OBJEK DAN METODE PENELITIAN
3.1 Objek, Bahan dan Alat Penelitian 3.1.1 Objek Penelitian
Bakteri uji yang diteliti pada penelitian ini adalah bakteri Staphylococcus aureus yang di biakkan di Laboratorium Politeknik Analisis Kesehatan Bandung (Poltekkes Bandung).
Kriteria inklusi: biakkan bakteri Staphylococcus aureus yang dikoleksi dari Laboratorium Poltekkes Bandung.
Kriteria ekslusi: biakkan bakteri Staphylococcus aureus yang
terkontaminasi.
Objek yang digunakan pada penelitian adalah Lidah Buaya (Aloe Vera L.) yang diolah menjadi Ekstrak Etanol Lidah Buaya di Laboratorium Politeknik Analisis Kesehatan Bandung. Lidah Buaya yang diperoleh dari perkebunan di Lembang Bandung, serta antibiotik Eritromisin yang diperoleh dari salah satu Apotek di Bandung sebagai kontrol positif.
3.1.2 Alat & Bahan Penelitian
Alat dan bahan penelitian yang digunakan adalah sebagai berikut:
a. Inkubator b. Cawan petri
c. Tabung Erlenmeyer d. Jarum ose
e. Mikroskop f. Gelas beker g. Gelas ukur h. Alumunium foil i. Kaca objek
j. Penutup kaca objek k. Pengaduk
l. Hand gloves m. Pipet hisap n. Agar MSA o. NaCl Fisiologis
3.2 Jumlah Sampel
Penetapan besar sampel pada penelitian ini dengan menggunakan Rumus Frederer.
(r-1)(t-1) ≥ 15
Keterangan: r: pengulangan jumlah sampel
t: jumlah kelompok perlakuan
a. Metode Difusi
(r-1)(t-1) ≥ 15
(r-1)(2-1) ≥ 15
r ≥ 16
Berdasarkan perhitungan, maka didapatkan 16 kali pengulangan tiap perlakuan. Jumlah sampel yang dibutuhkan untuk penelitian ini adalah 16 kali pengulangan dengan 2 perlakuan sehingga total sampel 16 × 2 = 32 sampel.
b. Metode Dilusi
(r-1)(t-1) ≥ 15
(r-1)(6-1) ≥ 15
5r-5 ≥ 15 5r ≥ 20
≥ 4
Berdasarkan perhitungan, maka didapatkan 4 kali pengulangan tiap perlakuan. Jumlah sampel yang dibutuhkan untuk penelitian ini adalah 4 kali pengulangan dengan 6 perlakuan sehingga total sampel 4 × 6 = 24 sampel.
3.3 Metode Penelitian
3.3.1 Rancangan Penelitian
Rancangan penelitian yang digunakan adalah metode eksperimental laboratorium secara in vitro.
3.3.2 Variabel Penelitian
Variabel bebas: Konsentrasi ekstrak etanol lidah buaya.
Variabel terikat: Efek antibakteri, KHM, dan KBM bakteri Staphylococcus aureus.
Variabel Terkendali : Lamanya waktu inkubasi, suhu inkubasi, dan media
pertumbuhan.
3.3.3 Definisi Operasional
Tabel 3. 1 Definisi Operasional
No Variabel Cara Ukur Hasil Ukur Skala
1 Zona Hambat Diameter zona hambat Diameter Ordinal Bakteri disekitar cakram yang dalam
diukur menggunakan milimeter
jangka sorong. (mm)
2 Konsentrasi Konsentrasi ekstrak Konsentrasi Numerik Hambat Minimal etanol lidah buaya dalam
minimal yang persen (%)
dibutuhkan untuk
menghambat bakteri
Staphylococcus aureus
dengan metode dilusi
yang diukur dengan
mengamati kekeruhan
pada reaksi tersebut.
Dinyatakan KHM
apabila tidak
menunjukkan
kekeruhan pada reaksi.
3 Konsentrasi Konsentrasi ekstrak Konsentrasi Numerik Bunuh Minimal etanol lidah buaya dalam
minimal yang persen (%)
dibutuhkan untuk
membunuh
pertumbuhan bakteri
Staphylococcus aureus
dengan metode dilusi.
Dinyatakan sebagai
KBM apabila tidak
menunjukkan
pertumbuhan bakteri.
4 Ekstrak Etanol Ekstrak yang didapat Konsentrasi Numerik Lidah Buaya melalui teknik maserasi dalam
dan di tambah dengan persen (%)
pelarut etanol.
