Bab III
Metodologi Penelitian
III.1 AlatPeralatan yang digunakan untuk melaksanakan penelitian ini adalah komputer klaster (BIOCLUST, KANAZAWA1, KANAZAWA2, GOLDEN) yang terdiri dari beberapa unit komputer yang terhubung satu sama lain melalui sistem jaringan, sehingga komputasi yang dijalankan pada sistem ini dapat berlangsung secara paralel.
Perangkat lunak yang digunakan untuk proses simulasi adalah AMBER (Assisted Model Building and Energy Refinement) versi 9.0 (Case dkk., 2005) dan versi 10.0 (Case dkk., 2008) dan NAMD (Not just Another Molecular Dynamic) versi 2.6 (Philips dkk., 2005). Sedangkan analisis hasil simulasi sebagian besar dilakukan dengan menggunakan program VMD (Visual Molecular Dynamics) versi 1.8.6 (Humphrey dkk., 1996). Perhitungan potensial elektrostatik dilakukan dengan perangkat lunak APBS (Adaptive Poisson-Boltzmann Solver).
III.2 Metode
III.2.1 Model 3 Dimensi Protein dan Parameterisasi
Penelitian ini menggunakan 3 model struktur enzim Klenow-like DNA Pol I yang berasal dari 3 kelompok mikroorganisme, yaitu KF DNA Pol I dari mikroorganisme mesofilik E.coli, Klenow-like DNA Pol I ITB-1 dari mikroorganisme termofilik G.thermoleovorans dan Klentaq dari mikroorganisme termofilik T.aquaticus.
Struktur 3 dimensi dari Klenow Fragment (KF) diperoleh dari PDB (kode PDB 1KFD) (Beese dkk.,1993). Preparasi model molekul KF yang akan disimulasikan dilakukan dengan menghilangkan dNTP dan PPi dari kompleks enzim dengan menggunakan program VMD 1.8.6.
Struktur 3 dimensi dari Klenow-like DNA Pol I ITB-1 (Akhmaloka dkk., 2007) diperoleh dengan melakukan pemodelan homologi menggunakan program Predict Protein (Rost dkk., 2004) dan SWISS MODEL WORKSPACE yang disediakan oleh SwissProt (Schwede dkk., 2003). Komparasi pemodelan dilakukan melalui tiga tahapan utama meliputi pensejajaran urutan asam amino, prediksi struktur 3D dan validasi/evaluasi struktur yang diperoleh. Cetakan (template) yang digunakan untuk pemodelan adalah struktur kristal BF yang berasal dari B.stearothermophilus (kode PDB 1XWL).
Adapun struktur 3 dimensi dari Klentaq didapatkan dari PDB (kode PDB 1QSS) (Li dkk.,1998). Seperti halnya dengan KF, penyiapan model molekul Klentaq yang akan disimulasi dilakukan dengan menggunakan program VMD 1.8.6. untuk menghilangkan dNTP yang terdapat pada kompleks enzim.
III.2.2 Solvasi
Dalam penelitian ini dilakukan tiga jenis solvasi untuk keperluan simulasi yang beragam. Untuk perhitungan simulasi menggunakan perangkat lunak AMBER, dilakukan 2 macam solvasi yaitu secara implisit dan secara eksplisit. Sedangkan perhitungan simulasi dengan menggunakan perangkat lunak NAMD hanya dilakukan solvasi secara eksplisit saja.
III.2.2.1 Solvasi secara implisit
Model molekul yang telah disiapkan kemudian dihilangkan atom-atom hidrogennya menggunakan program VMD 1.8.6.
set sel [atomselect top ”protein and not hydrogen”] $sel writepdb ProtnonH.pdb
Model molekul tersebut kemudian di protonasi dengan menggunakan program protonate yang terdapat pada perangkat lunak AMBER.
Selanjutnya dilakukan solvasi secara implisit menggunakan program tleap yang terdapat pada perangkat lunak AMBER. Parameter yang mengkarakterisasi berbagai tipe interaksi di dalam molekul model tersebut dibuat berdasarkan parameter force field ff03 (Duan dkk., 2003).
tleap –s –f leaprcff03.
