30
BAB III
METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Rancangan Penelitian
Jenis penelitian yang digunakan merupakan penelitian eksperimental, dilakukan di Laboratorium Kimia Farmasi dan Biologi Farmasi Universitas Pelita Harapan menggunakan metode randomized control-pretest-post-test design.
Penelitin akan dilakukan pada bulan Maret hingga Mei.
3.2 Waktu dan Tempat Penelitian
1. Tempat penelitian:
a. Laboratorium Kimia Farmasi Universitas Pelita Harapan (pembuatan ekstrak dan skrining fitokimia).
b. Laboratorium Biologi Farmasi Universitas Pelita Harapan (pembuatan ekstrak).
c. Laboratorium Farmakologi Universitas Pelita Harapan (pengujian ekstrak).
2. Waktu penelitian: bulan Maret hingga Mei 2022.
3.3 Bahan dan Alat Penelitian
Alat yang dibutuhkan dalam melakukan penelitian adalah adalah timbangan analitik, timbangan hewan, beaker glass, erlenmayer, labu ukur, gelas ukur, pipet ukur, batang pengaduk, alat refluks, spoit oral, spatula, sendok tanduk, blender, sonde, tabung reaksi, pelat tetes, cawan porselen, Nesco multicheck strip test®,
31 rotatory evaporator, oven, dan kandang tikus.
Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah simplisia daun Ketul, etanol 70%, akuades, CMC Na (Carboxymethylcellulose Sodium), lemak sapi, kuning telur burung puyuh, minyak jelantah, PTU (Propiltiourasil), Simvastatin, pakan standar (BR-II), perkamen, kapas, kertas saring, amil alkohol, serbuk Mg, HCl 1%
dan HCl pekat, akuades, pereaksi Dragendorf, pereaksi Mayer, kloroform, ammonia, FeCl3 1%, H2SO4 2 N, dan asam asetat anhidrat.
3.4 Populasi dan Sampel
Populasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit (Mus musculus). Dari populasi mencit yang ada diambil beberapa mencit sebagai sampel.
Mencit yang digunakan berasal dari Yogyakarta. Jumlah mencit yang digunakan dihitung menggunakan rumus Federe(Agustina & Murwani, 2013). Perhitungan banyak sampel yang digunakan adalah sebagai berikut:
(𝑡 − 1)(𝑛 − 1) ≥ 15 (5 − 1)(𝑛 − 1) ≥ 15
4(𝑛 − 1) ≥ 15 4𝑛 − 4 ≥ 15 4𝑛 ≥ 15 + 4
4𝑛 ≥ 19
𝑛 ≥19 4 𝑛 ≥ 4,75~5
32 Dengan t adalah jumlah kelompok perlakuan dan n merupakan banyak sampel yang terdapat dalam tiap kelompok, sehingga total sampel yang dibutuhkan adalah 5 × 5 = 25 sampel. Setiap kelompok dilebihkan 1 ekor untuk cadangan jika terdapat mencit yang sakit atau mati saat perlakuan, sehingga total mencit yang dibutuhkan menjadi 30 mencit. Kelompok yang dimaksud adalah sebagai berikut:
a. Kelompok I : sebagai kontrol negatif b. Kelompok II : sebagai kontrol positif
c. Kelompok III : yang diberi ekstrak dosis I (100 mg/kgBB) d. Kelompok IV : diberi ekstrak dosis II (300 mg/kgBB) e. Kelompok V : diberi ekstrak dosis III (500 mg/kgBB)
Kriteria inklusi untuk sampel yang digunakan adalah semua mencit (Mus musculus) jantan yang memiliki berat badan 20-30 g, berusia tiga bulan. Selain itu, mencit harus dalam keadaan sehat, dan tidak ada cacat atau kelainan. Kriteria eksklusi sampel adalah mencit yang sakit atau mati saat diadaptasikan (Alfiani dkk., 2020).
