PREPARASI
DEINOCOCCUS RADIODURANS
DAN
KHAMIR DALAM MATERIAL KECAP
L-DRYING
SEBAGAI BAHAN UJI PROFISIENSI
Titin Yulinery, Ratih M.Dewi dan Novik NurhidayatPeneliti di Bidang Mikrobiologi, P2 Biologi, LIPI Jl.Raya Jakarta-Bogor, km 46 Cibinong
Abstrak
Tes kemampuan adalah salah satu kegiatan penting dalam pengendalian mutu dan jaminan kualitas mikrobiologi laboratorium untuk mengukur kompetensi analis dan analisis uji profisiensi membutuhkan persiapan Model mikroorganisme adalah kualitas standar dan validitas. Mikrobiologi uji kualitas produk kedelai utama diarahkan pada kehadiran Saccharomyces cerevisiae ragi (S. cerevisiae), S. Bailli, S. rouxii dan kontaminan bakteri seperti Bacillus dan Deinococcus. Jenis ragi dan bakteri yang terlibat dalam proses dan dapat menjadi salah satu parameter kualitas penting dalam persiapan yang dihasilkan. Jumlah dan viabilitas bakteri dan ragi menjadi parameter utama dalam proses persiapan bahan uji. Jumlah tersebut adalah jumlah minimum yang berlaku dapat dianalisis. Jumlah ini harus dibawah 10 CFU diperlukan untuk menunjukkan tingkat hygienitas proses dan tingkat minimal kontaminasi. Viabilitas bakteri dan bahan tes ragi persiapan untuk tes kemahiran kecap yang diawetkan dengan L-pengeringan adalah teknik Deinococcus radiodurans (D. radiodurans) 16 tahun, 58 tahun S. cerevisiae,
dan S. roxii 13 tahun.
kata kunci: Viabilitas, Deinococcus, khamir, L-pengeringan, Proficiency
Abstract
Proficiency test is one of the important activities in quality control and quality assurance microbiology laboratory for measuring the competence of analysts and analysis Proficiency test requires a model microorganism preparations are standardized quality and validity. Microbiological test of the quality of the main soy products aimed at the presence of yeast Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae), S. bailli, S. rouxii and bacterial contaminants such as Bacillus and Deinococcus. Types of yeasts and bacteria involved in the process and can be one of the important quality parameters in the preparation produced. The number and viability of bacteria and yeasts become the main parameters in the process of test preparation materials. The amount in question is the minimum number that is valid can be analyzed. This amount must be below 10 CFU required to indicate the level of hygienitas process and the minimum level of contamination. Viability of bacteria and yeast test preparation materials for proficiency test of soy sauce that preserved by L-drying technique is Deinococcus radiodurans ( D. radiodurans ) 16 years, 58 years S. cerevisiae, and S. roxii 13 years.
key words : Viability, Deinococcus, Khamir, L-drying, Proficiency
1. PENDAHULUAN 1.1. Latar belakang
Uji profisiensi merupakan komponen penting untuk laboratorium yang ingin menjadi terakreditasi ke Organisasi Internasional untuk Standarisasi (ISO) 17025 manajemen laboratorium standar, yang menyediakan dasar akreditasi laboratorium di lebih dari 40 negara, atau jaminan mutu laboratorium diakui standar semua yang mengharuskan program uji profisiensi adalah tempat untuk kinerja laboratorium pemeriksaan aktual dari sebuah proses1), dan dalam pelaksanaan
uji profisiensi mikrobiologi perlu disiapkan petunjuk teknik dari mulai preparasi sampel sampai proses penghitungan viabilitas dan ketepatan analisis daya terima (outlayering)
2).
Masalah utama dalam uji profisiensi mikrobiologi, yaitu menyediakan sampel uji dengan jumlah mikrobiologi yang rendah (<10CFU) dan viabilitasnya harus tetap konstan dalam waktu yang lama sehingga tidak menghambat dalam proses pengiriman sampel, jika lokasi peserta uji profisiensi jauh dari pusat pembuatan sampel uji profisiensi
3).