PROT = loadpdb Protein.protonate.pdb set default PBradii mbondi2
saveAmberParm PROT PROT-implicit.top PROT-implicit.crd quit
III.2.2.2 Solvasi secara eksplisit menggunakan perangkat lunak AMBER
Model protein yang telah disiapkan kemudian dihilangkan atom-atom hidrogennya, setelah itu di protonasi menggunakan fasilitas protonate. Proses solvasi dilakukan dengan menggunakan program tleap yang terdapat pada perangkat lunak AMBER. Parameter force field ff03 (Duan dkk., 2003) digunakan untuk mengkarakterisasi berbagai tipe interaksi di dalam molekul model tersebut. TIP3P (Jorgensen dkk., 1983) dipilih sebagai molekul pelarut model protein.
tleap –s –f leaprc.ff03
PROT = loadpdb Protein.protonate.pdb charge PROT -11.00
addIons Na+ 0
solvateBox PROT TIP3PBOX 15.0 1.0
saveAmberParm PROT PROT_box3.top PROT_box3.crd
III.2.2.3 Solvasi secara eksplisit menggunakan perangkat lunak NAMD
Parameter yang digunakan untuk mengkarakterisasi berbagai tipe interaksi di dalam molekul model tersebut dibuat berdasarkan parameter force field CHARMM22 (Brooks dkk., 1983). Solvasi model molekul protein dilakukan dengan memanfaatkan plug-in solvate yang terdapat pada VMD 1.8.6, menggunakan TIP3P sebagai molekul pelarut. Dimensi kotak yang digunakan untuk proses solvasi sebesar 50 Å x 50 Å x 50 Å.
III.2.3 Kondisi Simulasi
Keseluruhan simulasi menggunakan parameter integrasi waktu (timestep) setiap 2 femto detik (fs).
Parameter simulasi model molekul dengan sistem pelarut implisit (igb = 5) hanya dilakukan menggunakan perangkat lunak AMBER versi 9.0. Perhitungan energi potensial termasuk energi van der Waals dilakukan hingga jarak 16 Å (cutoff). Parameter mbondi2 radii dan parameter yang mengatur jarak maksimum di antara pasangan atom (rgbmax) di set sebesar 16 Å untuk mengefektifkan perhitungan jari-jari Born (Born radius). Karena model molekul protein bermuatan negatif, maka garam NaCl 0.5 M ditambahkan ke dalam sistem.
Sedangkan parameter simulasi model molekul dengan sistem pelarut eksplisit dilakukan menggunakan perangkat lunak AMBER versi 10.0 dan NAMD versi 2.6. Simulasi dilakukan dengan menggunakan metode PBC untuk menghilangkan efek tegangan permukaan dan untuk mencapai kondisi dengan kerapatan dan tekanan yang lebih seragam (Allen dan Tildesley, 1989). Energi elektrostatik sistem dihitung secara menyeluruh menggunakan metode particle mesh Ewald (PME) (Darden dkk., 1993; Essmann dkk., 1995). Algoritma SHAKE (Ryckaert dkk., 1977) dengan toleransi 10-5 diterapkan ke dalam sistem untuk mengekang seluruh ikatan yang mengandung atom hidrogen. Adapun kondisi khusus yang dilakukan untuk simulasi dengan perangkat lunak AMBER versi 10.0 yaitu penggunaan cutoff sebesar 12 Å untuk perhitungan potensial Lennard-Jones. Sedangkan parameter tertentu yang digunakan untuk simulasi dengan menggunakan perangkat lunak NAMD versi 2.6 adalah perhitungan energi potensial termasuk energi van der Waals dilakukan hingga jarak 6 Å dan mencapai nilai nol pada jarak 8 Å.
III.2.4 Minimisasi
Molekul yang telah disolvasi kemudian diminimisasi untuk menghindari kontak van der Waals yang tidak sesuai (bad contact) dan untuk meminimalkan efek-efek sterik yang berenergi tinggi.
Untuk menghindari perubahan struktur yang terlalu besar, proses minimisasi molekul protein dengan sistem pelarut implisit dilakukan dalam dua tahap. Tahap minimisasi pertama dilakukan sebanyak 5000 tahap dengan mengkombinasikan metode steepest descent (SD) sebanyak 500 tahap dilanjutkan dengan metode conjugate gradient (CG). Pada tahap ini posisi atom-atom tulang punggung dikekang sehingga tidak bebas bergerak dan minimisasi terbatas pada rantai samping saja. Tahap minimisasi kedua dilakukan sebanyak 1000 tahap, dengan mengkombinasikan kedua metode di atas, tetapi pada tahap ini atom-atom tulang punggung dibebaskan dari kekangan sehingga seluruh bagian akan terminimisasi.
