ANALISIS ESCHERICHIA COLI PATOGEN PADA PANGAN
A. ANALISIS E. COLI PATOGEN SECARA BIOKIMIA
Metode konvensional untuk mendeteksi mikroba dalam pangan seringkali dilakukan proses pengkayaan dalam satu atau lebih media kultur (cair) yang memungkinkan proses resusitasi dan multiplikasi (penggandaan diri) mikroba tertentu. Secara umum, semua patogen dalam pangan sebenarnya berada dalam keadaan stres sub-letal.
Metode deteksinya terdiri dari 4 tahapan, mulai dari resusitasi, pengkayaan, isolasi, serta purifikasi (Uyttendaele, Debevere 2006).
Prosedur analisis maupun identifikasi semua kelompok E. coli patogen diuraikan dalam Food and Drug Administration Bakteriologis Analytical Manual (FDA-BAM) maupun dalam International Organization for Standardization (ISO). Metode FDA-BAM adalah prosedur umum untuk isolasi E. coli sebelum dilakukan pengujian sifat virulensi spesifik dari patotipe yang berbeda. Salah satu titik kritis dalam proses isolasi bakteri adalah pengambilan sampel yang efektif serta persiapannya sebelum dilakukan analisis lebih lanjut (Wang et al. 2013). Prosedur resusitasi atau disebut juga pra pengkayaan dilakukan dengan inkubasi beberapa jam hingga semalam pada media non- atau semi selektif yang mampu melakukan perbaikan sel. Sementara itu, proses pengkayaan E.
coli patogen pada media selektif dilakukan untuk menekan pertumbuhan flora kompetitif sehingga memungkinkan bagi E. coli patogen untuk menggandakan diri hingga 105-107 CFU/mL. Dua jenis media pengkayaan yang paling umum dan sukses digunakan untuk E. coli patogen (E. coli O157: H7) adalah trypone soy broth (TSB) dan E. coli broth (EC) dengan atau tanpa modifikasi (Rivas et al. 2015). Modifikasi
86
dapat termasuk penambahan dipotasium fosfat ke dalam TSB (mTSB), serta berbagai komponen selektif lainnya yang membantu dalam pemulihan patogen. Beberapa media pengkayaan yang dapat diaplikasikan pada E. coli patogen disajikan pada Tabel 8.1.
Tabel 8.1 Media pengkayaan untuk E. coli patogen
Media pengkayaan Kelompok/
Serogrup Media non selektif
Tryptone Soy Broth (TSB) EHEC
TSB termodifikasi EHEC
Buffered Peptone Water EHEC
E. coli Broth EHEC
Media selektif
TSB+ Vancomycin + Potassium Tellurite O111 TSB + Vancomycin + Cexifime + Potassium
Tellurite
O26
TSB termodifikasi + Novobiosin O157 dan lainnya TSB termodifikasi+ Acriflavin O157
TSB termodifikasi + Cefixime + Cefsulodin + Vancomycin
O157 E. coli Broth termodifikasi + Novobiosin O157, O26 Enterobacteriaceae Enrichment broth +
Novobiosin
O157 Buffered Peptone Water + Vancomycin +
Cefsulodin + Cefixime
O157 Buffered Peptone Water + Vancomycin O26, O111 Sumber: O’Sullivan et al. (2006)
International Organization for Standardization (ISO 16654:2001) merekomendasikan penambahan novobiosin ke dalam TSB termodifikasi (mTSBn) kemudian diinkubasi pada suhu 41.5 °C selama 6 jam. Inkubasi kemudian dilanjutkan selama 18-24 jam pada suhu 37 °C. Tahapan analisis serta deteksi dari E. coli patogen menurut ISO disajikan pada Gambar 8.1. Sejumlah metode isolasi menggunakan antibodi spesifik
87
untuk serogrup E.coli tertentu juga tersedia. Pemisahan Imunomagnetik (IMS) memulihkan sel target dari media pengkayaan menggunakan manik-manik paramagnetik. Manik-manik ini dilapisi dengan poliklonal antibodi spesifik untuk serogrup tertentu. Dalam metode standar serogrup O157 dilakukannya IMS merupakan tahap prasyarat sebelum isolasi ke media agar. Meskipun tidak ada protokol standar untuk serogrup lainnya, IMS telah terbukti berguna dalam pemulihan serogrup dari pangan.
