Tempat pengambilan sampel Tinggi Tanaman (cm) Panjang akar (cm) Bobot basah Brangkasan (g) Bobot kering Brangkasan (g)
1 Kontrol 24.98a-f 13.97a-e 3.47a-e 0.04a
2 Colletotrichum sp. CgCT3 Selopampang, Temanggung 19.92a 12.08a 1.58a 0.08ab 3 Colletotrichum sp. CgCJ2 Gumuk Mas, Jember 26.33c-g 14.11a-e 3.60a-e 0.51a-f 4 A. flavus AfCB5 Bantar Kambing, Bogor 24.12a-e 13.08a-d 3.30a-d 0.44a-e 5 A. flavus AfRB2 Bantar Kambing, Bogor 27.92d-g 15.25b-e 4.75b-e 1.04d-g 6 F. oxysporum FoRJ3 Gumuk Mas, Jember 28.67d-g 15.95d-f 5.45d-f 1.10fg 7 F. oxysporum FoRJ4 Gumuk Mas, Jember 20.48ab 12.74ab 2.24ab 0.54a-f 8 F. oxysporum FoRJ5 Gumuk Mas, Jember 27.00c-g 14.66a-e 4.16a-e 0.72b-f 9 F. oxysporum FoRT1 Selopampang, Temanggung 27.87d-g 16.06d-f 5.56d-f 0.86g 10 F. oxysporum FoRT2 Selopampang, Temanggung 26.46c-g 14.10a-e 3.6ba-e 0.54a-f
11 F. solani FsCJ1* Gumuk Mas, Jember 32.20g 18.29f 7.79f 1.01c-g
12 F. solani FsCJ2 Gumuk Mas, Jember 22.82a-d 13.24a-c 2.74a-c 1.38a-d 13 F. solani FsCJ3 Gumuk Mas, Jember 26.97c-g 14.50a-e 4.00a-e 1.90a-f 14 Acremonium sp. AcrRB1* Bantar Kambing, Bogor 30.57fg 16.21d-f 5.71d-f 0.66b-f 15 Acremonium sp. AcrRB2* Bantar Kambing, Bogor 30.45fg 16.61ef 6.11d-f 1.08e-g 16 Acremonium sp. AcrRT1 Selopampang, Temanggung 30.10e-g 15.99d-f 5.49d-f 1.12fg 17 Acremonium sp. AcrRT2 Selopampang, Temanggung 21.37a-c 13.12a-c 2.62a-c 0.41c-g 18 Acremonium sp. AcrRT3 Selopampang, Temanggung 28.02d-g 15.58c-e 5.08c-e 0.38a-c 19 Gliocladium sp. GliRT1 Selopampang, Temanggung 27.39d-g 15.42b-e 4.92b-e 0.56a-f 20 Gliocladium sp. GliRJ1 Gumuk Mas, Jember 25.77bf 14.02a-e 3.52a-e 0.9c-g
Keterangan: Angka yang diikuti oleh huruf yang sama di dalam lajur yang sama tidak berbeda nyata setelah perhitungan uji Duncan (α=0,05) * Isolat terseleksi
Lampiran 3 Seleksi Tahap 3: Rata-rata tinggi tanaman, panjang akar, bobot basah dan bobot kering brangkasan ketimun setelah diinduksi oleh cendawan endofit
No. Spesies cendawan Isolat Tempat pengambilan sampel Tinggi Tanaman (cm) Panjang akar (cm) Bobot basah Brangkasan (g) Bobot kering Brangkasan (g)
1 Kontrol 15.12a 8.74a 7.12a-e 0.57a
2 Acremonium sp. AcrRJ2 Gumuk Mas, Jember 17.58b-d 9.58a-c 7.35a-e 1.32b-e 3 Acremonium sp. AcrRJ3* Gumuk Mas, Jember 19.02d-e 12.18e 9.19e 1.79ef 4 F. oxysporum FoRB2 Bantar Kambing, Bogor 18.37c-e 11.01c-e 8.02c-e 1.37b-e 5 F. oxysporum FoRB3 Bantar Kambing, Bogor 17.82b-d 11.95de 6.59a-c 1.52c-e 6 F. oxysporum FoRB4 Bantar Kambing, Bogor 16.62b 10.34a-e 8.08c-e 1.03bc 7 F. oxysporum FoRB5 Bantar Kambing, Bogor 17.64b-d 9.89a-d 6.90a-d 1.15b-d 8 F. oxysporum FoRB6 Bantar Kambing, Bogor 17.88b-d 10.85b-e 7.86b-e 1.30b-e 9 F. oxysporum FoRT3 