Lactobacillus casei merupakan bakteri probiotik yang berperan penting dalam menjaga kesehatan tubuh, namun penggunaannya dalam sediaan cair masih dibatasi oleh umur simpan. Berdasarkan hasil uji keseluruhan terhadap persyaratan sifat fisik, dalam hal ini kompresibilitas dan viabilitas bakteri pada semua granul probiotik, optimalisasi suhu dan waktu pengeringan granulasi basah probiotik Lactobacillus casei granulated in manitol dengan Response Surface Metodologi pencucian 45°C selama 2 jam, yang menurut klaim produk probiotik didasarkan pada cfu/g WHO/FAO. Lactobacillus casei merupakan spesies yang mudah beradaptasi, tumbuh pada suhu 15° - 41°C dan pH di atas 3,5 (optimal 6,8).
Lactobacillus casei tidak akan aktif atau dorman pada suhu dingin atau -18°C, ketika sudah mencapai suhu tubuh bakteri akan aktif kembali. Mengingat pentingnya bakteri Lactobacillus casei, penggunaan maksimum dapat dilakukan dengan menggranulasi bakteri dalam bentuk granular. Kondisi operasi optimal dalam pembuatan granul Lactobacillus casei dapat ditentukan dengan menggunakan metode Response Surface Methodology (RSM).
Dengan metode tersebut dapat diketahui bagaimana kombinasi suhu dan waktu yang cukup baik untuk mendapatkan granula Lactobacillus casei dengan pencapaian hasil yang baik. Sehingga tujuan dari penelitian ini adalah untuk melihat pengaruh suhu dan waktu pengeringan terhadap granulasi basah probiotik Lactobacillus casei yang digranulasikan pada mannitol. Lactobacillus casei merupakan salah satu bakteri yang memiliki keterbatasan dalam menghadapi kondisi suhu yang terlalu tinggi, karena bakteri Lactobacillus casei merupakan bagian dari bakteri mesofil yang hanya tahan pada suhu antara 15oC - 41oC.
Dari hasil penelitian ini diharapkan dapat meningkatkan pemanfaatan bakteri Lactobacillus casei menggunakan biopolimer alginat dan memberikan wawasan tentang formulasi sediaan dengan bahan aktif bakteri.
Lactobacillus casei
Probiotik adalah mikroba hidup yang menempel pada dinding usus dan bermanfaat bagi kesehatan inangnya (Salminen et al. 1998).Menurut Food and Agriculture Organization (FAO), bakteri probiotik adalah mikroorganisme hidup yang bila diberikan dalam jumlah yang cukup , akan memberikan manfaat kesehatan bagi penggunanya. Dengan demikian, jumlah koloni yang muncul pada cawan merupakan indeks dari jumlah organisme hidup yang terdapat dalam sampel. Perhitungan jumlah koloni dilakukan dengan menggunakan jumlah lempeng total berdasarkan pertumbuhan yang dapat dilihat secara langsung tanpa mikroskop (Fardiaz 1989).
Dengan metode TPC, jumlah koloni dihitung sebagai berikut: Koloni per ml atau per gram = jumlah koloni per cawan x 1/FP (faktor pengenceran) Kemudian cawan petri yang dipilih dan dihitung berisi jumlah koloni antara 30-300 ( Permana dan Kusmiati, 2007 ). RSM merupakan teknik statistik yang digunakan untuk penelitian yang memiliki proses yang kompleks dan banyak digunakan dalam penelitian teknik kimia atau teknologi pangan. Response Surface Methodology (RSM) sebagai metode gabungan antara teknik matematika dan statistik, digunakan untuk membuat model dan menganalisis respon y yang dipengaruhi oleh beberapa variabel/faktor independen x untuk mengoptimalkan respon (Box et al. 1978) . .
Kurva respons permukaan dan plot kontur digunakan untuk mempresentasikan pengaruh variabel pada hasil yang diperoleh. Untuk menguji signifikansi model empiris yang dihasilkan, analisis varians (Anova) dilakukan (Montgomery 2001).
Road Map Penelitian
Alat dan Bahan Penelitian Alat penelitian
Cara Penelitian Penyediaan bahan
Inokulum (kultur benih) dibuat dengan cara menginokulasi suspensi L.casei (10% v/v) dalam 30 ml media MRSB steril dalam labu Erlenmeyer 100 ml pada suhu kamar sambil diaduk dengan kecepatan 125 rpm selama 48 jam. Inokulasi dilakukan dengan memasukkan 30 ml inokulum (kultur benih) ke dalamnya, dilanjutkan dengan inkubasi selama 24 jam pada suhu kamar dengan agitasi 125 rpm. Setelah waktu inkubasi 24 jam, biomassa dikumpulkan dan dipisahkan dengan sentrifugasi pada 4000 putaran per menit selama 20 menit.