Sampel yang diujikan terhadap mencit adalah daun Ketul dari daerah Citeureup, Bogor. Kriteria inklusi daun Ketul yang digunakan adalah pucuk daun atau daun yang berwarna hijau muda (Wisnuwati, 2018). Kriteria eksklusi daun Ketul yang digunakan adalah daun yang busuk, berlubang, berwarna kuning saat dipetik.
33 3.5 Variabel
Variabel bebas : Ekstrak etanol 70% daun Ketul
Variabel terikat : Efek ekstrak sebagai antihiperlipidemia pada mencit
3.6 Metode Kerja
3.6.1 Determinasi Tumbuhan dan Izin Kode Etik
Determinasi akan dilakukan di Pusat Penelitian Biologi LIPI yang berlokasi di Jl. Raya Jakarta-Bogor No. KM 46 dan izin kode etik akan dilakukan di Universitas Pelita Harapan. Deteminasi tumbuhan dan izin kode etik dilakukan sebelum melakukan penelitian untuk menjamin tanaman Ketul (Bidens pilosa L.) yang digunakan sesuai dan benar, serta untuk menjamin kesejahteraan hewan uji.
3.6.2 Pembuatan Simplisia
Cara pembuatan simplisia daun Ketul adalah dengan mengumpulkan daun yang telah dipetik kemudian ditimbang sebanyak 10 kg, lalu dilakukan sortasi basah untuk memisahkan daun dari pengotor. Daun sudah disortasi kemudian dicuci di bawah air mengalir. Daun yang telah dicuci kemudian dikeringkan menggunakan oven bersuhu 50o C selama 4 jam. Daun yang telah kering kemudian disortasi kering untuk memisahkan simplisia dari pengotor, lalu ditimbang. Simplisia kemudian dibuat serbuk dengan cara dihalurkan menggunakan Miyako® blender.
Serbuk simplisia kemudian ditimbang.
34 3.6.3 Skrining Fitokimia
Skrining fitokimia yang dilakukan terhadap simplisia adalah uji alkaloid, flavonoid, saponin, steroid, triterpenoid, dan tanin. Setiap uji dilakukan secara duplo. Masing-masing metode adalah sebagai berikut (Harborne, 1998):
a. Alkaloid
Ekstrak ditimbang sebanyak 40 mg, kemudian ditambahkan dengan 2 mL kloroform dan 2 mL ammonia, lalu disaring. Filtrat kemudian ditambahakan dengan H2SO4 pekat sebanyak 3-5 tetes. Filtrat kemudian dikocok hingga membentuk dua lapisan. Bagian asam kemudian diambil dan diletakkan pada dua tabung reaksi. Pada tabung reaksi kemudian ditambahkan pereaksi Dragendorff dan pereaksi Mayer. Ekstrak positif alkaloid ditandai dengan berubah warna sampel menjadi kuning hingga merah ketika ditambah pereaksi Dragendorff dan berubah warna sampel menjadi putih ketika ditambah pereaksi Mayer.
b. Flavonoid
Identifikasi flavonoid dapat dilakukan dengan penambahan serbuk Mg, HCl pekat, dan amil alkohol. Identifikasi dilakukan dengan 40 mg ekstrak dilarutkan ke dalam 10 mL air yang dipanaskan di atas waterbath, lalu 1 mL ekstrak dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian timbahkan dengan 100 mg serbuk Mg, 1 mL HCl pekat, dan 3 mL amil alkohol, kemudian dikocok kuat. Positif flavonoid ditandai dengan terjadinya perubahan warna sampel menjadi kuning, merah, hingga coklat.