Selopampang, Temanggung 19.49e 11.07c-e 9.18e 2.02f 10 F. oxysporum FoRT4 Selopampang, Temanggung 17.33bc 9.12a-c 6.13a-c 1.16b-d 11 F. oxysporum FoCB15* Bantar Kambing, Bogor 18.64c-e 12.17e 8.96de 1.59d-f 12 F. oxysporum FoCB16 Bantar Kambing, Bogor 18.60c-e 8.89ab 8.08c-e 1.49c-e 13 F. solani FsRT1 Selopampang, Temanggung 18.03b-e 10.11a-e 5.90ab 1.14b-d 14 F. solani FsRT2 Selopampang, Temanggung 18.03b-e 11.07c-e 5.75a 0.91ab Keterangan: Angka yang diikuti oleh huruf yang sama di dalam lajur yang sama tidak berbeda nyata setelah perhitungan uji Duncan (α=0,05)
* Isolat terseleksi
Lampiran 4 Seleksi Tahap 4: Rata-rata tinggi tanaman, panjang akar, bobot basah dan bobot kering brangkasan ketimun setelah diinduksi oleh cendawan endofit
No. Spesies cendawan Isolat Tempat pengambilan sampel Tinggi Tanaman (cm) Panjang akar (cm) Bobot basah Brangkasan (g) Bobot kering Brangkasan (g)
1 Kontrol 16.00a 7.53a 3.81ab 0.53a
2 Tricoderma sp. TricACT2 Selopampang, Temanggung 19.00a-c 10.70ab 4.58ab 0.52a 3 Tricoderma sp. TricACT3* Selopampang, Temanggung 24.93cd 12.90b 8.22c 1.24a 4 Tricoderma sp. TricACJ1 Gumuk Mas, Jember 17.63ab 8.27ab 3.53a 0.40a 5 Tricoderma sp. TricACT1 Selopampang, Temanggung 18.77a-c 8.53ab 3.42a 0.23a 6 Tricoderma sp. TricACJ1 Gumuk Mas, Jember 20.03a-c 9.40ab 5.64a-c 0.92a
7 F. solani FsCJ6 Gumuk Mas, Jember 20.17a-c 10.93ab 4.48ab 0.84a
8 F. solani FsCJ7 Gumuk Mas, Jember 19.10a-c 8.33ab 2.93a 1.28a
9 F. solani FsCT1 Selopampang, Temanggung 18.93a-c 9.40ab 3.32a 0.78a 10 F. solani FsCT2 Selopampang, Temanggung 19.03a-c 10.40ab 3.96ab 0.66a 11 F. oxysporum FoCB5* Bantar Kambing, Bogor 25.00cd 11.93ab 7.18bc 0.95a 12 F. solani FsCT4 Selopampang, Temanggung 22.13a-d 10.30ab 4.19ab 0.78a 13 F. oxysporum FoCT1* Selopampang, Temanggung 25.13 12.43ab 5.25a-c 0.78a 14 F. oxysporum FoCT2 Selopampang, Temanggung 23.60bc 11.50ab 4.74ab 2.68a 15 F. oxysporum FoRJ1 Gumuk Mas, Jember 21.87a-d 8.60ab 3.19a 0.40b 16 F. oxysporum FoRJ2 Gumuk Mas, Jember 20.17a-c 9.20ab 4.12ab 0.33a 20 F. oxysporum FoCB1* Bantar Kambing, Bogor 27.3d 12.33ab 6.13a-c 1.16a 21 F. oxysporum FoCB2* Bantar Kambing, Bogor 25.1cd 11.23ab 5.17a-c 1.10a 22 F. solani FsCT3 Selopampang, Temanggung 23.3bc 11.13ab 5.07a-c 0.72a 23 Colletotrichum sp. CgCT8 Selopampang, Temanggung 21.17a-d 9.73ab 4.99a-c 0.99a
Keterangan: Angka yang diikuti oleh huruf yang sama di dalam lajur yang sama tidak berbeda nyata setelah perhitungan uji Duncan (α=0,05) * Isolat terseleksi
Lampiran 5
Prosedur Analisis Histologis Batang
Analisis histologis batang dilakukan dengan metode Parafin (Sass 1958). Tahapan yang dilakukan dalam proses ini adalah sebagai berikut:
1. Fiksasi.
Fiksasi dilakukan dengan merendam organ batang cabai besar selama 24 jam dalam FAA (Etanol 50% 90 bagian, Asam asetat glasial 5 bagian, dan Formaladehide 40% 5 bagian).
2. Dehidrasi.
Organ batang cabai besar dicelupkan ke dalam alkohol dengan lama waktu pencelupan sebagai berikut:
- Alkohol 40% : 3 x 5 menit - Alkohol 60% : 3 x 5 menit - Alkohol 80% : 3 x 5 menit - Alkohol 95% : 3 x 5 menit - Alkohol 100% : 3 x 5 menit 3. Praparafinasi.
Organ batang cabai besar dicelupkan ke dalam larutan alkohol-xylol dengan perbandingan dan lama waktu pencelupan sebagai berikut:
Alkohol : Xylol Waktu
4 : 0 3 : 1 2 : 2 1 : 3 0 : 4 3 x 5 menit 3 x 5 menit 3 x 5 menit 3 x 5 menit 3 x 5 menit 4. Parafinasi.
Tahapan parafinasi dilakukan dengan mencelupkan batang cabai besar ke dalam campuran Xylol-parafin cair dengan perbandingan dan lama waktu pencelupan sebagai berikut:
Xylol-parafin cair Waktu 4 : 0 3 : 1 2 : 2 1 : 3 0 : 4 3 x 5 menit 3 x 5 menit 3 x 5 menit 3 x 5 menit 3 x 5 menit
kemudian organ batang cabai besar dicelupkan ke dam parafin murni selama 24 jam.
5. Blocking (pencetakan).
Organ batang cabai besar dimasukkan ke dalam parafin padat yang dicairkan dan dicetak dalam bentuk balok.
6. Pemotongan.
Proses pemotongan dilakukan dengan menggunakan mikrotom putar. Balok parafin yang berisi organ batang cabai besar dirapikan, ditempel pada holder, dan dipotong dengan tebal pemotongan 7 mikron. Permukaan yang mengkilap dari pita hasil pemotongan diletakkan menempel di permukaan objek gelas yang telah diolesi albumin-gliserin dan ditetesi air yang berfungsi sebagai perekat. Selanjutnya dipanaskan pada hot plate 45oC selama 3 jam.
7. Pewarnaan.
Tahap pewarnaan sebagai berikut Xilol 1 (5-10 menit), Xilol 2 ( 5-10 menit), Etanol-xilol ( 2-5 menit), Etanol-xilol ( 2-5 menit), Etanol-xilol ( 2-5 menit), Etanol absolut (2-5 menit), Etanol 95% ( 2-5 menit), Etanol 70% ( 2-5 menit), Etanol 50% ( 2-5 menit), Etanol 30% ( 2-5 menit), akuades (1-2 menit), Safranin 2% (12-24 jam), akuades (1-2 menit), Etanol 30% (2-5 menit), Etanol 50% ( 2-5 menit), Etanol 70% ( 2-5 menit), Etanol 95% ( 2-5 menit), Fast-green 0,5% (5-30 detik), Etanol absolut ( 2-5 menit), Etanol-xilol (3:1) selama 2-5 menit, Etanol – xilol (1:1): selama 2-5 menit, Etanol-xilol (1:3) selama 2-5 menit, Xilol 1 (5-10 menit) dan Xilol 2 (selama 5-10 menit)
Setelah tahap pewarnaan dilakukan penutupan dengan canada balsam. Selanjutnya gelas benda ditutup dengan gelas penutup dan diberi label. Pengamatan keberadaan cendawan endofit dalam batang cabai besar dilakukan di bawah mikroskop monokuler, meliputi hifa, atau konidia cendawan endofit yang berhasil mengkolonisasi organ batang cabai besar.