Minimisasi 1 &cntrl
imin = 1, maxcyc = 5000, ncyc = 500, ntmin = 1, cut = 16.0,
ntpr = 50, ntb = 0,
igb = 5, saltcon = 0.5, rgbmax = 16.0, ntr = 1,
restraint_wt = nilai kekangan, restraintmask =':nomer residu',
Minimisasi 2 &cntrl
imin = 1, maxcyc = 1000, ncyc = 200, ntmin = 1, cut = 16.0,
ntpr = 50, ntb = 0,
igb = 5, saltcon = 0.5, rgbmax = 16
Sedangkan proses minimisasi molekul protein dengan sistem pelarut eksplisit dilakukan dalam beberapa tahap. Minimisasi tahap pertama dilakukan sebanyak 10000 tahap dengan mengkombinasikan metode SD sebanyak 5000 tahap dilanjutkan dengan metode CG. Pada minimisasi tahap pertama ini, posisi atom-atom tulang punggung dikekang sehingga tidak bebas bergerak dengan besar
kekangan 50 kkal/mol.Ǻ2, sehingga minimisasi terbatas pada rantai samping saja. Kemudian dilakukan pemanasan sistem secara bertahap hingga mencapai temperatur tertentu. Selanjutnya dilakukan proses minimisasi berikutnya sebanyak 10 x 5000 tahap. Setiap tahap minimisasi dilakukan penurunan nilai kekangan terhadap tulang punggung sebesar 5 kkal/mol.Ǻ2 dengan menggunakan metode SD. Pada tahap minimisasi terakhir, atom-atom tulang punggung dibebaskan dari kekangan sehingga seluruh bagian akan terminimisasi.
Minimisasi 1 &cntrl ntx = 1, irest = 0, ntrx = 1, ntxo = 1, ntpr = 500, ntwx = 0, ntwv = 0, ntwe = 0, ntf = 1, ntb = 1, cut = 12.0, nsnb = 10, ibelly = 0, ntr = 1, imin = 1,
maxcyc = 10000, ncyc = 5000, ntmin = 1, dx0 = 0.1, dxm = 0.5, drms = 0.0001, ntc = 1, tol = 0.00005, &end Constraints 50.0 RES 1 580 END
Minimisasi dengan penurunan nilai kekakangan &cntrl
ntx = 1, irest = 0, ntrx = 1, ntxo = 1, ntpr = 100, ntwx = 0, ntwv = 0, ntwe = 0, ntf = 1, ntb = 1, ibelly = 0, ntr = 1,
cut = 12.0, nsnb = 10, imin = 1, maxcyc = 5000, ntmin = 2, dx0 = 0.1, dxm = 0.5, drms = 0.0001, ntc = 1, tol = 0.00005, &end Constraints 45.0 RES 1 580 END
III.2.5 Pemanasan dan Ekulibrasi
Model molekul protein dengan sistem solvasi implisit dan telah mengalami proses minimisasi dipanaskan dari 0 K hingga hingga 300 K secara bertahap dengan kenaikan setiap 50 K selama masing-masing 5 pikodetik (ps). Nilai parameter temperature referensi (TEMP0) diatur sama dengan temperatur yang diinginkan dan konstanta koefisien Berendsen (tautp) bernilai 0.2 ps. Untuk menghindari perubahan struktur yang drastis selama proses pemanasan, maka semua residu asam amino penyusun protein dikekang dengan menggunakan gaya harmonis dengan tetapan gaya sebesar 10 kkal/mol.Ǻ2. Setelah mencapai 300 K, temperatur dipertahankan dengan menggunakan termostat dengan menetapkan tetapan koefisien Berendsen sebesar 0.5 ps selama 65 ps. Setelah sistem stabil pada temperatur 300 K, kemudian sistem diekulibrasi selama 20 ps pada temperatur yang sama dengan menurunkan tetapan gaya kekang menjadi 1 kkal/mol.Ǻ2. Selanjutnya sistem direlaksasi selama 2 ps pada temperatur yang sama dengan melepas gaya harmonis yang mengekang gerakan atom-atom protein. Pada proses ekulibrasi dan relaksasi, fluktuasi nilai-nilai variabel energi dan temperatur sistem diamati untuk menentukan kondisi setimbang sistem. Sistem dikatakan telah mencapai kondisi setimbang pada saat nilai-nilai variabel energi dan temperatur berfluktuasi disekitar nilai tertentu (konvergen). Simulasi pada temperatur di atas 300 K, dilakukan dengan memanaskan sistem secara bertahap hingga mencapai temperatur yang diinginkan. Sistem kemudian diekulibrasi dan direlaksasi pada temperatur tersebut dengan menggunakan parameter yang sama seperti pada 300 K.