Sampel uji yang akan digunakan dalam uji profisiensi mikrobiologi, yaitu berupa ampul yang berisi media preservatif, dalam hal ini digunakan material kecap dan mikroba uji dengan menggunakan metode preservasi liquid drying (L-drying).
Pada L-drying, proses pengeringan dilakukan melalui proses evaporasi, sampel dibuat hampa udara dan dikeringkan dari fase cair tanpa melalui proses pembekuan terlebih dahulu 4,5).
L-drying merupakan salah satu teknik dalam penyimpanan atau pengawetan mikroba. Teknik penyimpanan atau pengawetan mikroba memerlukan penelitian yang rumit, jangka waktu lama, dan pemantauan, serta dana yang besar. Hal ini berkaitan dengan tujuan utama preservasi,
laju metabolisme dari mikroorganisme hingga sekecil mungkin dengan tetap mempertahankan viabilitas (daya hidupnya) dan (2) memelihara sebaik mungkin biakan, sehingga diperoleh angka perolehan (recovery) dan kehidupan (survival) yang tinggi dengan perubahan ciri-ciri yang minimum6).
Metode penyimpanan jangka panjang yang paling efektif dan banyak dilakukan ialah metode liofilisasi atau kering beku (liophylization atau freeze drying)7) dan
kriopreservasi (cryopreservation atau cryogenic preservation)8,9). Kedua teknik
tersebut dilaporkan paling berhasil untuk penyimpanan jangka panjang berbagai mikroba. Kendala utamanya adalah tidak semua laboratorium mempunyai peralatan tersebut.
Hal yang perlu diperhatikan adalah cairan pengawet (preservatif) yang akan digunakan untuk pembuatan suspensi sel untuk mencegah kerusakan sel hidup pada tahap pembekuan dan pengeringan. Fungsi preservatif adalah menstabilkan protein, mencegah kerusakan akibat pembekuan, dan melindungi dari kekeringan yang berlebihan. Pemilihan preservatif tergantung pada mikroba yang akan disimpan. Senyawa preservatif harus dapat memelihara mikroba dalam kondisi hidup dan memberi peluang untuk dapat ditumbuhkan kembali dengan baik dari kondisi kering. Salah satu preservatif terbaik dan telah digunakan untuk penyimpanan jangka panjang mikroba adalah mist dessicants10) yang merupakan
cairan dengan komposisi pepton Difco 12 g dan glukosa 30 g dalam 100 ml akuades. Beberapa cairan preservatif lain yang sering digunakan ialah larutan pepton 1%, larutan susu skim 1%, larutan Naglutamat 1%, dan larutan campuran serum kuda dengan pepton 10%10).
Media preservatif yang digunakan dalam penelitian ini, yaitu kecap karena sampel ampul akan digunakan untuk uji profisiensi mikrobiologi pada produksi kecap.
digunakan untuk media preservatif mikroba dengan menggunakan teknik L-drying.
Penelitian ini bertujuan untuk membuat sediaan preservasi D. radiodurans, S. cerevisiae, dan S. roxii dalam jumlah 10 CFU dalam material kecap yang terjamin viabilitasnya dalam waktu yang lama (long therm preservation) untuk uji profisiensi pemeriksaan di laboratorium.
2. BAHAN DAN METODE 2.1. Mikroorganisme uji.
D. radiodurans, S. cerevisiae, dan S. roxii yang merupakan koleksi laboratorium genetika, bidang mikrobiologi, pusat penelitian Biologi, LIPI, Cibinong, Bogor, Indonesia.
2.2. Persiapan mikroorganisme uji. D. radiodurans ditumbuhkan pada media heterotrof padat yang terdiri dari agar 15g/L, Tripton 18g/L, NaCl 5g/L, K2HPO4 2.5g/L, dan diinkubasi pada suhu 30°C, selama 5 hari. S. cerevisiae dan S. roxii ditumbuhkan pada media yeast mannitol (YM) dan diinkubasi pada suhu 30°C selama 48 jam.