Setiap bakteri yang akan diidentifikasi harus murni dan untuk mendapatkan biakan murni digunakan media selektif yang memungkinkan untuk isolasi koloni bakteri target berdasarkan pada karakter biokimianya. Metode ISO menggunakan Cefixime Tellurite Sorbitol MacConkey Agar sebagai media selektif bagi E. coli patogen karena ketidakmampuan hampir semua E. coli (O157) untuk memfermentasi sorbitol. Cefixime dan tellurire ditambahkan untuk meningkatkan selektivitas dalam sampel yang terkontaminasi. E. coli O157 umumnya menghasilkan koloni berwarna ketika dikulturkan pada media ini, sehingga membedakannya dari serogrup dan mikroflora lainnya.
Berbeda dengan ISO, FDA (2011) merekomendasikan penggunaan lactose broth atau buffer pepton dengan piruvat (mBPWp) yang berisi beberapa reagen antimikroba yang efektif menekan pertumbuhan flora normal dan bakteri non-target, namun tetap memungkinkan pertumbuhan E. coli (O157:H7) dan mampu mendeteksi hingga <1 CFU/g dalam pangan sebagai media pra pengkayaan. Secara singkat, FDA (2011) merekomendasikan pra-pengkayaan 25 g sampel pangan dalam 225 mL BHI (brain hearth infusion) broth pada 35 °C selama 3 jam untuk proses resusitasi sel yang terluka atau rusak, kemudian dipindahkan ke 225 mL tryptone fosfat (TP) dan diinkubasi selama 20 jam pada 44 °C. Sampel dari media pengkayaan kemudian di- platting ke agar Levine eosin-methylene blue (L-EMB). Koloni bakteri
88
akan menghasilkan warna hijau metalik dan pada agar MacConkey akan berwarna merah. Media kemudian diinkubasi pada 35 °C selama 20 jam.
Gambar 8.1 Skema deteksi E. coli patogen (O157:H7) pada pangan
(ISO 16654:2001)
Pengkayaan
Sampel (25 g) + TSB yang ditambah novobiosin (mTSB+n) (225 mL) dihangatkan sampai 41.5 oC
(Inkubasi selama 6 jam pada suhu 41.5 oC kemudian inkubasi lebih lanjut selama 12-18 jam pada suhu 41.5 oC)
Separasi/pemisahan secara imunomagnetik (1 mL dari pengkayaan)
− Immunocapture dalam tube mikrosentrifus
− Separasi dalam separator magnetik
− Pencucian beberapa kali dengan bufer fosfat termodifikasi
− Pengendapan partikel magnetik dalam 100 µL (vol. Akhir)
Isolasi dalam media selektif
50 mL subkultur partikel hasil immunomagnetic dipindahkan ke cefixime tellurite sorbitol MacConkey (CT-SMAC) dan satu media selektif lain
(inkubasi selama 18-24 jam pada suhu 37 oC)
Purity Plate
Dipilih 5 koloni yang diduga E. coli O157:H7 (sorbitol negatif pada CT- SMAC) dari setiap agar plate dan kemudian inokulasi ke dalam nutrien
agar (NA)
(inkubasi selama 18-24 jam pada suhu 37 oC)
Konfirmasi biokimia dan serologi
Produksi indol atau identifikasi aglutinasi menggunakan Kit komersial kit dengan antiserum E. coli O157
Karakteristik genetik (rujukan laboratorium) Penanda patogen (gen stx, gen eae)
89
Morfologi koloni dan warna dapat bervariasi untuk setiap strain E. coli patogen, selain itu strain enteroinvasive E. coli (EIEC) tidak dapat memfermentasi laktosa, oleh karena itu, dianjurkan setidaknya 10 koloni typical dan 10 koloni atypical harus dipilih untuk analisis lebih lanjut.
Metode ini dapat digunakan untuk mengisolasi enteropathogenic E. coli (EPEC), enterotoxigenic E. coli (ETEC), enteroinvasive E. coli (EIEC), dan enteroaggregative E. coli (EAEC), tetapi tidak E. coli O157: H7 (EHEC), karena EHEC tidak dapat tumbuh dengan baik pada suhu 44 °C.