Pemanasan sistem &cntrl
imin = 0, nmropt = 1, ntx = 1, irest = 0,
ntpr = 50, ntwr = 500, ntwx = 500, ntwv = 500, ntwe = 500,
ntf = 2, ntb = 0, cut = 16,igb = 5, rgbmax = 16, saltcon = 0.5, nstlim = 50000, t = 0.0, dt = 0.002,
tempi = 0, ntp = 0, ntc = 2, ntr = 1,
restraint_wt = nilai kekangan, restraintmask =':nomer residu' /
&wt type='TEMP0',istep1=0,istep2=2500,value1=10.0,value2=50.0,/ &wt type='TEMP0',istep1=2501,istep2=5000,value1=50.0,value2=100.0,/
&wt type='TEMP0',istep1=5001,istep2=7500,value1=100.0,value2=150.0,/ &wt type='TEMP0',istep1=7501,istep2=10000,value1=150.0,value2=200.0,/ &wt type='TEMP0',istep1=10001,istep2=12500,value1=200.0,value2=250.0,/ &wt type='TEMP0',istep1=12501,istep2=15000,value1=250.0,value2=300.0,/ &wt type='TEMP0',istep1=15001,istep2=50000,value1=300.0,value2=300.0,/ &wt type='TAUTP',istep1=0,istep2=15000,value1=0.2,value2=0.2,/ &wt type='TAUTP',istep1=15001,istep2=50000,value1=0.5,value2=0.5,/ &wt type='END'/ LISOUT=POUT DISANG=RST.f Ekuilibrasi 1 &cntrl imin = 0, nstlim = 10000, dt = 0.002, ntx = 5, irest = 1, ntpr = 10, ntwr = 500, ntwx = 500, ntwv = 500, ntwe = 500, ntf = 2, ntb =0 , cut = 16.0,
igb = 5, rgbmax = 16, saltcon = 0.5,
temp0 = 300, tempi = 300, tautp = 0.5, ntc = 2, ntr = 1,
restraint_wt = nilai kekangan, restraintmask =':nomer residu',
Ekuilibrasi 2 &cntrl imin = 0, nstlim = 1000, dt = 0.002, ntx = 5, irest = 1, ntc = 2, ntpr = 10, ntwr = 500, ntwx = 500, ntwv = 500, ntwe = 500, ntf = 2, ntb = 0, cut = 16.0,
igb = 5, rgbmax = 16, saltcon = 0.5, temp0 = 300, tempi = 300, tautp = 0.5
Proses pemanasan model molekul protein yang telah diminimisasi dengan sistem solvasi eksplisit menggunakan perangkat lunak AMBER berlangsung secara bertahap hingga mencapai temperatur 300 K dengan kenaikan setiap 5 K selama masing-masing 10 pikodetik (ps). Nilai parameter temperatur referensi (TEMP0) diatur sama dengan temperatur yang diinginkan dan konstanta koefisien Berendsen (tautp) bernilai 2.0 ps. Untuk menghindari perubahan struktur yang drastis selama proses pemanasan, maka semua residu asam amino penyusun
sebesar 50 kkal/mol.Ǻ2. Selanjutnya dilakukan proses minimisasi dengan penurunan nilai kekangan sebesar 5 kkal/mol.Ǻ2 untuk setiap tahapnya. Sistem kemudian diekulibrasi selama 50 ps dengan kondisi ansambel NPT. Selanjutnya dilakukan ekulibrasi dalam ansambel NVT selama 10 x 50 ps. Simulasi sistem pada temperatur di atas 300 K, dilakukan dengan memanaskan sistem secara bertahap hingga mencapai temperatur yang diinginkan. Kemudian dilakukan minimisasi dan ekulibrasi pada temperatur tersebut dengan menggunakan parameter yang sama seperti pada 300 K.
