Penelitian ini dilakukan selama 5 bulan, mulai Januari–Juni 2011 di Laboratorium Patologi Ikan, Balai Riset Perikanan Budidaya Air Tawar, Bogor, Jawa Barat.
Pemilihan Ikan Uji dan Bakteri (Patogen dan Probiotik)
Ikan uji yang digunakan adalah ikan mas (Cyprinus carpio) dengan bobot 15 – 30 gram. Dalam penelitian ini padat tebar ikan uji pada setiap akuarium sebanyak 10 ekor/20 liter. Bakteri probiotik yang digunakan dalam penelitian ini adalah bakteri probiotik P23 yaitu Bacillus firmus yang telah diteliti oleh Balai Riset Perikanan Air Tawar, Bogor (Lusiastuti 2010) dan bakteri patogen A. hydrophila (Balai Riset Perikanan Air Tawar, Bogor). Sebelum digunakan ikan uji diaklimatisasi selama 1 minggu.
Bahan dan Media
Bahan yang digunakan terdiri atas media kultur bakteri yaitu: Trypticase Soy Agar (TSA), Trypticase Soy Broth (TSB), media selektif untuk Aeromonas sp. dan Pseudomonas sp. yaitu media agar GSP, serta media selektif untuk A. hydrophila yaitu media Rhimler Shotts (R-S medium). Selain itu digunakan pula aquades, salin (larutan fisiologi), alkohol 96%, dan 70%, korek api, tisu, kapas tutup tabung reaksi, minyak imersi, garam ikan, PK (kalium permanganat) dan bahan-bahan lain untuk karakterisasi bakteri baik patogen maupun probiotik, bahan untuk histopatologi dan lain-lain.
Prosedur Penelitian
Penelitian terdiri atas persiapan dan pelaksanaan penelitian. Penelitian dilakukan dalam 4 tahapan yang masing-masing dijabarkan dalam suatu rangkaian penelitian. Sebelum rangkaian penelitian ini dijalankan maka A. hydrophila yang digunakan dalam penelitian ini terlebih dahulu dilaksanakan pasase.
Pasase dilakukan dengan penyiapan A. hydrophila yang dikultur pada media agar TSA dan kemudian diinkubasi selama 24 jam untuk kemudian dipindahkan ke media broth TSB. Selanjutnya suspensi sel tersebut siap untuk diinjeksikan ke ikan. Pada pasase ini 15 ekor ikan uji dimasukkan ke dalam dua akuarium untuk spesies bakteri patogen dan satu akuarium untuk kontrol (diinjeksi dengan larutan fisiologis). Selanjutnya ikan uji diamati sampai ikan tersebut menunjukkan gejala klinis atau sakit. Ikan yang sakit diambil untuk diisolasi bakterinya dengan cara digoreskan pada media GSP, RS, dan TSA. Goresan berasal dari luka, rongga perut dan organ ginjal. Koloni bakteri yang tumbuh diamati morfologi koloni, karakteristik biokimia (oksidase dan katalase) serta sifat Gram, untuk memastikan bakteri tersebut adalah spesies bakteri patogen yang diinfeksikan pada ikan. Proses pasase dilakukan dua kali untuk meningkatkan keganasan dari bakteri, selanjutnya bakteri dikultur pada media agar miring TSA untuk sediaan penelitian selanjutnya.
Penelitian Tahap I: Pertumbuhan A. hydrophila pada Media Budidaya Penelitian ini diawali dengan melihat kurva tumbuh A. hydrophila pada media broth (TSB) selama 24 jam. Pengamatan dan penghitungan jumlah bakteri dilakukan setiap 2 jam dengan metode TPC (Total Plate Count) pada media agar TSA. Hal ini dilakukan untuk mengetahui tingkat pertumbuhan A. hydrophila pada media broth.
Untuk dapat mengetahui pertumbuhan A. hydrophila pada media budidaya maka dilakukan serangkaian perlakuan terhadap bakteri tersebut berikut ini: (KA) Kontrol – tanpa penambahan A. hydrophila; (PA1) Media diberi A. hydrophila dengan kepadatan 102cfu/ml tanpa aerasi dan tanpa penambahan pakan; (PA2) Media diberi A. hydrophila dengan kepadatan 102cfu/ml dengan aerasi dan tanpa penambahan pakan; (PA3) Media diberi A. hydrophila dengan kepadatan 102cfu/ml dengan aerasi dan penambahan pakan setiap harinya; (PA4) Media diberi A. hydrophila dengan kepadatan 102cfu/ml tanpa aerasi dan dilakukan penambahan pakan setiap harinya, perlakuan ini ditempatkan pada ruangan biasa; (PA5) Media diberi A. hydrophila dengan kepadatan 102cfu/ml
tanpa aerasi dan juga dilakukan penambahan pakan setiap harinya, perlakuan ini ditempatkan pada ruangan yang dingin dengan suhu air 24-25oC.
