1
ISOLASI DAN UJI TOKSISITAS SENYAWA METABOLIT SEKUNDER EKSTRAK n-HEKSANA DAUN NONA MAKAN SIRIH
(Clerodendrum thomsoniae Balf.f)
Sri Meila Hayati1*, Hilwan Yuda Teruna2
1Mahasiswa Program S1 Kimia
2Dosen Bidang Kimia Organik Bahan Alam Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Riau
Kampus Binawidya, Pekanbaru, 28293, Indonesia
*[email protected] ABSTRACT
Nona makan sirih (Clerodenrum thomsoniae) is a medicinal plant from the family Lamiaceae, and the genus Clerodendrum.It is usually grows as an ornamental plant.
This study aimed to isolate and characterize the pure compound from the n-hexane extract of the nona makan sirih leaf plant (Clerodendrum thomsoniae) and to analyze a its toxicity of the isolated compound and n-hexane extract of the nona makan sirih leaf (Clerodendrum thomsoniae) using the brine shrimp lethality test (BSLT) method.Nona makan sirih was macerated using methanol as a solvent and then fractionation using n-hexane. The separation of compounds was carried out by vacuum liquid chromatography (VLC) and obtained 12 fractions. In fraction 2, there was one spot on the TLC plate which indicated this fraction was pure and coded as CT-H2.The purity test of CT-H2 was analyzed by thin layer chromatography test (TLC) with several eluents mixtures. CT-H2 were characterized using a FT-IR spectrophotometer. The results of the phytochemical characterization and analysis of the CT-H2 compound showed some characters of terpenoid. Toxicity test showed the LC50 values of CT-H2
and n-hexane fraction were 254.22 µg/mL and 209.79 µg/mL, respectively. The LC50
value <1000 µg/mL indicates that the n-hexane fraction and CT-H2 have potential activity be developed as a cytotoxic agent.
Keyword : Clerodendrum thomsoniae, cytotoxic, phytochemical ABSTRAK
Nona makan sirih (Clerodenrum thomsoniae) merupakan tanaman obat dari famili Lamiaceae, dan genus Clerodendrum. Tanaman ini biasanya ditanam sebagai tanaman hias. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengkarakterisasi senyawa murni yang diperoleh dari ekstrak n-heksana tanaman daun nona makan sirih (C. thomsoniae) dan melakukan uji toksisitas terhadap senyawa hasil isolasi dan ekstrak n-heksana tanaman daun nona makan sirih (C. thomsoniae) menggunakan metode brine shrimp lethality test (BSLT). Tanaman nona makan sirih di maserasi menggunakan pelarut
2 metanol dan kemudian difraksinasi menggunakan pelarut n-heksana. Pemisahan senyawa dilakukan dengan vacuum liquid cromatograpy (VLC) dan didapatkan 12 fraksi. Pada fraksi 2 terdapat satu noda pada plat KLT yang menandakan bahwa fraksi 2 telah murni dan diberi kode senyawa CT-H2. Uji kemurnian senyawa CT-H2 dilakukan analisis uji KLT dengan perbandingan beberapa eluen. Senyawa CT-H2 dikarakterisasi menggunakan spektrofotometer FT-IR. Hasil karakterisasi dan analisis fitokimia terhadap senyawa CT-H2 diduga sebagai senyawa terpenoid. Pengujian toksisitas dilakukan dengan metode BSLT. Berdasarkan pengujian yang dilakukan ekstrak n-heksana dan senyawa CT-H2 menunjukkan nilai LC50 sebesar 254,22 µg/mL dan 209,79 µg/mL. Nilai LC50 <1000 µg/mL menunjukkan bahwa ekstrak n-heksana dan senyawa CT-H2 memiliki potensi sebagai agen toksisitas.
Kata kunci : Clerodendrum thomsoniae, fitokimia, toksisitas
PENDAHULUAN
Tanaman telah digunakan sebagai obat untuk mengobati beberapa penyakit.