Lampiran 6
Prosedur Isolasi Monokonidia Cendawan
Isolat monokonidia dari cendawan patogen Colletotrichum spp. dan cendawan endofit F. oxysporum dan F. solani disiapkan dengan teknik isolasi monokonidia berdasarkan Boisson dan Lahlau yang dimodifikasi oleh Hadisutrisno (1988) sebagai berikut:
Biakan Murni C. acutatum
Suspensi Konidia
Goresan Berbentuk S pada Media WA (Inkubasi Kurang Lebih 12 Jam pada Suhu Kamar)
Isolasi Monokonidia di bawah mikroskop Binokuler (Inkubasi 4 x 24 Jam pada Suhu Kamar)
Isolat Monokonidia C. acutatum
Uji Virulensi
Disimpan sebagai biakan murni dalam
Lampiran 7
Prosedur Isolasi DNA dari Miselia Cendawan
Tiga potong koloni (diameter 3 mm) cendawan patogen hasil isolasi monokonidia dimasukkan ke dalam Erlenmeyer 250 ml berisi potato dextrose broth (PDB), dan diinkubasi selama 7 hari. Miselia cendawan diambil dengan filtrasi vakuum dan dicuci dengan akuades steril, selanjutnya dikeringkan. DNA diekstraksi dan dimurnikan menurut metode Sambrook et al. (1989) yang telah dimodifikasi. Sampel miselium cendawan (0,2 gr) digerus dengan nitrogen cair dan serbuk cendawan dimasukkan ke dalam tabung ependorf. Ke dalam tabung ditambahkan 1 ml buffer ekstrak untuk cendawan dan 10 µl mercapto ethanol, kemudian divortek. Untuk melisis dinding sel, dilakukan pemanasan dalam penangas air 65oC selama 30 menit sambil sesekali digoyang, dan didinginkan sampai dengan suhu ruang. Ke dalam tabung, ditambahkan 750 µl chloroform isoamil (24:1), divortek dan disentrifugasi pada 11000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang diperoleh dipindahkan ke tabung ependorf baru dengan menambahkan 1000 µl chloroform, divortek dan disentrifugasi pada 11000 rpm selama 10 menit. Supernatan dipindahkan ke tabung ependorf baru dan kedalamnya ditambahkan 1000 µl isopropanol dingin. Tabung dikocok perlahan untuk mengikat DNA dan diinkubasi pada -20oC selama 30 menit. Benang DNA yang diperoleh diendapkan dengan cara disentrifugasi selama 10 menit. Supernatan dibuang dan pellet dicuci dengan etanol (70%) dingin, dan disentrifugasi pada 11000 rpm selama 10 menit. Etanol dibuang hati-hati dan pellet dikeringkan dengan vakum. Pellet diresuspensi dalam 100 µl buffer TE dan disimpan -20oC.
Lampiran 8
Prosedur Analisis PCR dengan Primer Spesifik
Amplifikasi DNA dilakukan dengan teknik PCR. DNA genom dari isolat Colletotrichum patogenik diseleksi dengan primer spesifik. Primer spesifik untuk C. acutatum adalah CaInt2/ITS4, sedangkan primer spesifik untuk C. gloeosporioides adalah CgInt/ITS4.
