Jurnal biotropika | Vol. 2 No. 5 | 2014 273
EKSPRESI PROTEIN P53 PADA SEL TIG-3 SETELAH PERLAKUAN SINAR UV DAN EKSTRAK BIJI JUWET (Syzygium cumini)
Roudlotul Jannah1), Widodo2)
1), 2)
Jurusan Biologi Fakultas Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Brawijaya Malang
1)[email protected], 2)[email protected]
ABSTRAK
Tubuh terlindungi dari lingkungan luar karena adanya kulit. Adanya paparan lingkungan luar, seperti sinar UV dapat mempengaruhi sel pada kulit. Dalam jangka pendek dapat menyebabkan kulit terbakar serta dalam jangka panjang menyebabkan kanker atau penuaan dini. Salah satu cara yang biasa digunakan untuk melindungi sel kulit dari paparan sinar UV adalah dengan penggunaan antioksidan.
Jambolan (S. cumini) merupakan salah satu tumbuhan yang memiliki kandungan antioksidan yang tinggi. Protein p53 merupakan salah satu protein yang bertugas dalam melindungi DNA dari kerusakan yang ditimbulkan setelah sel kulit terpapar sinar ultraviolet (UV). Penelitian ini bertujuan untuk melihat ekspresi protein p53 pada sel fibroblast TIG-3 setelah dipapar sinar UV serta pemberian ekstrak biji juwet. Sel dikultur dan dipapar sinar UV 30mJ/cm2 lalu diberi ekstrak biji juwet dengan dosis 0,1% dan 10%. Pemberian ekstrak biji juwet mampu meningkatkan ekspresi protein p53 pada sel TIG-3.
Kata kunci: ellagitannin, fibroblas, jambolan, p53, UV.
ABSTRACT
Skin protects our body from the external environments. Ultraviolet (UV) light is one of the external environment that can induce alteration in skin cells. Short term effect is sunburn, but in long term it can cause skin cancer also aging. Commonly people use antioxidant to protects their skin from UV. Jambolan is one of the herbal that rich of antioxidant. p53 is one of protein that can protects DNA fom DNA damage after UV irradiation. Expression of p53 is monitored in this study. TIG-3 cells were cultured then irradiated by 30mJ/cm2 UV lights and treated by jambolan seed extract. Jambolan seed crude extract treatment upregulated the p53 expression on TIG-3 cells.
Key words: ellagitannin, fibroblast, jambolan, p53, UV.
PENDAHULUAN
Kulit merupakan organ utama yang terlibat dalam sistem integumen dan melapisi seluruh bagian permukaan tubuh makhluk hidup. Selain itu, dengan adanya kulit sel dalam tubuh akan dapat melakukan aktivitasnya dengan baik tanpa ada gangguan dari luar.
Salah satu faktor yang dapat mempengaruhi aktifitas sel adalah radiasi sinar UV dari cahaya matahari [1,2]
Dalam kondisi yang berlebih, sinar UV dapat menimbulkan beberapa masalah terhadap kulit, mulai kulit kemerahan bahkan dalam jangka waktu lama menyebabkan risiko kanker kulit. Efek buruk tersebut timbul karena adanya stress oksidatif yang terjadi setelah adanya paparan sinar UV[3].
Salah satu cara yang biasa digunakan untuk menangkal efek buruk dari sinar UV adalah dengan menggunakan antioksidan.
Tumbuh-tumbuhan merupakan salah satu sumber antioksidan. Jambolan (S. cumini) merupakan salah satu tumbuhan berkhasiat obat yang memiliki kandungan antioksidan tinggi.
Ellagitannin merupakan salah satu antioksidan
dalam biji jambolan yang mampu melindungi sel fibroblast kulit dari kerusakan akibat paparan sinar UV [4, 5].
Paparan sinar UV dan pemberian antioksidan dapat menginduksi aktivasi protein p53. Fosforilasi protein p53 sebagai faktor transkripsi beberapa protein yang terlibat dalam proses DNA repair salah satunya disebabkan oleh Ɣ-H2AX. Aktivasi protein p53 akan menyebabkan penghambatan proliferasi dengan menghentikan siklus sel untuk memaksimalkan proses DNA repair [6].
METODE PENELITIAN
Ekstraksi Kasar Biji Juwet. Buah juwet diperoleh di wilayah kampus Universitas Brwaijaya. Biji dipisahkan dari buah yang telah masak atau berwarna ungu kehitaman.
Biji kemudian dikeringkan pada suhu 60°C.
Setelah biji kering kemudian dihaluskan hingga menjadi bubuk. Ekstraksi dimulai dengan menambahkan 25ml aquades ke dalam botol polipropilen (falcon) berisi 5gram bubuk biji juwet. Ekstraksi dilakukan dengan cara slow shaking selama semalam pada suhu 40°-
Jurnal biotropika | Vol. 2 No. 5 | 2014 274 50°C. Ekstrak didiamkan pada suhu ruangan
dan dilakukan penyaringan dengan kertas Whatman dan kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 20 menit dan kemudian dilakukan penyringan dengan filter 0.45 µm [7].