Menurut Organisasi Kesehatan Dunia (WHO), berbagai obat diperoleh dari tanaman obat yang berbeda dan sekitar 80% populasi negara berkembang di dunia bergantung pada obat tradisional untuk kebutuhan perawatan kesehatan (Martial et al., 2019).Salah satu tanaman yang dapat dijadikan sebagai tanaman obat yaitu Clerodendrum thomsoniae atau sering disebut dengan nona makan sirih. Tumbuhan ini termasuk ke dalam famili Lamiaceae dengan genus Clerodendrum (Moluenke, 1985).
Nona makan sirih (Gambar.1) merupakan tanaman merambat yang berasal dari daerah tropis di Afrika Barat. Tanaman ini biasanya ditanam sebagai tanaman hias yang tumbuh merambat dengan tinggi 2-5 m. Daun dari tanaman ini mengandung metabolit sekunder alkaloid, flavonoid, tanin,
saponin dan fenolik
(Halilah et al., 2017).
Beberapa penelitian sebelumnya melaporkan bahwa spesies-spesies dari genus Clerodendrum menghasilkan metabolit sekunder yang memiliki potensi sebagai agen antidiabetes, antioksidan, antimikroba, antiinflamasi antihipertensi, antikanker, antitumor dan antiasma (Shrivastava et al., 2007).
Muhammed Ashraf et al., (2021) melaporkan bahwa tanaman ini memiliki aktivitas toksisitas yang signifikan terhadap sel kanker.
Berdasarkan uraian diatas maka perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengisolasi dan menguji sifat toksisitas dari daun nona makan sirih. Pada penelitian ini diharapkan dapat memperoleh senyawa yang teridentifikasi berdasarkan struktur dan aktivitas toksisitasnya.
3 Gambar 1.Tanaman Nona Makan Sirih
(Dok. pribadi).
METODE PENELITIAN a. Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah seperangkat alat destilasi, neraca analitik, satu unit rotary evaporator (Heidolph, 2000), kolom VLC, lampu UV (Cole Permer λ=254 nm dan 366 nm), spektrofotometer FT-IR (Shimadzu, IR Prestige-21) dan peralatan gelas laboratorium lainnya yang disesuaikan dengan prosedur kerja.
Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah daun nona makan sirih. Bahan yang digunakan adalah n-heksana, etil asetat, metanol, silika gel 60 GF254, plat KLT GF254, kertas saring, reagen fitokimia, DMSO, larva udang (Artemia salina L) dan air laut.
b. Tahapan Penelitian
Tahapan dalam penelitian adalah pengambilan dan preparasi sampel daun nona makan sirih, uji fitokimia, ekstraksi, isolasi senyawa dengan metode VLC, uji kemurnian dan karakterisasi senyawa, dan uji aktivitas toksisitas dengan metode BSLT.
c. Ekstraksi
Sampel daun nona makan sirih yang telah dihaluskan dimaserasi selama 3 x 24 jam menggunakan pelarut metanol. Proses maserasi dilakukan dengan 5 kali pengulangan. Hasil maserasi diuapkan menggunakan rotary evaporator (RE) dengan suhu 40oC sehingga dihasilkan ekstrak kental metanol. Ekstrak kental metanol sebanyak 150 gram difraksinasi menggunakan 500 mL n-heksana selama 1 x 24 jam kemudian dipisahkan endapan dengan filtratnya. Endapan yang diperoleh didapatkan ekstrak n-heksana.
d. Uji Fitokimia
Uji fitokimia dilakukan terhadap daun nona makan sesuai dengan literatur (Harbone, 1998).
e. Pemisahan dengan Vacuum Liquid Chromatography (VLC)
Ekstrak kental n-heksana sebanyak 20 gram diambil dan dilakukan preadsorpsi menggunakan silika gel 60 GF254. Pengisian silika gel ke dalam kolom dilakukan secara bertahap dengan keadaan vakum dihidupkan. Pemisahan komponen dilakukan dengan sistem gradien elusi yang dimulai dari n- heksana 100%, n-heksana:etil asetat (8:2, 6:4, 4:6 dan 2:8) kemudian etil asetat 100% dan selanjutnya etil asetat:metanol (9:1, 8:2, 7:3, 6:4 dan 1:1) hingga metanol 100% dengan kenaikan kepolaran 20%. Hasil pemisahan ditampung ke dalam botol kemudian diuapkan menggunakan alat rotary evaporator (RE).