Amplifikasi dilakukan dengan volume total 25 µl terdiri dari 2 µl DNA, 2,5 µl buffer 10x dan Mg2+, 0,5 µl dnTP 10 mM, 1 µl primer collect forward 10 M, 1 µl primer spesifik, 0,2 µl Taq DNA 5 unit/ µl, dan 17,8 µl H2O. Tabung yang berisi campuran larutan PCR dan DNA selanjutnya dimasukkan ke dalam mesin PCR. Kondisi amplifikasi dibagi menjadi beberapa tahap, yaitu optimasi 94oC (5 menit), diikuti 30 siklus amplifikasi yang terdiri dari pemisahan utas DNA 94oC selama 1 menit, penempelan primer 45oC selama 1 menit, síntesis DNA 72oC selama 2 menit. Khusus untuk siklus terakhir ditambah tahapan sintesis selama 10 menit, kemudian siklus akan berakhir dengan suhu 4oC. Setelah selesai, DNA yang terbentuk divisualisasi pada gel agarose. Sepuluh µl masing-masing sampel DNA Colletotrichum diteteskan ke lembaran parafilm dan ditambahkan 2 µl loading dye dan dicampur hingga merata dan dimasukkan ke dalam lubang sisiran gel. Aparatus elektroforesis diaktifkan pada 75 volt sampai loading dye yang berwarna biru tua berada 5 mm dari bagian bawah gel (memerlukan waktu sekitar 1 jam 20 menit). Selanjutnya gel diangkat dan direndam dalam larutan etidium bromide selama 10 menit. Visualisasi gel dilakukan pada transluminator, dan dilakukan pemotretan hasil visualisasi.
Lampiran 9 Prosedur Uji Virulensi
Uji virulensi dilakukan menurut teknik AVRDC (2002). Hasil isolasi Colletotrichum dari masing-masing daerah, dibiakkan dan diperbanyak pada media PDA. Buah cabai untuk uji virulensi diperoleh dari tanaman cabai kultivar Tit Super yang ditanam di rumah kaca Cikabayan. Buah cabai yang digunakan adalah buah yang telah masak fisologis (hijau) yaitu buah yang telah mencapai ukuran maksimum dan masih berwarna hijau.
a. Penyiapan Inokulum. Suspensi konidia Colletotrichum dibuat dengan menambahkan air steril 3 ml pada media kultur cendawan yang berumur 5 hari, dan menggosok permukaan koloni dengan kuas gambar no. 10. Suspensi konidia sebanyak 0,2 ml dituang pada masing masing cawan yang berisi PDA dan diinkubasi selama 12 hari. Panen konidia dilakukan dengan menambahkan air steril 15 ml, dan menggosok permukaan koloni dengan kuas gambar no. 10 untuk memisahkan konidia dari media. Suspensi konidia yang diperoleh tersebut disaring dengan kain kasa steril. Filtrat yang berisi konidia digunakan sebagai inokulum. Kerapatan konidia (5x105 konidia/ml) diukur dengan menggunakan hemasitometer di bawah mikroskop.
b. Inokulasi. Buah cabai dicuci bersih dengan air mengalir dan didesinfestasi dengan alkohol 70%. Kemudian dikeringkan dengan menggunakan kertas tissue dan diletakkan di bak plastik yang telah dialasi dengan plastik bergelombang. Buah cabai diinokulasi dengan cara menginjeksikan 1 µl suspensi konidia pada kulit buah cabai menggunakan hypodermic needle. Agar kelembaban cukup tinggi, maka digunakan kertas tissue basah yang ditempelkan pada permukaan dalam bak plastik. Percobaan dilakukan menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) dengan 20 kali ulangan.
c. Pengamatan. Pengamatan meliputi: (1) Masa inkubasi, yaitu waktu setelah inokulasi sampai terlihatnya gejala penyakit yang secara visual berupa bercak nekrotik berlekuk dan dinyatakan dalam satuan hari. (2) Diameter bercak dan kejadian penyakit pada hari ke sepuluh. Perkembangan bercak dianggap
a b
positif apabila diameter bercak nekrotik ≥ 4 mm. Kejadian penyakit (KP) dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Σ Buah dengan reaksi positif KP =
Σ Buah yang diamati x 100%
Lampiran 10
Karakteristik C. acutatum. (a) koloni tampak dari atas; (b) koloni tampak dari bawah; .(c) aservulus, (d) konidia (1000X)
Lampiran 11 Hasil amplifikasi DNA menggunakan primer spesifik C. acutatum (CaInt2/ITS4) dan C. gloeosporioides (CgInt/ITS4) untuk 4 isolat Colletotrichum : CA1 (kolom 1 dan 5), CA2 (kolom 2 dan 6), CA3 (kolom 3 dan 7), dan CA4 (kolom 4 dan 8).