35 c. Saponin
Ekstrak sebanyak 40 mg ditimbang kemudian ditambahkan dengan 10 mL air yang sudah dipanaskan kemudian dikocok selama 1 menit. Pada sampel kemudian ditambahkan dengan 2 tetes HCl 1 N. Positif saponin ditandai dengan terbentuknya busa yang tetap stabil selama ± 7 menit.
d. Tanin
Ekstrak sebanyak 40 mg yang sudah dilarutkan dengan air yang dipanaskan di atas waterbath diambil sebanyak 1 mL diletakkan dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan dengan FeCl3 1% sebanyak 2 tetes. Positif tanin ditandai dengan terjadinya perubahan warna ekstrak menjadi hijau kehitaman.
e. Triterpenoid dan Steroid
Ekstrak ditimbang sebanyak 40 mg kemudian ditambahkan dengan asam asetat glasial sebanyak 10 tetes, lalu ditambahkan H2SO4 sebanyak 2 tetes. Campuran kemudian dikocok dan didiamkan selama beberapa menit.
Positif triterpenoid ditandai dengan terjadinya perubahan warna campuran menjadi merah keunguan atau coklat keunguan dan positif steroid ditandai dengan terjadi perubahan warna menjadi biru kehijauan atau merah kecoklatan (Habibi dkk., 2018).
f. Fenol
Ekstrak ditimbang sebanyak 40 mg, kemudian ditambahkan dengan 2 mL kloroform dan 2 mL ammonia, lalu disaring. Filtrat kemudian ditambahakan dengan FeCl3 1%. Positif fenol ditandai dengan berubahnya larutan menjadi hijau hingga biru atau hitam.
36 3.6.4 Ekstraksi
Metode ekstraksi yang digunakan adalah metode refluks menggunakan pelarut etanol 70%. Ekstraksi dilakukan dengan cara sebanyak 65 g simplisia ditimbang kemudian diletakkan dalam labu alas bulat kemudian ditambahkan dengan etanol 70% sebanyak 2
⁄3 bagian labu (tersedia labu 500 mL, sehingga etanol 70% yang dibutuhkan ± 330 mL). Magnetic stirrer kemudian dimasukkan ke dalam labu alas bulat. Kondensor kemudian dipasang pada alat refluks, heating mantle dinyalakan dan diatur dengan suhu 70oC. Simplisia diekstraksi hingga tetesan pelarut yang dihasilkan tidak berwarna, dilakukan tiga sampai lima kali pengulangan. Ekstrak kemudian dimasukkan ke dalam rotary evaporator untuk menghilangkan pelarut. Ekstrak kemudian dimasukkan ke dalam oven untuk menghilangkan pelarut yang masih tersisa.
3.6.5 Pembuatan Pakan Hewan Uji
Pakan yang ingin dibuat sebanyak 2 kg. Disiapkan alat dan bahan yang dibutuhkan, seperti oven, timbangan analitik, sendok pengaduk, baskom, 10%
lemak sapi, 20% kuning telur puyuh, 20% minyak jelantah, 50% pakan standar BR- II. Cara pembuatannya adalah lemak sapi dicairkan, kemudian dicampurkan dengan kuning telur, minyak jelantah, dan pakan standar BR hingga homogen kemudian dibentuk bulat-bulat kecil, lalu dipanaskan menggunakan oven hingga kering (Guanawan, 2018).
37 3.6.6 Pembuatan Larutan Uji
1. Larutan CMC Na 0,5% b/v
Sebanyak 0,25 g CMC Na ditimbang kemudian dilarutkan dalam 50 mL akuades yang telah dipanaskan dengan suhu 70oC sedikit-sedikit, kemudian disimpan dalam lemari pendingin.
2. Larutan PTU 0,02% b/v
Larutan PTU 0,02% yang akan dibuat adalah sebanyak 50 mL. PTU sebanyak 10 mg ditimbang kemudian dilarutkan dengan 50 mL akuades hingga larut, lalu dimasukkan dalam wadah. Perhitungan dosis PTU dapat dilihat pada Lampiran B.
3. Suspensi Simvastatin
Tablet Simvastatin digerus kemudian ditimbang sebanyak 46,103 mg kemudian dicampurkan dengan larutan CMC Na sekitar 10 mL, digerus hingga larut homogen, kemudian ditambahkan dengan akuades hingga 100 mL. Perhitungan dapat dilihat pada Lampiran B.