Kultur Sel TIG-3. Ekspresi protein p53 diukur menggunakan metode western blotting.
Sel TIG-3 dikultur pada cawan kultur berisi 6 sumuran lalu dipapar sinar UV dengan meletakkannya dalam UV cross-linker (funakoshi) dengan dosis 30mJ/cm2. Medium sel diganti dengan ekstrak biji juwet dengan dosis yang telah diketahui memiliki efek toksik terhadap sel yaitu 10% serta yang tidak memiliki efek toksik dan mampu menghambat pelepasan protein Ɣ-H2AX sehingga dapat diketahui perbedaan ekpresi p53 pada sel.
Western Blotting. Sel yang telah diberi perlakuan selama 24 jam kemudian dilisiskan menggunakan larutan RIPA buffer (Thermo scientific). Protein hasil lisis diestimasi menggunakan metode Bradford lalu diseparasi pada SDS-PAGE. Hasil elektroforesis kemudian diblot pada membrane nitroselulosa (Millipore) secara semi dry. Identifikasi protein dilakukan dengan menambahkan mouse anti-actin antibody dan rabbit anti-p53 primary antibody (santa cruz). Visualisasi dilakukan dengan mengidentifikasi goat anti rabbit alexa conjugated antibody dan rat anti mouse alexa conjugated antibody (santa cruz). Kuantifikasi silakukan dengan menggunakan software ImageJ [7].
Gambar 1. Peta perlakuan pada kultur sel TIG-3 untuk persiapan pengecekan ekspresi protein p53 setelah paparan UV 30mJ/cm2 dan pemberian ekstrak biji juwet dosis tinggi (10%) dan dosis efektif (0,1%).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Adanya paparan sinar UV terhadap kulit menyebabkan adanya stress oksidatif pada sel.
Radikal bebas yang dihasilkan akan menyebabkan adanya kerusakan DNA, salah satunya terbentuk DSBs yang ditandai dengan terfosforilasinya protein histon H2AX menjadi
Ɣ-H2AX. Pelepasan Ɣ-H2AX akan membantu menginduksi protein p53 sebagai faktor transkripsi dari beberapa protein yang terlibat di dalam proses DNA repair. Aktivasi p53 di dalam sel akan menyebabkan terhentinya siklus sel pada fase G1 sehingga DNA yang mengalami mutasi tidak ikut tereplikasi bersama dengan proses proliferasi sel. Dalam kasus mencit p53-/- ketika sel terpapar oleh radiasi maka akan menyebabkan sel terpacu untuk melakukan proliferasi secara terus-menerus yang berpotensi menjadi sel kanker. Pelepasan Ɣ-H2AX tidak mampu menginduksi proses DNA repair sehingga DNA yang termutasi tetap ikut tereplikasi dalam siklus sel [6, 8, 9, 10].
Protein p53 merupakan sebuah suppressor tumor gene dan memiliki peran penting dalam proses DNA repair. Dalam keadaan normal, protein p53 akan mengalami inaktivasi di dalam sel dan diikat oleh inhibitornya. Ketika terdapat suatu gangguan, salah satunya radiasi UV yang menyebabkan terfosforilasinya protein H2AX menjadi Ɣ-H2AX yang akan terlepas dan mengaktivasi protein p53 sehingga dan menuju inti. Protein p53 akan menuju ke promoter beberapa protein yang berperan dalam proses DNA repair, salah satunya adalah protein p21.
Upregulasi protein p21 akan menyebabkan sel tidak dapat memasuki sistem check point untuk memasuki fase S, dengan demikian makan perbaikan DNA dapat berlangsung dengan baik dan mengurangi risiko tereplikasinya DNA mutan. Terhentinya siklus sel akan menyebabkan proliferasi sel menjadi terhambat [11, 12, 13].
Sel TIG-3 yang dipapar sinar UV akan mengalami peningkatan ekspresi protein p53 yang diperlukan untuk induksi DNA repair. Pada dosis 0.1% baik yang diberi paparan sinar UV ataupun tidak, menunjukkan ekpresi protein p53 yang relatif sama dengan kontrol. Hal tersebut berkaitan dengan kemampuan antioksidan dalam ekstrak kasar biji juwet yang mampu menetralisir radikal bebas yang dihasilkan setelah pemaparan sinar UV. Ellagitannin merupakan salah satu antioksidan yang terdapat dalam buah juwet dan telah diketahui mampu mengaktifkan p53 di dalam sel. Tidak adanya pelepasan Ɣ-H2AX pada sel yang diberi perlakuan dosis 0,1% menyebabkan tidak adanya aktivasi protein p53 sehingga ekspresinya sama dengan kontrol non UV.