Lampiran 12 Rata-rata masa inkubasi, diameter bercak dan kejadian penyakit antraknosa pada cabai kultivar Tit Super setelah diinokulasi C. acutatum
No. Isolat Asal Isolat Masa Inkubasi (hsi) Bercak (cm) Diameter Penyakit (%) Kejadian CA1 CA2 CA3 CA4* Bogor Jember Sukabumi Temanggung 4.5bc 6.35a 5b 3.5c 1c 0,96c 1,41b 3a 90 95 85 100 Kontrol - 0 0
Keterangan: Angka yang diikuti oleh huruf yang sama di dalam lajur yang sama tidak berbeda nyata setelah perhitungan uji Duncan (α=0,05)
hsi = hari setelah inokulasi; * = Isolat patogen terseleksi 490bp
M 1 2 3 4 M 5 6 7 8 Primer CaInt2/ITS4 Primer CgInt/ITS4
Lampiran 13 Gejala Antraknosa pada Buah Cabai setelah Inokulasi dengan C. acutatum (10 HSI). (a) Inokulasi dengan isolat CA1 (Bogor), (b) inokulasi dengan isolat CA2 (Jember), (c) Inokulasi dengan isolat CA3 (Sukabumi), dan (d) Inokulasi dengan isolat CA4 (Temanggung)
a b
Lampiran 14
Prosedur Uji Aktivitas Peroksidase
Pengukuran aktivitas peroksidase dilakukan menurut Hammerschmidt et al. (1982) yang telah dimodifikasi (Silva 2004). Prosedur uji aktivitas peroksidase adalah sebagai berikut:
1. Bibit cabai dari masing-masing perlakuan dicabut (setelah 1 HSI) lalu dicuci hingga bersih.
2. Selanjutnya bagian batang bibit cabai dihancurkan dengan mortar dalam bufer fosfat 0,01 M pH 6,0 dengan perbandingan 1:4 (g/ml).
3. Hasil hancuran disaring dengan kain dan disentrifugasi selama 30 menit dengan kecepatan 5000 rpm pada suhu 40C. Supernatan (sebagai sumber enzim) diencerkan dengan bufer fosfat 0,01 M pH 6.0 (1:3) dan dihomogenkan.
4. Untuk pengamatan aktivitas enzim 0,2 ml sumber enzim ditambahkan pada pereaksi yang terdiri atas 5 ml larutan pirogallol 0,5 M (terbuat dari 10 ml pirogalol 0,5 M ditambah dengan 12,5 ml bufer fosfat 0,066 M pH 6.0 dan diencerkan dengan akuades hingga volumenya menjadi 100 ml) dan 0,5 ml H2O2 1% di dalam kuvet.
5. Blanko disiapkan dengan memasukkan bahan-bahan di atas ke dalam kuvet tanpa sumber enzim.
6. Campuran tersebut dihomogenkan selama 5 hingga 10 detik dan diamati dengan spektrofotometer pada λ 420 nm.
7. Nilai absorban diamati setiap 30 detik selama 150 detik.
Penghitungan unit aktivitas enzim (UAE) dilakukan sebagai berikut: (1) nilai absorban yang diperoleh dikurangi dengan blanko, (2) rata-rata nilai absorban (b) dari satu pengamatan dihitung melalui persamaan regresi (Y=a+bx), (3) UAE = [ AOD x sumber enzim (ml)/ protein total (mg). AOD= optical-density (nilai absorban) rata-rata.