4 f. Uji Kemurnian
Hasil pemisahan VLC yang membentuk endapan atau kristal dilakukan uji kemurnian dengan menggunakan KLT. Senyawa yang telah murni ditandai dengan hanya ada satu noda pada plat KLT dengan Rf berkisar antara 0,2 - 0,8.
g. Identifikasi Senyawa
Identifikasi senyawa dilakukan menggunakan pengujian fitokimia dan menggunakan spektroskopi FT-IR.
h. Uji Aktivitas Toksisitas
1. Pembiakan Larva Artemia salina Leach
Larva udang A. salina dibiakkan dalam wadah yang berisi air laut. Wadah pembiakkan dibagi menjadi dua bagian yaitu zona gelap dan zona terang. Telur yang akan dibiakkan diletakkan dibagian wadah yang tidak terkena cahaya lampu dan bagian lain diberi cahaya lampu dan aerasi. Telur dibiakkan selama 48 jam sehingga menetas menjadi larva dan siap untuk digunakan sebagai hewan uji.
2. Uji Toksisitas dengan Metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT)
Sampel ekstrak masing-masing dibuat dalam konsentrasi larutan 10000, 1000, 100, 10 dan 1 µg/mL. Sampel CT-H2
dibuat dalam konsentrasi larutan 1000, 100, 10 dan 1 µg/mL. Selanjutnya, setiap vial dari berbagai konsentrasi dibiarkan kering dan ditambahkan 50 µL DMSO beserta air laut. Sebanyak 10 ekor larva udang yang sudah disiapkan dimasukkan ke dalam vial uji dan ditambah air laut hingga batas kalibrasi. Tingkat toksisitas diukur dari persen kematian larva.
Pengujian ini dilakukan sebanyak tiga kali pengulangan.
3. Analisis Data Toksisitas
Aktivitas toksisitas senyawa terhadap larva Artemia salina ditentukan dengan melakukan perhitungan statistik menggunakan analisis probit. Analisis probit dapat ditentukan berdasarkan tabel nilai probit, nilai probit yang diketahui dimasukkan dalam persamaan regresi, sehingga diperoleh nilai LC50.
HASIL DAN PEMBAHASAN a. Uji Fitokimia
Daun tanaman nona makan sirih diambil dan dilakukan uji fitokimia.
Hasil fitokimia menunjukkan adanya kandungan senyawa metabolit sekunder pada golongan alkaloid, flavonoid, saponin, fenolik dan steroid dan menunjukkan tidak ada kandungan senyawa metabolit sekunder pada golongan terpenoid.
b. Pengambilan Sampel dan Preparasi Sampel
Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah tanaman nona makan sirih yang diambil di kawasan Kota Dumai dan Pulau Rupat, Provinsi Riau. Tanaman daun nona makan sirih diidentifikasi taksonominya di Jurusan Biologi FMIPA, Universitas Riau.
Tanaman nona makan sirih diambil bagian daunnya, kemudian dikeringkan pada suhu ruang. Proses pengeringan ini dilakukan selama ±2 minggu. Sampel daun yang telah kering dihaluskan menggunakan lumpang dan alu hingga menjadi serbuk dan diperoleh sampel halus sebanyak 2,2 kg. Sampel yang
5 telah halus kemudian diekstraksi dengan
metode maserasi.
c. Ekstraksi
Metode ekstraksi yang digunakan adalah metode maserasi.Maserasi adalah salah satu metode ekstraksi dengan proses perendaman sampel untuk menarik komponen yang diinginkan menggunakan pelarut pada suhu ruang.