3.3.4 Prosedur Penelitian
3.3.4.1 Pembuatan Ekstrak Etanol Lidah Buaya
Pada penelitian ini lidah buaya yang digunakan diambil dari Lembang Bandung. Ekstraksi dilakukan di Laboratorium Politeknik Analisis Kesehatan.
a. Lidah buaya dicuci, dibersihkan, dan dikupas.
b. Setelah itu dikeringkan dalam mesin pengering dengan suhu 60oC selama 3 hari.
c. Setelah kering lidah buaya kemudian dihaluskan dengan blender sampai menjadi bubuk kasar.
d. Ekstraksi lidah buaya dilakukan dengan menambahkan pelarut etanol 96%
selama 48 jam dalam maserator.
3.3.4.2 Pembuatan Suspensi Bakteri
a. Bakteri Staphylococcus aureus diambil dari stok menggunakan ose.
b. Kemudian bakteri dicampurkan dengan larutan salin fisiologis 0,9% dan di homogenkan.
c. Kekeruhan disesuaikan dengan standar turbiditas McFarland 0,5 ( 0,05 ml BaCl2 konsentrasi 1% dicampurkan dengan 9,95 ml H2SO4 dengan konsentrasi 1% ) setara dengan jumlah bakteri 1,5 × 108 CFU/ml.
3.3.4.3 Pembuatan Agar Mueller-Hinton
a. Agar Mueller-Hinton cair yang masih panas dituangkan ke dalam cawan sampai tinggi agar 4 mm. Untuk cawan dengan ukuran diameter 10 cm membutuhkan Mueller-Hinton agar cair sebanyak 30 ml.
b. Kemudian homogenisasi dengan cara menggoyangkan cawan.
c. Cawan ditutup dan diamkan sampai mengeras.
3.3.4.4 Persiapan Cakram Ekstrak Etanol Lidah Buaya
Kertas saring yang digunakan adalah Whatman filter paper nomor 1 dengan diameter 5 mm dengan bentuk cakram yang disterilisasikan terlebih dahulu dengan autoklaf. Kemudian ekstrak etanol lidah buaya konsentrasi 100%
dan antibiotik eritromisin diteteskan ke kertas saring, lalu tempatkan diatas media agar Mueller-hinton.
3.3.4.5 Prosedur Uji Sensitivitas Metode Difusi a. Prosedur inokulasi pada media
1) Gunakan cotton swab steril.
2) Cotton swab steril tersebut dicelupkan ke dalam suspensi bakteri.
3) Suspensi yang berlebihan dituangkan dengan cara menekan cotton swab pada dinding tabung.
4) Cotton swab digoreskan ke seluruh permukaan agar sebanyak 2 kali sampai seluruh permukaan homogen.
b. Penempelan Cakram Pada Media
1) Siapkan cakram dengan konsentrasi ekstrak etanol lidah buaya 100% dan eritromisin (kontrol positif).
2) Cakram diletakan di atas media yang telah diinokulasi.
3) Tiap cakram ditekan untuk memastikan kontak dengan permukaan agar secara keseluruhan.
4) Jarak cakram satu dengan lainnya minimal 24 mm.
5) Inkubasi dengan suhu 37oC selama 24 jam pada inkubator.
c. Pembacaan Hasil
1) Setelah diinkubasi, amati zona inhibisi yang akan muncul sebagai area sirkuler berwarna bening yang tidak ditumbuhi bakteri.
2) Diameter dari zona hambat diamati dan diukur dengan satuan milimeter menggunakan jangka sorong.
d. Interpretasi hasil
Sensitif (S): zona hambat lebih besar atau sama dengan kontrol. Apabila zona hambat tes lebih kecil dari kontrol maka perbedaanya tidak lebih dari 3 mm.
Intermediet (I): perbedaan zona hambat antara kontrol dan tes minimal 3
mm.
Resisten (R): tidak terdapat zona hambat.
3.3.5 Skema dan Alur Penelitian
Labolatorium Terpadu Poltekkes Analis Kesehatan Bandung
Biakan bakteri staphylococcus aureus
Pembuatan ekstrak etanol gel lidah buaya
Prosedur uji sensitivitas dengan metode difusi
Interpretasi dan Analisis Data
3.3.6 Tempat dan Waktu Penelitian
Tempat penelitian ini di Poltekkes Bandung pada tahun 2019.
3.3.7 Aspek Etik Penelitian
a. Bakteri yang telah ditentukan harus sesuai standar.
b. setiap prosedur yang dilakukan di labolatorium Poltekkes Bandung untuk biakan bakteri dan uji sensitivitas harus sudah terstandar. Serta labolatorium harus memiliki standar Chemical safety, Fire Safety, Electrical Safety, dan Biosafety yang bisa menjaga peneliti serta laboran dari bahaya kebakaran, bahaya kimia, bahaya tersengat listrik dan bahaya yang ditimbulkan oleh bakteri patogen yang diteliti.