Antioksidan dalam dosis yang tinggi juga dapat bersifat radikal bebas sehingga menimbulkan efek toksik pada sel. Hal tersebut terlihat pada tingginya ekspresi protein p53 pada sel yang diberi perlakuan dosis 10% ekstrak biji
Jurnal biotropika | Vol. 2 No. 5 | 2014 275 juwet dan dipapar sinar UV. Pemberian ekstrak
pada dosis tinggi akan menambah jumlah radikal bebas di dalam sel sehingga menginduksi ekspresi p53 sesuai dengan kerusakan yang ditimbulkan. Tingginya ekspresi protein p53 akan menghambat pertumbuhan sel bahkan jika kerusakan yang ditimbulkan tidak dapat diatasi lagi maka sel akan diinduksi untuk melakukan apoptosis. Hal tersebut terlihat pada efek toksik pada sel yang diberi perlakuan ekstrak biji juwet pada dosis 10%.
Gambar 2. Pemberian ekstrak biji juwet dalam dosis 10% menyebabkan tingginnya ekspresi protein p53 pada sel yang diberi UV.
Pemberian ekstrak dengan dosis 0,1%
memiliki kesamaan ekspresi protein p53 dengan kontrol negatif atau sel tanpa paparan sianr UV dan pemberian ekstrak biji juwet.
KESIMPULAN
Ekstrak biji juwet mampu meningkatkan ekspresi protein p53 pada sel TIG-3 setelah pemaparan sinar UV. Pada dosis rendah, ekspresi protein p53 pada sel TIG-3 memiliki kesamaan dengan kontrol negatif. Dalam dosis tinggi (10%) ekstrak biji juwet memiliki efek toksik terhadap sel.
UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian ini dapat berlangsung dengan baik dengan dukungan Program Hibah Kompetisi UB beserta Bapak Widodo yang telah membimbing hingga penelitian ini berjalan dengan baik.
DAFTAR PUSTAKA
[1] Tortora, G. J. dan B. Derrickson. 2009.
Principles of Anatomy and Physiology.
United States of America: John Wiley and Sons Inc.
[2] Marieb, E. N. 2003. Human Anatomy and Physiology. New York: Pearson Education.
[3] Saladi, R.N., dan Persaud, A.N., 2005. The causes of skin cancer: a comprehensive review drug. (41):37–53.
[4] Agyare, C., dkk. 2011. Ellagitannins from Phyllanthus muellerianus (Kuntze) Exell.: Geraniin and furosin stimulate cellular activity, differentiation and collagen synthesis of human skin keratinocytes and dermal fibroblasts.
Journal of Phytomedicine. 18 (7): 617-624.
[5] Chaudhary, B. dan K. Mukhopadhyay.
Syzygium cumini (L.) Skeels. A Potential Source of Nutraceuticals. International Journal of Pharmacy and Biological Science. 2(1):46-53.
[6] Lu, H., R. A. Forbes, A. Verma. 2002.
Hypoxia-inducible factor 1 activation by aerobic glycolysis implicates the warburg effect in carcinogenesis. Biological Chemistry. 277: 23111-23115.
[7] Wadhwa, R., dkk. 2013. Water Extract of Ashwaganda Leaves Has Anticancer Activity: Identification of an Active Component and Its Mechanism of Action.
PLOS ONE. 8(10):e77189.
[8] Hseu, Y. C., dkk. 2012. Ellagic acid protects human keratinocyte (HaCaT) cells against UVA-induced oxidative stress and apoptosis through the upregulation of the HO-1 andNrf-2 antioxidant genes. Journal of Food and Chemical Toxicology.
(50):1245-1255.
[9] Rothkamm, K. dan S. Horn. 2009. Ɣ- H2AX as protein biomarker for radiation exposure. ANN IST SUPER SANITA.
(45):265-271.
[10] Halicka, H. D., dkk. 2005. Histone H2AX Phosphorylation after Cell Irradiation with UV-B. Cell-Cycle. 4(2):339-345.
[11] Adimoolam, S. dan J. M. Ford. 2003. P53 and regulation of DNA damage recognition during nucleotide excition repair. DNA Repair 2 ELSEVIER. (2003): 947-954.
[12] Kastan, M. B., dkk. 1991. Participation of p53 protein in the cellular response to DNA damage. Cancer research. (51):6304- 6311.
[13] Li, T. M., dkk. 2005. Ellagic Acid Induced p53/p21 Expression, G1 Arrest and Apoptosis in Human Bladder Cancer T24 Cells. Anticancer Research. (25): 971-980.
0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80
0 0.10% 10%
Level p53
Ekstrak Kasar Biji Juwet UV non UV p53
aktin