Pemanasan &cntrl
ntx = 1, irest = 0, ntrx = 1, ntxo = 1, ntf = 2, ntb = 2, ntpr = 5, ntwx = 0, ntwv = 0, ntwe = 0, ibelly = 0, ntr = 1, nstlim = 5000, t = 0.0, dt = 0.002, ntt = 1, tautp = 2.0, temp0 = 105.0, tempi = 100.0, ntp = 1, taup = 2.0, ntc= 2, tol = 0.00005, &end Constraints 50.0 RES 1 580 END Ekulibrasi NPT &cntrl ntx = 1, irest = 0, ntrx = 1, ntxo = 1, ntpr = 100, ntwx = 500, ntwv =500, ntwe = 500, ntf=2, ntb=2, nsnb=5, nstlim = 25000, cut = 12.0, dt = 0.002, temp0 = 300, tempi = 300, ntt = 1, tautp = 2.0, ntp = 1, taup = 2.0, ntc = 2, tol = 0.00005, &end Ekulibrasi NVT &cntrl ntx = 5, irest = 1, ntrx = 1, ntxo = 1, ntpr = 100, ntwx = 500, ntwv = 500, ntwe = 500, ntf = 2, ntb = 1, cut = 12.0, nsnb = 5, dt = 0.002, nstlim = 25000, temp0 = 300, tempi = 300,
ntt = 1, tautp = 2.0, vlimit = 20.0, ntp = 0, ntc = 2, tol = 0.00005, &end
Adapun proses pemanasan model molekul protein yang telah diminimisasi dengan sistem solvasi eksplisit menggunakan perangkat lunak NAMD dilakukan secara bertahap dari 0 K hingga 300 K dengan mengatur nilai parameter langevinTemp sama dengan temperatur yang diinginkan dan koefisien dinamik langevin bernilai 5 ps-1. paraTypeCharmm on exclude scaled1-4 1-4scaling 1.0 cutoff 8. switching on switchdist 6. pairlistdist 9.5 timestep 2.0 rigidBonds all nonbondedFreq 1 fullElectFrequency 2 stepspercycle 10 langevin on langevinDamping 5 langevinTemp $temperature langevinHydrogen off cellBasisVector1 100. 0. 0. cellBasisVector2 0. 100. 0. cellBasisVector3 0. 0 100. cellOrigin 0. 0. 0. wrapAll on PME yes PMEGridSizeX 128 PMEGridSizeY 128 PMEGridSizeZ 128 langevinPiston on langevinPistonTarget 1.01325 langevinPistonPeriod 100. langevinPistonDecay 50. langevinPistonTemp $temperature
III.2.6 Simulasi Dinamika Molekul
Setelah model molekul enzim terekuilibrasi dengan baik maka tahap produksi (Production Run) yaitu proses simulasi termal dengan sistem pelarut implisit maupun eksplisit pada berbagai temperatur dapat dilakukan. Untuk melihat secara visual semua pergerakan atom selama proses simulasi digunakan program VMD.
Proses Dinamika Molekul sistem pelarut implisit &cntrl
imin = 0, nstlim = 1000000, dt = 0.002, ntx = 5, irest = 1,
ntpr = 10, ntwr = 500, ntwx = 500, ntwv = 500, ntwe = 500, ntf = 2, ntb = 0, cut = 16.0,
igb = 5, rgbmax = 16, saltcon = 0.5, temp0 = 300, tempi = 300, tautp = 0.5, ntc = 2,ntr = 0,
Proses Dinamika Molekul sistem pelarut eksplisit &cntrl
ntx = 5, irest = 1, ntrx = 1, ntxo = 1,
ntpr = 100, ntwx = 100, ntwv = 500, ntwe = 500, ntf = 2, ntb = 2, cut = 12.0, nsnb = 5,
nstlim = 100000, dt = 0.002, temp0 = 300, tempi = 300, tautp = 2.0, ntp = 1, taup = 2.0,
ntc = 2, tol = 0.00005, &end
III.3 Analisis
Untuk mendapatkan gambaran dinamis enzim serta mengevaluasi proses simulasi yang telah dilakukan, sejumlah parameter dianalisis terhadap hasil simulasi meliputi RMSD, RMSF, SASA, analisis struktur sekunder, ikatan hidrogen, perhitungan potensial elektrostatik, DCCM dan PCA.