4. Larutan Ekstrak
Dosis ekstrak yang digunakan adalah 100 mg/kgBB, 300 mg/kgBB, 500 mg/kgBB. Tiap dosis ekstrak dilarutkan dengan akuades hingga 100 mL.
Perhitungan dosis dapat dilihat pada Lampiran B.
38 3.6.7 Perlakuan Hewan Uji
Metode ini mengacu pada Muhlishah dkk (2016) dengan sedikit modifikasi pada dosis. Dosis ekstrak yang digunakan pada sumber adalah 100 mg/kgBB, 250 mg/kgBB, dan 500 mg/kgBB.
Mencit (Mus musculus) dibagi menjadi 5 kelompok, yaitu Kelompok I sebagai kontrol negatif yang akan diberikan larutan CMC Na, Kelompok II sebagai kontrol positif yang akan diberikan Simvastatin, Kelompok III sebagai kelompok yang diberikan ekstrak etanol 70% daun Ketul dengan dosis 100 mg/ kgBB, Kelompok IV sebagai kelompok yang diberikan ekstrak etanol 70% daun Ketul dengan dosis 300 mg/kgBB, dan Kelompok V sebagai kelompok yang diberikan ekstrak etanol 70% daun Ketul dengan dosis 500 mg/kgBB mencit. Mencit kemudian dimasukkan ke dalam kandang secara individual dan diaklimatisasi selama 7 hari. Mencit dipuasakan terlebih dahulu selama 12 jam sebelum dilakukan pengecekan kadar kolesterol. Setiap kelompok mencit kemudian dicek kadar kolesterol awal menggunakan strip- test.
Setiap kelompok kemudian diberikan pakan tinggi kolesterol sebanyak 1/10 BB mencit dan PTU 0,02% yang diberikan secara oral yang diberikan dalam volume 0,2 mL dari hari pertama hingga hari ke-14 untuk meningkatkan kadar kolesterol mencit. Pada tiap kelompok kemudian dilakukan pengecekan pada hari ke-7 dan ke-14. Mencit dikatakan memenuhi kriteria hiperlipidemia jika kadar kolesterol lebih dari 130 mg/dL.
Pada hari ke-15 hingga hari ke-28, setiap kelompok diberikan sampel kontrol negatif, kontrol positif, dan ekstrak etanol 70% daun Ketul. Pengukuran
39 kadar kolesterol mencit kemudian dilakukan pada hari ke-21 dan ke-28.
Pengecekan kadar kolesterol mencit dilakukan dengan cara mencit diletakkan dalam restrainer kemudian pada bagian ekor dijepitkan pada penutup. Ekor mencit kemudian diurut untuk memperbanyak darah pada bagian ujung. Ekor mencit kemudian disayat sedikit menggunakan scalpel untuk mengambil darah mencit. Pada ekor mencit kemudian diurut hingga darah keluar, lalu dimasukkan pada Nesco® strip test yang telah terpasang pada alat Nesco GCU multicheck®.
Hasil pengukuran kolesterol akan keluar setelah 150 detik.
3.7 Analisis Data
Data kadar kolesterol total yang didapatkan dari hasil pengukuran kemudian dihitung persentase penurunannya dengan rumus (Anggraini & Nabillah, 2018):
Kadar setelah induksi − Kadar setelah perlakuan
Kadar setelah induksi × 100%
Data persentase penurunan kadar kolesterol total yang didapatkan kemudian dilakukan uji normalitas dengan derajat kepercayaan 95% untuk mengetahui data yang didapatkan terdistribusi normal atau tidak. Data persentase penurunan kadar kolesterol total yang didapatkan kemudian dianalisis menggunakan IBM SPSS Statistics 25. Metode analisis yang digunakan jika data terdistribusi normal adalah uji ANOVA dan dilanjutkan dengan uji post-hoc Tukey jika hasil ANOVA memiliki perbedaan yang signifikan (α < 0,05). Jika data tidak terdistribusi normal, maka digunakan metode Kruskal-Wallis.