Wadah yang digunakan pada penelitian ini adalah bejana air dari kaca yang diisi dengan air media budidaya sebanyak 2 liter per wadah. Media budidaya yang digunakan berasal dari sumur artetis. Pada setiap perlakuan diasumsikan berisi 10 ekor ikan dengan bobot rata-rata 18 gram dengan volume air 20 liter/akuarium, dengan pemberian pakan 5% dari bobot total ikan yaitu 9 gram/hari. Berdasarkan asumsi tersebut maka pemberian pakan pada penelitian tahap ini adalah 0.18 gram/hari/wadah.
Penelitian dilaksanakan selama 14 hari, dengan pemeriksaan pertumbuhan bakteri dilakukan setiap hari menggunakan metode TPC. Setiap perlakuan dilakukan pengulangan 2 kali. Hasil dari penelitian tahap ini menjadi dasar pertimbangan pada penelitian tahap selanjutnya.
Penelitian Tahap II: Pertumbuhan B. firmus pada Media Budidaya
Penelitian ini diawali dengan melihat kurva tumbuh probiotik B. firmus pada media broth (TSB) selama 24 jam. Pengamatan dan penghitungan jumlah bakteri dilakukan setiap 2 jam dengan metode TPC pada media agar TSA. Hal ini dilakukan untuk mengetahui tingkat pertumbuhan probiotik B. firmus pada media broth.
Untuk mengetahui pertumbuhan probiotik B. firmus pada media budidaya maka dilakukan serangkaian perlakuan terhadap bakteri tersebut. Rancangan penelitian terhadap probiotik B. firmus adalah sebagai berikut: (KP) Kontrol – tanpa penambahan bakteri; (PP1) Media diberi probiotik B. firmus dengan kepadatan 102cfu/ml tanpa aerasi dan tanpa penambahan pakan; (PP2) Media diberi probiotik B. firmus dengan kepadatan 102cfu/ml dengan aerasi dan tanpa penambahan pakan; (PP3) Media diberi probiotik B. firmus dengan kepadatan 102 cfu/ml dengan aerasi dan diberikan penambahan pakan setiap harinya; (PP4) Media diberi probiotik B. firmus dengan kepadatan 102cfu/ml tanpa aerasi namun dengan penambahan pakan setiap harinya.
Wadah yang digunakan pada penelitian ini adalah bejana air dari kaca yang diisi dengan air media budidaya sebanyak 2 liter per wadah. Media
budidaya yang digunakan berasal dari sumur artetis. Pada setiap perlakuan diasumsikan berisi 10 ekor ikan dengan bobot rata-rata 18 gram dengan volume air 20 liter/akuarium, dengan pemberian pakan 5% dari bobot total ikan yaitu 9 gram/hari. Berdasarkan asumsi tersebut maka pemberian pakan pada penelitian tahap ini adalah 0.18 gram/hari/wadah dan dilakukan selama 4 hari.
Setelah diketahui hasil dari penelitian tahap ini, selanjutnya dilakukan pencarian konsentrasi terbaik dari probiotik B. firmus dengan A. hydrophila secara in vitro dengan uji kultur bersama. Pada uji kultur bersama antara probiotik B. firmus dengan A. hydrophila ini dibandingkan hasil setiap ujinya dengan kontrol. Uji kultur bersama dilakukan pada perbandingan probiotik B. firmus : A. hydrophila =102 : 102cfu/ml hingga probiotik B. firmus : A. hydrophila =1012 : 102cfu/ml; dan kontrol hanya A. hydrophila 102cfu/ml saja.
Setiap perlakuan dikultur pada media broth TSB selama 24 jam untuk selanjutnya diencerkan hingga kepadatan yang diinginkan lalu di kultur bersama pada media broth TSB kembali dan diinkubasi selama 24 jam. Selanjutnya seluruh perlakuan ditanam kedalam media agar RS dan diinkubasi selama 24 jam. Setelah diinkubasi selama 24 jam maka A. hydrophila yang tumbuh pada media RS dilihat dan dibandingkan dengan kontrol. Konsentrasi probiotik yang digunakan pada penelitian tahap IV adalah hasil terbaik dari uji kultur bersama yang telah dilakukan secara in vitro, hasil terbaik ditunjukkan dengan semakin sedikitnya A. hydrophila yang tumbuh pada media RS.