Hasil proses maserasi dilakukan penyaringan menggunakan kertas saring untuk mendapatkan ekstrak kasar metanol. Ekstrak kasar metanol kemudian diuapkan dengan alat rotary evaporator (RE) pada suhu ±40oC dan didapatkan ekstrak kental metanol sebenyak 324 gram. Ekstrak kental metanol selanjutnya difraksinasi menggunakan 500 mL n-heksana selama 1 x 24 jam lalu dipisahkan endapan dengan filtratnya. Endapan yang diperoleh didapatkan ekstrak kental n-heksana sebanyak 35,95 gram.
d. Pemisahan dan Uji Kemurnian Pemisahan ekstrak n-heksana dilakukan dengan menggunakan vacuum liquid chromatograpy (VLC). Ekstrak n-heksana sebanyak 20 gram dipreadsorbsi menggunakan silika gel 60 GF254, preadsorbsi dilakukan agar silika gel dapat menjerap senyawa secara merata dan homogen dengan fasa diam.
Fasa gerak yang digunakan adalah pelarut n-heksana, etil asetat, dan metanol dengan volume 300 mL.
Gradien elusi dilakukan dengan menaikkan kepolaran dari pelarut non polar hingga pelarut polar. Hasil pemisahan menggunakan VLC didapatkan 12 fraksi. Kemudian 12 fraksi
dilakukan analisis uji KLT untuk melihat noda.berdasarkan analisis uji KLT pada fraksi 2 terdapat satu noda, hal ini menandakan bahwa fraksi 2 sudah murni, kemudian fraksi 2 diberi kode senyawa CT-H2. Hasil KLT pemisahan dengan VLC dapat dilihat pada Gambar 2. Pada senyawa CT-H2 didapatkan berbentuk karamel berwarna orange dengan bau khas obat dilakukan uji kemurnian dengan uji KLT.
Gambar 2. Kromatogram eluen n-heksana:etil asetat (8:2) dengan panjang gelombang 254 nm dan panjang gelombang 366 nm.
e. Identifikasi Senyawa
Pengujian fitokimia senyawa CT-H2 dilakukan uji Lieberman- Burchard (LB) menghasilkan warna merah kecokletan. Hasil uji fitokimia senyawa CT-H2 dapat dilihat pada Gambar 3. Dari hasil fitokimia senyawa menandakan bahwa senyawa CT-H2
merupakan senyawa golongan terpenoid.
Gambar 3. Hasil uji fitokimia senyawa CT-H2 menggunakan uji Lieberman- Burchard (LB).
6 Gambar 4. Spektrum FT-IR senyawa CT-H2
Pada karakterisasi senyawa menggunakan spektroskopi FT-IR untuk melihat gugus fungsi yang ada pada senyawa tersebut. Hasil spektrum IR memperlihatkan bahwa senyawa CT-H2
terdapat gugus C-H alifatik alkana menunjukkan serapan pada bilangan gelombang 2953 cm-1, serapan pada bilangan gelombang 1461 cm-1 pada gugus (C=C), selain itu ada gugus C-O alkohol pada daerah bilangan gelombang 1167 cm-1 dan pada daerah bilangan gelombang 720 cm-1 terdapat C-H aromatik. Berdasarkan hasil analisis
spektrum FT-IR senyawa
CT-H2 diduga sebagai senyawa terpenoid. Hasil spektrum FT-IR dapat dilihat pada Gambar 4.
d. Uji Toksisitas Menggunakan Metode BSLT
Pada ekstrak n-heksana dan senyawa CT-H2 dilakukan uji aktivitas toksisitas menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) dengan menggunakan larva Artemia salina Leach sebagai hewan uji. Larva Artemia salina Leach digunakan sebagai hewan uji karena memiliki struktur RNA polimerase II yang sangat mirip dengan RNA polimerase II dari struktur kanker manusia yaitu sel HeLa (sel kanker rahim) (Bagshaw, 1976). Hasil uji toksisitas yang dilakukan pada ekstrak n-heksana dan senyawa CT-H2 daun nona makan sirih menunjukkan nilai LC50 sebesar 102,38 µg/mL dan 209,79 µg/mL, sehingga dapat dikatakan ekstrak n-heksana dan senyawa CT-H2
C-H aromatik C-O
C=C C-H Alifatik
7 daun nona makan sirih memiliki potensi
toksisitas. Hal ini merujuk dari pernyataan Meyer et al (1982), apabila nilai LC50 <1000 µg/mL tersebut bersifat toksik dan nilai LC50 >1000 µg/mL bersifat tidak toksik. Tanaman nona makan sirih diduga memiliki metabolit sekunder golongan terpenoid dimana pada kadar tertentu memiliki potensi toksisitas serta dapat menyebabkan kematian pada larva Artemia salina Leach. Hal ini didasarkan pada penelitian (Indriyani et al., 2006) yang menyatakan bahawa esktrak daun pecut kuda bersifat toksik terhadap larva A.