100 µl dari masing-masing pengenceran tersebut dipipet ke dalam cawan petri steril, setelah itu ditambahkan 15 ml media MRSA ke dalam setiap cawan. Kemudian dilakukan penghitungan jumlah koloni secara manual pada setiap cawan petri dan dilanjutkan dengan perhitungan Total Plate Count (ALT) bakteri. Kemudian bakteri yang telah dipanen dimasukkan ke dalam lapisan mukus dan dimasukkan ke dalam inkubator selama beberapa menit untuk mengatur suhu, kemudian ditambahkan manitol, diaduk hingga homogen dan terbentuk massa yang dapat diremas (banana breaking).
Setelah granul disaring, granul dikeringkan dalam oven sesuai suhu dan waktu yang ditentukan dalam central composite design (CCD) pembuatan granul. Sebanyak 62,0 gram MRSA dicampurkan dalam labu Erlenmeyer berisi 1000 ml air, diaduk hingga tercampur rata, dipanaskan hingga homogen. Media MRSA disimpan dalam lemari pendingin (4-7°C) jika tidak segera digunakan dan dipanaskan kembali dalam penangas air (±70°C) bila perlu digunakan.
Sampel pelet Lactobacillus casei ditimbang sebanyak 1,0 gram dan ditempatkan dalam 9 ml akuades steril untuk mendapatkan pengenceran 10-1. Sebanyak 100 µl pengenceran 10-4 sampai 10-6 dipipet ke dalam cawan Petri steril yang berisi 15 ml media MRSA pada masing-masing cawan. Setelah agar-agar membeku di dalam beaker, cawan diinkubasi terbalik pada suhu 37°C selama 24 jam (BSN 2009).
Kemudian dilakukan pencatatan jumlah koloni bakteri pada cawan petri secara manual, kemudian dilanjutkan dengan menghitung Total Plate Count (ALT) dan menghitung rata-ratanya. Untuk menguji signifikansi model empiris yang dihasilkan, dilakukan analisis varians (Anova). Langkah selanjutnya adalah membuat granul dengan kondisi optimal hasil RSM, untuk menguji hasil apakah model matematika (RSM) titik optimal untuk menghasilkan granul Lactobacillus casei terbaik.
Produksi biomassa bakteri Lactobacillus casei
Hasil perhitungan bakteri setelah pemanenan
Optimasi suhu dan waktu pengeringan granul probiotik
Optimasi dengan Metode Respon Permukaan
Analisis terhadap viabilitas bakteri granul probiotik
Saat memilih model ini, dianggap tepat jika model mismatch tidak berpengaruh signifikan dan model dalam status Usulan. Dari Tabel 8 di atas terlihat bahwa tidak ada model yang diusulkan, yang berarti ketidaksesuaian semua model berpengaruh signifikan terhadap respon. Parameter statistik yang digunakan untuk memilih model yang tepat dipusatkan pada akar R-kuadrat dan prediksi R-kuadrat terendah.
Berdasarkan tabel 9 di atas, terlihat bahwa diantara model-model yang ada yaitu linier, 2FI, kuadrat dan kubik, penggunaan model linier dan kuadrat direkomendasikan. Uji ANOVA digunakan untuk mengetahui pengaruh masing-masing variabel dan interaksi antar variabel yang digunakan terhadap respon yield yang diperoleh. Hasil uji ANOVA pada metode permukaan respon akan memberikan persamaan model matematis untuk optimasi lebih lanjut.
Hal ini menunjukkan bahwa variabel yang berpengaruh nyata terhadap respon stabilitas adalah waktu pengeringan granul probiotik. Dari tabel 11 di atas terlihat bahwa nilai Pred R squared sebesar 0,1119 tidak mendekati nilai Adj R squared sebesar 0,7859 seperti yang diharapkan. Ini mungkin karena kemungkinan kesalahan dengan model yang digunakan atau data yang diperoleh tidak terlalu bagus.
Pengaruh interaksi antar variabel berdasarkan model yang signifikan terhadap respon viabilitas bakteri granul probiotik yaitu variabel suhu pengeringan granul dan waktu pengeringan granul disajikan pada Gambar 2 dan 4. Dapat dilihat kondisi grafik untuk mendapatkan viabilitas yang baik granul probiotik belum tercapai dalam penelitian ini.