2.3. Media preservasi .
Material kecap yang akan digunakan sebagai media preservasi disterilisasi dengan 2 cara yakni autoklaf dan di UV dengan panjang gelombang 365 nm selama 5 menit terlebih dahulu untuk menghilangkan kontaminan mikroba yang ada dalam kecap tersebut.
2.4.Preservasi L-drying untuk uji profisiensi.
Medium preservasi menggunakan 100µL kecap yang sudah diotoklaf
dimasukkan kedalam tabung ampul berukuran 1mL dan ditambahkan ke masing-masing ampul Deinococcus radiodurans 105CFU, Saccharomyces cerevisiae 105CFU,
dan Saccharomyces roxii 106CFU sehingga
hasil yang diinginkan untuk digunakan dalam uji profisiensi masing-masing mikroba 10 CFU. Preservasi sampel mikroba dalam tabung ampul menggunakan teknik L-drying (T= -48°C, vaccum gauge= 0.0 pa) selama ± 3 jam sampai tercapai kondisi vakum. Setelah sampel kecap kering dan vakum kemudian ampul ditutup (sealing) dengan pemanas api yang melelehkan leher tabung kaca ampul. Konfirmasi keadaan vakum pada tabung ampul yang sudah ditutup dilakukan dengan penembakan aliran listrik dengan menggunakan alat Spark Tester. Tabung ampul yang berisi sampel akan berwarna biru apabila kondisi didalam tabung ampul tersebut vakum.
2.5. Analisis statistik.
Kestabilan jumlah sel mikroba untuk uji profisiensi menggunakan analisis varian satu variable independent (one-way anova). 2.6. Accelerated Storage Test.
Tes ini dilakukan dengan menggunakan 10 tabung ampul L-drying pada masing-masing mikroba, 3 tabung ampul dibuka seketika setelah L-drying untuk enumerasi viabilitas mikroba seketika, 3 ampul disimpan pada suhu 37°C selama 2 minggu utuk enumerasi viabilitas mikroba 2 minggu, dan sisa ampul disimpan di suhu 4°C. Enumerasi viabilitas Deinococcus radiodurans menggunakan media heterotrof dan diinkubasi pada suhu 30°C, Saccharomyces cerevisiae dan Saccharomyces roxii menggunakan media YM diinkubasi pada suhu 30°C, teknik yang digunakan dalam enumerasi viabilitas mikroba yaitu dengan teknik pengenceran total plate count (TPC).
3. HASIL DAN PEMBAHASAN
Pada Gambar 1. Terlihat bahwa material kecap yang akan digunakan sebagai medium preservasi setelah di UV menunjukkan adanya kontaminasi bakteri gram positif Bacillus dan bakteri Deinococcus yang bersifat resisten11). Hal
ini memberikan indikasi perlunya sterilisasi dengan autoklaf karena disinfeksi dengan penyinaran UV tidak dapat membunuh kedua bakteri tersebut. Hal ini dikonfirmasi dengan hasil eksperimen yakni dengan sterilisasi penyinaran UV pada sampel kecap untuk sediaan profisiensi dimana tetap teramati adanya pertumbuhan bakteri kontaminan terutama Bacillus setelah proses preservasi L drying, namun tidak ada pertumbuhan kontaminan setelah proses sterilisasi dengan autoklaf.
Jenis bakteri Bacillus spp. yang tumbuh diidentifikasi, ternyata terdapat 5 jenis Bacillus yang teridentifikasi adalah B. cereus, B. megaterium, B. licheniformis, B. substilis dan B. stearotermophilus.
Uji profisiensi mikrobiologi memerlukan sampel yang tetap jumlah sel mikrobanya
12), tapi kenyataanya cukup sulit untuk
mendapatkan jumlah sel yang konstan sehingga dilakukan teknik pengawetan L-drying untuk mendapatkan sampel uji yang konstan pada saat akan dilakukan uji profisiensi. Sampel uji yang digunakan dalam penelitian ini menggunakan metode L-drying dengan medium preservatif kecap.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa jumlah sel mikroba mengalami perubahan pada saat sebelum L-drying, setelah L-drying, dan 2 minggu setelah L-drying (Gambar , namun setelah dilakukan analisa statistiknya dengan menggunakan analisis varian satu variable independent (one-way anova) bahwa masing-masing mikroba tidak mengalami perubahan yang signifikan (tabel 1.)