III.3.1 Root-mean-square deviation (RMSD)
Root-mean-square deviation (RMSD) adalah akar kuadrat rata-rata penyimpangan koordinat atom dari posisi referensi. RMSD merupakan ukuran perbedaan struktur protein selama proses simulasi terhadap struktur awal protein (Becker dkk., 2001; Coutsias dkk., 2004). Analisis ini difokuskan pada perubahan struktur atom C-α asam amino penyusun protein yang didefinisikan sebagai berikut :
1 2 1 2
( ( )
( ))
N atoms i i i atomsRMSD
r t
r t
N
==
∑
−
dengan N adalah jumlah total atom C-α yang terdapat pada protein sedangkan ri(t2) dan ri(t1) adalah koordinat atom C-α pada waktu t2 dan pada waktu t1. untuk
mendapatkan gambaran profil kestabilan sistem yang disimulasikan serta tahap-tahap transisi pada proses simulasi termal protein, maka hasil analisis RMSD tersebut akan di plot dalam bentuk grafik antara RMSD terhadap waktu simulasi.
III.3.2 Root-mean-square fluctuation (RMSF)
Root-mean-square fluctuation (RMSF) adalah akar kuadrat rata-rata fluktuasi koordinat atom terhadap struktur referensinya. RMSF merupakan analisis fleksibilitas residu asam amino penyusun protein yang dihitung berdasarkan persamaan berikut :
2
j j
RMSF =
R - R
dimana Rj merupakan koordinat residu j dan |Rj| merepresentasikan rata-rata
posisi residu j. Analisis ini digunakan untuk mendapatkan informasi mengenai residu asam amino yang bersifat fleksibel dan yang bersifat kaku selama proses simulasi berlangsung
III.3.3 Solvent Accessible Surface Area (SASA)
Richards, 1971). Nilai SASA memberikan gambaran terhadap struktur tersier protein. Pada umumnya, protein mengemas struktur tersiernya sedemikian rupa sehingga gugus-gugus yang bersifat hidrofob akan berada di bagian dalam sedangkan gugus-gugus asam amino yang bersifat hidrofil akan terdapat di bagian luar. Ketika proses simulasi termal berlangsung, kestabilan struktur tersier protein dan derajat keeksposuran dapat diamati dengan melakukan perhitungan SASA.
III.3.4 Analisis Struktur Sekunder (Secondary Structure Analysis)
Struktur sekunder protein tersusun atas interaksi lokal inter-residu yang pada umumnya dimediasi oleh ikatan hidrogen. Struktur sekunder yang paling umum adalah α-helix dan β-sheet. Analisis struktur sekunder dilakukan untuk melihat kestabilan struktur sekunder selama proses simulasi berlangsung yang dikarakterisasi dengan perubahan komposisi α-helix, β-sheet, turn dan coil. Perhitungan struktur sekunder dilakukan dengan menggunakan plug-in yang terdapat pada perangkat lunak VMD yang didasarkan atas algoritma STRIDE (Structural identification) (Frishman dan Argos, 1995). Sebuah α-helix dibentuk setidaknya melalui interaksi ikatan hidrogen antara residu k dengan k+4 (Gambar III.1) yang dinyatakan dengan persamaan berikut :
Gambar III.1 Pola dasar α-helix (digambarkan dalam bentuk batang) yang terbentuk akibat interaksi hidrogen (garis putih putus-putus) antara atom H yang terikat pada atom N (k+4) dengan residu karbonil (k) (Frishman dan Argos, 1995).
Gambar III.2 Pola dasar β-sheet (digambarkan dalam bentuk batang) yang melibatkan dua ikatan hidrogen (garis putih terputus-putus). (a) jembatan antiparalel tipe I; (b) jembatan antiparalel tipe II; (c) jembatan antiparalel tipe III; (d) jembatan antiparalel tipe III dengan tambahan ikatan hidrogen yang dibentuk oleh gugus NH bebas dan (e) jembatan paralel tipe IV (Frishman dan Argos, 1995).