Analisa model berdasarkan uraian jumlah kuadrat dari urutan model pada respon kompresibilitas granul probiotik
Analisis pemilihan model dilakukan berdasarkan jumlah kuadrat dari urutan model (sequential model sum of squares), uji kecocokan dan ringkasan statistik model. Kemungkinan model yang dipilih dari metode permukaan respons adalah linier, 2FI (interaksi 2 faktor), kuadratik dan kubik. Pemilihan model berdasarkan deskripsi jumlah kuadrat orde model Model terpilih berdasarkan deskripsi penjumlahan kuadrat adalah orde polinomial dengan nilai tertinggi.
Berdasarkan Tabel 13 di atas terlihat bahwa model yang dipilih untuk menjelaskan pengaruh variabel percobaan (suhu dan waktu pengeringan granul probiotik) terhadap viabilitas dan kompresibilitas granul probiotik adalah model mean versus total dan model kuadrat versus 2FI, karena itu memiliki nilai p yang tidak terlihat dan untuk kuadrat vs 2FI nilai p lebih dari 5%, dengan kata lain kedua model memiliki pengaruh yang kurang signifikan untuk menjelaskan respons yang dimaksud. Tabel 14 di atas menunjukkan bahwa tidak ada model yang direkomendasikan, artinya semua model ini memiliki potensi untuk memberikan efek respon dunia nyata. Berdasarkan tabel 15 di atas, terlihat bahwa model kuadrat menunjukkan status usulan untuk model yang ada, yang berarti model tersebut secara statistik direkomendasikan untuk digunakan.
Uji ANOVA digunakan untuk mengetahui pengaruh masing-masing variabel dan interaksi antar variabel yang digunakan terhadap respon yield yang diperoleh. Hasil uji ANOVA pada metode surface response akan menghasilkan persamaan model matematis untuk optimasi selanjutnya. Hal ini menunjukkan bahwa variabel yang mempengaruhi respon kompresibilitas merupakan fungsi kuadrat dari suhu pengeringan granul.
Nilai Pred R-Squared yang negatif menunjukkan bahwa rata-rata keseluruhan memprediksi respons yang lebih baik daripada model yang dipilih. Pengaruh dan interaksi antar variabel berdasarkan model yang signifikan terhadap respon kompresibilitas granul probiotik yaitu suhu granul dan waktu pengeringan disajikan pada Gambar 4 dan 5. Dari bentuk petak 3 dimensi respon kompresibilitas dapat dilihat adanya bukanlah titik optimal untuk mencapai nilai kompresibilitas yang baik.
Optimasi waktu dan suhu pengeringan granul dengan kondisi hasil pemodelan
Semakin kecil granul kering maka nilai kompresibilitasnya semakin rendah karena densitasnya akan semakin rapat sehingga dapat mengisi rongga-rongga pada granul itu sendiri. Kondisi optimal suhu pengeringan dan waktu pengeringan granula yang diusulkan oleh RSM serta prediksi viabilitas dan kompresibilitasnya ditunjukkan pada Tabel 19. Rangkuman hasil viabilitas dan respons kompresibilitas granula probiotik pada kondisi percobaan (awal), prediksi dari model numerik RSM dan konfirmasi kondisi RSM optimal ditunjukkan pada Tabel 20.
Dengan mengatur kondisi pengeringan biji-bijian (suhu dan waktu) dalam kisaran percobaan dan hasil maksimum yang diharapkan, kondisi optimal dapat ditentukan. Hasil ringkasan viabilitas dan kompresibilitas granul probiotik didasarkan pada optimalisasi desain eksperimen CCD, prediksi numerik, dan validasi model.
Hasil yang diperoleh dari probiotik granul rata-rata secara teoritis memenuhi syarat yaitu dibawah 15%. Rata-rata dari hasil uji distribusi ukuran butir, semua butiran memiliki kehalusan kurang dari 10% dari berat butir. Stabilitas BAL dalam granul diharapkan tetap tinggi agar dapat memberikan efek yang baik bagi kesehatan.
Berdasarkan data di atas, hanya granul pada suhu 55°C selama 4 jam dan granul pada suhu 60°C selama 3 jam yang tidak memenuhi persyaratan FAO dan WHO, maka produk probiotik olahan minimal harus mengandung cfu bakteri hidup per gram produk probiotik.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran
LUARAN YANG DICAPAI