Tabel Post Hoc Test menunjukkan bahwa perbedaan rata-rata nilai test tidak
yang akan digunakan sebagai sampel uji profisiensi. Hal ini dapat terlihat dengan tidak adanya tanda asterik (*) pada rata-rata nilai test untuk semua perlakuan 13)
Gambar 1. Material kecap sebagai media preservasi yang di autoclave (panel kiri). Material kecap yang di UV selama 5 menit (panel kanan)
Gambar 2.Jumlah koloni S. cerevisiae sebagai bahan sediaan uji profisiensi yang tumbuh setelah proses preservasi L drying. Dari ketiga isolat di atas viabilitas mikroba yang dipreservasi dengan teknik L-drying dapat diukur dengan melakukan Accelerated Storage Test. Waktu simpan sampai semua bakteri tidak dapat diamati lagi yang dihitung berdasarkan :
T = 8 log So
(log So – log Sac),
dimana So = jumlah sel bakteri segera setelah L-drying
Sac = jumlah sel bakteri setelah penyimpanan selama 2 minggu pada suhu 37°C 14).
Post Hoc Tests
Multiple Comparisons LSD
Dependent
Variable (I) Perlakuan (J) Perlakuan
Mean Difference (I-J) Std. Error Sig. 95% Confidence Interval Lower Bound Upper Bound D. radiodurans Sebelum L-drying Setelah L-drying -1.00000 1.98139 .632 -5.8483 3.8483 2 Minggu Setelah L-drying .33333 1.98139 .872 -4.5150 5.1816 Setelah L-drying Sebelum L-drying 1.00000 1.98139 .632 -3.8483 5.8483 2 Minggu Setelah L-drying 1.33333 1.98139 .526 -3.5150 6.1816 2 Minggu Setelah L-drying Sebelum L-drying -.33333 1.98139 .872 -5.1816 4.5150 Setelah L-drying -1.33333 1.98139 .526 -6.1816 3.5150 S. cerevisiae Sebelum L-drying Setelah L-drying 2.33333 2.96898 .462 -4.9315 9.5982 2 Minggu Setelah L-drying 1.66667 2.96898 .595 -5.5982 8.9315 Setelah L-drying Sebelum L-drying -2.33333 2.96898 .462 -9.5982 4.9315 2 Minggu Setelah L-drying -.66667 2.96898 .830 -7.9315 6.5982 2 Minggu Setelah L-drying Sebelum L-drying -1.66667 2.96898 .595 -8.9315 5.5982 Setelah L-drying .66667 2.96898 .830 -6.5982 7.9315 S. roxii Sebelum L-drying Setelah L-drying -1.00000 2.16025 .660 -6.2859 4.2859 2 Minggu Setelah L-drying 1.00000 2.16025 .660 -4.2859 6.2859 Setelah L-drying Sebelum L-drying 1.00000 2.16025 .660 -4.2859 6.2859 2 Minggu Setelah L-drying 2.00000 2.16025 .390 -3.2859 7.2859 2 Minggu Setelah L-drying Sebelum L-drying -1.00000 2.16025 .660 -6.2859 4.2859 Setelah L-drying -2.00000 2.16025 .390 -7.2859 3.2859
Tabel 1. Kestabilan mikroba pada saat sebelum L-drying, setelah L-drying, dan 2 minggu setelah L-drying.
*. The mean difference is significant at the 0.05 level (τ=0.05)
atau daya viabilitas pertumbuhan koloni yang tumbuh pada penentuan masa simpan bahan uji profisiensi menunjukkan bahwa viabilitas sediaan uji profisiensi dalam material kecap dapat bertahan dalam waktu yang lama yakni 58 tahun untuk isolat S.
cerevisiae dan S. roxii hanya bertahan sampai 13 tahun (tabel 2.). Kematian sel mikroba dapat diprediksi dengan perhitungan diatas, dimana kematian sel mikroba adalah ketidakmampuan sel mikroba untuk tumbuh koloni mikroba pada medianya15).