Penelitian Tahap III: Infeksi A. hydrophila pada Ikan Mas (Cyprinus carpio) melalui Media Budidaya
Penelitian tahap ketiga ini dilakukan sesuai dengan hasil dari penelitian tahap pertama yang berkaitan dengan pertumbuhan A. hydrophila pada media budidaya.
Pada tahap ini dilakukan tiga perlakuan selama 14 hari yaitu: (PA) Perlakuan pemberian A. hydrophila 102 cfu/ml pada media budidaya tanpa adanya penyiponan. (PK) Perlakuan tanpa pemberian A. hydrophila pada media budidaya tanpa adanya penyiponan. (KS) Perlakuan tanpa pemberian A. hydrophila pada media budidaya namun dilakukan penyiponan setiap 3 hari.
Perlakuan ini juga dianggap sebagai perlakuan kontrol. Setiap perlakuan dilakukan 3 kali pengulangan.
Setiap akuarium dimasukan ikan uji 10 ekor/ 20 liter air media budidaya dengan pemberian pakan sebanyak 5 % dari bobot total ikan uji per akuarium. Pemberian pakan dilakukan sedikit demi sedikit hingga ikan uji kenyang dan tidak merespon setiap pakan yang diberikan.
Hasil penelitian tahap ini akan dijadikan sebagai dasar tingkat patogenitas A. hydrophila.
Penelitian Tahap IV: Pemberian Probiotik B. firmus melalui Media Budidaya terhadap Infeksi A. hydrophila
Tahap keempat penelitian ini merupakan suatu penerapan dan aplikasi usaha pemecahan permasalahan yang terjadi dengan serangkaian penelitian yang telah dilakukan. Setelah mendapatkan dua hasil konsentrasi terbaik probiotik B. firmus dengan A. hydrophila secara in vitro pada penelitian kedua, selanjutnya diimplementasikan secara in vivo pada penelitian tahap IV yaitu pemberian probiotik B. firmus pada media budidaya terhadap infeksi A. hydrophila.
Pada tahap ini dilakukan perlakuan selama 14 hari yaitu: (PAP) Perlakuan penambahan A. hydrophila 102cfu/ml dan pemberian probiotik B. firmus 106 cfu/ml yang diberikan setiap 2 hari; (PC) Perlakuan penambahan A. hydrophila 102 cfu/ml dan pemberian probiotik B. firmus 108 cfu/ml yang diberikan setiap 2 hari; (PK) Perlakuan tanpa penambahan A. hydrophila dan tanpa penambahan probiotik B. firmus serta tanpa penyiponan; (PAS) Perlakuan penambahan A. hydrophila 102 cfu/ml dan pemberian probiotik B. firmus 106 cfu/ml namun dengan penyiponan setiap 2 hari sekali.
Pengukuran Parameter
Pengukuran parameter dalam penelitian ini meliputi fase pertumbuhan bakteri, tingkat kelangsungan hidup, gejala klinis, gambaran darah, histopatologi, dan pengukuran kualitas air.
Fase pertumbuhan bakteri
Pengukuran kinetik pertumbuhan, untuk mengetahui pertumbuhan A. hydrophila dan probiotik B. firmus yang ditumbuhkan pada media broth (TSB),
masuk fase penurunan. Hasil pengenceran dikultur pada media agar (TSA), diinkubasi selama 24 jam dan dihitung kepadatannya.
Kelangsungan hidup
Kelangsungan hidup/survival rate (SR), dihitung dengan metode menurut Effendi (1979).
Keterangan :
SR = Kelangsungan hidup (%)
Nt = Jumlah ikan yang hidup pada akhir pemeliharaan (ekor) No = Jumlah ikan pada awal pemeliharaan (ekor)
Gejala klinis
Parameter gejala klinis yang diamati meliputi perubahan tingkah laku ikan yang dapat dijadikan indikator kesehatan ikan, berupa respon reflek (renang, gerak renang ikan pada kolom air dan pernafasan ikan), patologi anatomi tubuh eksternal berupa kecerahan warna tubuh dan mata, kondisi kulit, geripis atau rusaknya sirip atau kelainan lainnya. Selain itu diamati respon makan ikan terhadap pakan yang diberikan selama penelitian dilaksanakan.