Sebuah β-sheet didefinisikan setidaknya terbentuk dari 2 ikatan hidrogen membentuk jembatan-β (β-bridges) sebagaimana terlihat pada Gambar III.2. Kualitas jembatan-β ini ditentukan oleh kekuatan ikatan hidrogen maupun rata-rata propensitas residu tersebut untuk berada pada keadaan β-sheet. Persamaan umum β-sheet paralel dan antiparalel dapat dituliskan sebagai berikut :
III.3.5 Ikatan Hidrogen
Ikatan hidrogen merupakan gaya intermolekul yang terjadi antara atom yang memiliki keelektronegatifan tinggi dengan atom hidrogen yang terikat secara kovalen pada suatu atom elektronegatif. Energi ikatan hidrogen didefinisikan dengan mempertimbangkan jarak antara donor elektron dengan akseptornya kurang lebih 3 Å dan sudut yang dibentuk sekitar 20o (Stickle dkk., 1992) dan dituliskan sebagai berikut :
) ( cos ) ( cos ' ' m n LP D H D H A j D H i D H hb r B r A U − − − − − − × − = θ ω
Gambar III.3 Ilustrasi ikatan hidrogen yang dibentuk oleh atom akseptor (atom O), H dan donor (atom N) dengan sudut ω dan θ.
III.3.6 Perhitungan Potensial Elektrostatik
Perhitungan potensial elektrostatik dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak APBS (Baker dkk., 2001). Trajectori hasil simulasi yang akan di analisis dikonversi menjadi file PDB, kemudian file tersebut dikonversi menjadi file PQR menggunakan perangkat lunak PDB2PQR (Dolinsky dkk., 2004). Selanjutnya file
PQR tersebut dibuka di jendela VMD dengan memilih analisis APBS electrostatic. Keseluruhan atom penyusun protein digunakan untuk perhitungan ini. Konstanta terlarut dan pelarut diatur sebesar 1.0 dan 78.54. Ion monovalen dengan konsentrasi 0.15 M dan jari-jari ion exclusion sebesar 2.0 Å digunakan untuk kondisi batasan (boundary). Untuk mendeskripsikan batasan dielektrik antara terlarut dengan pelarut digunakan jari-jari probe sphere sebesar 1.4 Å.
III.3.7 Dynamic Cross Correlation Map (DCCM)
Dynamic Cross-Correlation (DCC) merupakan analisis untuk memberikan gambaran mengenai korelasi pergerakan antar residu asam amino penyusun protein. Korelasi pergerakan ini umumnya dijumpai untuk residu-residu yang saling bertetangga maupun residu di domain lain suatu protein. Koefisien korelasi silang (C(i.j)) ini didefinisikan melalui persamaan berikut :
(
i j)
(i,j) 2 2 i j∆r .∆r
C
=
∆r .
∆r
dimana i dan j merepresentasikan suatu atom Cα dan ∆r merupakan perpindahan atom dari posisi rata-ratanya dan 〈〉 merepresentasikan rata-rata waktu dari keseluruhan trajektori. Visualiasi C(i.j) dalam gambar tiga dimensi disebut sebagai
dynamical cross-correlation map (DCCM) yang dapat digunakan untuk mengidentifikasi pergerakan daerah/residu pada protein. C(i.j) bernilai positif
mengindikasikan bahwa residu i and j bergerak secara korelasi (bergerak dalam arah yang sama) sedangkan negatif C(i.j) mengindikasikan bahwa residu tersebut
bergerak secara anti-korelasi (residu tersebut bergerak dalam arah yang berlawanan).
III.3.8 Principal Component Analysis (PCA)
Principal component analysis (PCA) digunakan untuk mengekstraksi pergerakan/mode yang paling dominan dari suatu protein berdasarkan data
trajektori dihilangkan dengan cara menerjemahkan pusat rata-rata geometri molekul dan melakukan superposisi kepada struktur referensi melalui analisis least squares. Konfigurasi ruang dikonstruksi menggunakan transformasi linier dalam koordinat Cartesian sehingga dihasilkan matriks kovarian 3N x 3N. Diagonalisasi matriks tersebut akan menghasilkan suatu seri eigenvector yang memberikan nilai dan juga arah vektor untuk setiap pergerakan komponen/residu.