4. KESIMPULAN
Model bakteri D. radiodurans dan khamir S. cerevisiae serta S. roxii dalam jumlah minimum (10 sel/ml) dapat dipreservasi dalam material kecap dengan teknik L-drying. Hasil penentuan viabilitas preservasinya menunjang penggunaanya sebagai materi uji profisiensi seperti untuk kualitas produk dalam hal higienis dan daya simpan. Viabilitas dalam material kecap dengan teknik L-drying D. radiodurans 16 tahun, S. cerevisiae 58 tahun, dan S. roxii 13 tahun.
DAFTAR PUSTAKA
1. Lawrence, J. 2006. Proficiency Testing: A Laboratory Guide to Confirming Results. www.foodsafetymagazine. com.
2. McBride G.B., J.L. McWhirter, M.H.Dalgety. 2003. Uncertainty in most probable number calculation for microbiological assays. J. AOAC Int. 2003. Sep-Oct:86(5):1048-8.
3. Chen Min. 1990. Simple Medium That Preserves Low Concentrations of Escherichia coli for Use in the Water Bacteriology Proficiency Test. Applied and Enviromental Microbiology, Jan. 1990, p. 146-149
4. Malik, K.A. 1991. Maintenance of microorganisms by simple methods. In: Kirshop, B.E. and A. Doyle (eds.). Maintenance of Microorganisms and
Methods. 2nd ed. London:Academic Press.
5. Mikata, K. 1999. Preservation of yeast culture by L-drying: Viability after 15 years storage at 5º C. IFO Research Communications. 19: 71--82.
6. Machmud, M. 2001. Teknik penyimpanan dan pemeliharaan mikroba. Buletin Agrobio 4(1):24-32.
7. Flink, J.M. and H. Knudsen. 1983. An introduction to freeze drying. Denmark: Strandberg Bogtryk Offset.
8. Clark, W.A. 1976. Selected bibliography of literature on preservation of microorganisms, blood, tissues, and vaccines with emphasis on freezing and freeze-drying (1968-1976). US Department of Health Education and Welfare, Center for Disease Control, Atlanta.
9. Ashwood-Smith, M.J. and J. Farrant. 1980. Low temperature preservation in medicine and biology. Tunbridge Wells, UK Pitman.
10. Sly, L.I. 1983. Preservation of microbial culture. In Fahy, P.C. and G.J. Persley (Eds.). Plant Bacterial Diseases. A Diagnostic Guide. Academic Press. Sidney. p. 275-298
11. Gerhardt, P., R.G.E. Murray, W.A. Wood, N. R. Krieg. 1994. Methods for General and Molecular Bacteriology. ASM Press, Washington, D. C.
12. Brodsky, M.H., B.W.Ciebin, B.W., and D.A.Schiemann. 1978. Simple Bacterial Preservation Medium and
Sampel Uji Sebelum
L-drying (CFU/ mL) Segera setelah L-drying (CFU/ mL) 2 minggu setelah L-drying(CFU/ mL) Viabilitas (tahun) D. radiodurans 3 4 8 16 S. cerevisiae 10 5 4 58 S. roxii 3 6 2 13
Tabel 2. Rata-rata viabilitas khamir dan bakteri uji untuk sediaan bahan uji profisiensi dalam material kecap dengan teknik L-drying.
in Water Bacteriology. Applied and Environmental Microbiology, Vol. 35, No. 3, p. 487-491.
13. Trihendradi, C. 2005. Step by Step SPSS 13 Analisis Data Statistik: p. 155. 14. Sakane, T. and K. Kuroshima.
1997. Viabilities of dried cultures of various bacteria after preservation for over 20 years and their prediction
by the accelerated strorage test. Microbiological Culture Collection. 1--7. 15. Berney, M., F. Hammes, F.Bosshard,
H.U.Weilenmann, T. Egli, T. 2007. Assessment and Interpretation of Bacterial Viability by Using the LIVE/ DEAD BacLight Kit in Combination with Flow Cytometry . Applied and Environmental Microbiology, Vol. 73, No. 10, p. 3283–3290.