salina Leach dan senyawa yang terkandung di dalamnya adalah senyawa terpenoid. Senyawa terpenoid sebagian besar memilki struktur lipofilik yang menyebabkan kematian sel. Selain itu, senyawa terpenoid dikenal sebagai salah satu golongan senyawa kimia dalam tanaman yang memiliki aktivitas antikanker.
KESIMPULAN
Senyawa metabolit sekunder dari ekstrak n-heksana daun nona makan sirih hasil isolasi adalah senyawa CT-H2. Senyawa CT-H2 berbentuk karamel berwarna orange yang memiliki bau khas obat diduga merupakan senyawa golongan terpenoid. Hasil uji aktivitas toksisitas menggunakan metode BSLT senyawa CT-H2 dan ekstrak n-heksana dari daun nona makan sirih memiliki potensi toksisitas dengan nilai LC50 sebesar 209,79 µg/mL dan 102,38 µg/mL.
DAFTAR PUSTAKA
Bagshaw, J. C. 1976. DNA-dependent RNA polymerases from Artemia Salina, submit structure of polymerase II. Nucleic Acid Research. 3(6): 1449-1461.
Baud, G. S., Sangi, M. S dan Koleangan, H. S. J. 2014. Analisis senyawa metabolit sekunder dan uji toksisitas ekstrak etanol batang tumbuhan patah tulang (Euphorbia tirucalli l.) dengan metode Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). Jurnal Ilmiah Sains. 14(2):
106-112.
Halilah, N, A., Lizma, F., dan Adam, M, R. 2017. Standarisasi ekstrak daun nona makan sirih (Clerodendrum x Speciosum dombrain). Jurnal Mulawarman Pharmaceutical Conference. 36-40.
Harbone, J. B. 1984. Phytochemical Methods. Guide to Modern Techniques of Plant Analysis.
London: Chapmann and hall London.
Harbone, J. B. 1998. Phytochemical Methods. Guide to Modern Techniques of Plant Analysis 3rd Edition. Springer, Netherlands.
Indriyani, L., Hartanti, S., dan Lydia, S.
2006. Skrining fitokimia dan uji toksisitas ekstrak daun pecut kuda (Stachytarpheta jamaicensis L, Vahl) terhadap larva udang Artemia salina Leach. Berk. Penel. Hayati, 12 : 57- 61.
Martial, D, E., Mang, Y, D., Sokeng, D, S., Njintang, Y, N. 2019.
Hypolipidemic and antioxidant activity of aqueous extract of Clerodendrum thomsoniae Linn.
8 (Verbenaceae) leaves in albino rats,
Rattus norvegicus (Muridae). Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry. 9(1): 595-202.
Meyer, B. N., Ferrigni, N. R., Putnam, J.
E., Jacobsen, L. B., Nichols, D. E dan McLaughlin, J.L. 1982. Brine Shrimp: A Convenient General Bioassay for Active Plant Constituents. Journal of Medicinal Plant Research. 45: 31-34.
Moluenke, H. N. 1985. Notes On The Genus Clerodendrum Verbenaceae IV. Phytology. 57: 334–365.
Muhammed Ashraf, V. K., Kalaichelvan, V. K., Venkatachalam, V. V., &
Ragunathan, R. 2021. Evaluation of in vitro cytotoxic activity of different solvent extracts of Clerodendrum thomsoniae Balf.f and its active fractions on different cancer cell lines. Future Journal of Pharmaceutical Sciences. 7(50): 1-9.
Shrivastava, N. dan Patel, T. 2007.
Clerodendrum and Heatlhcare : An Overview. Medicinal and Aromatic Plant Science and Biotechnology.
1(1):142-150.