Gambaran darah Kadar hematokrit
Kadar Hematokrit (He) diukur menurut Anderson dan Siwicki (1993). Kadar He ditentukan dengan cara: sampel darah dimasukkan dalam tabung mikrohematokrit sampai kira-kira 3/4 bagian tabung, ujungnya disumbat dengan crytoseal sedalam 1 mm. Setelah itu disentrifus dengan sentrifus hematokrit selama 15 menit dengan kecepatan 5000 rpm selama 5 menit dan dilakukan pengukuran panjang darah yang mengendap (a) serta panjang total volume darah yang terdapat didalam tabung (b). Kadar He dinyatakan sebagai % volume padatan sel darah yang dihitung dengan cara; He = (a/b) x 100%.
Kadar hemoglobin
Pengukuran kadar hemoglobin (Hb) dilakukan dengan metode Sahli dengan sahlinometer (Wedemeyer dan Yasutake 1977). Kadar Hb diukur dengan cara mengkonversikan darah ke dalam bentuk asam hematin setelah darah ditambah dengan asam klorida. Prosedur perhitungan dilakukan dengan cara :
SR = x 100%
No Nt
darah dihisap dengan pipet sahli sampai skala 20 mm3 atau skala 0,2 ml, lalu ujung pipet dibersihkan dengan kertas tisu. Setelah itu darah dalam pipet dipindahkan dalam tabung Hb-meter yang telah diisi HCl 0,1 N sampai skala 10 (merah), diaduk dan dibiarkan selama 3 sampai 5 menit. Akuades ditambahkan sampai warna darah dan HCl tersebut seperti warna larutan standar yang ada dalam Hb meter tersebut. Kemudian skala dibaca dengan melihat permukaan cairan dan dicocokkan dengan skala tabung sahli yang dilihat pada skala berwarna kuning (gr %) yang berarti banyaknya hemoglobin dalam gram per 100 ml darah. Total eritrosit
Jumlah eritrosit dihitung dengan metode Blaxhall dan Daisley (1973). Perhitungan eritrosit dilakukan dengan cara: sampel darah dihisap dengan pipet sampai skala 0.5, kemudian ditambahkan larutan Hayem’s sampai skala 101, digoyang atau diayunkan membentuk angka delapan selama 3 – 5 menit agar bercampur homogen. Tetesan pertama dibuang, tetesan berikutnya diteteskan ke dalam hemasitometer dan ditutup dengan kaca penutup, diamati di bawah mikroskop. Perhitungan dilakukan pada kotak kecil hemasitometer, Σ eritrosit = Σ sel eritrosit terhitung x 104sel/mm3.
Total leukosit
Jumlah leukosit dihitung dengan metode Blaxhall dan Daisley (1973) yaitu : sampel darah dihisap dengan pipet berskala sampai 0,5. Lalu ditambahkan larutan turk’s dihisap sampai skala 11 selanjutnya pipet digoyang membentuk angka delapan selama 5 menit agar bercampur homogen. Tetesan pertama dibuang, tetesan berikutnya dimasukkan ke dalam hemasitometer ditutup dengan kaca penutup, diamati dibawah mikroskop. Perhitungan dilakukan pada kotak kecil hemasitometer, Σ leukosit = Σ sel leukosit terhitung x 50 sel/mm3.
Histopatologi
Pengukuran parameter histopatologi dilakukan pada organ hati dan ginjal ikan mas. Sampel organ yang diambil, difiksasi dengan menggunakan larutan fiksatif Neutral Buffer Formalin (NBF) 10%. Organ yang telah difiksasi sekurang-kurangnya 24 jam dipotong sebesar 3-5 mm dan 1 x 1 cm, selanjutnya jaringan tersebut dimasukkan dalam etanol bertingkat. Kemudian jaringan dimasukkan dalam xylene lalu paraffin untuk dilakukan proses blocking. Jaringan
dipotong dengan mikrotom rotary dengan ketebalan 3-5 µm dan diletakkan pada gelas objek. Setelah proses tersebut diatas tahap selanjutnya dilakukan proses pewarnaan dengan menggunakan hematoksilin–eosin. Selanjutnya preparat diamati di bawah mikroskop untuk mengamati perubahan jaringan yang mungkin terjadi. Histopatologi dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui tingkat kerusakan organ akibat serangan bakteri patogen. Masing-masing perlakuan diambil satu ekor ikan uji sebagai sampel.
Analisa Data
Data utama penelitian ini berupa tingkat kelangsungan hidup, fase pertumbuhan bakteri, kepadatan bakteri pada media budidaya beserta data pendukung berupa kualitas air, gejala klinis, dan perubahan gambaran darah, akan dianalisa secara deskriptif dengan menggunakan tabel, grafik dan gambar.
