JURNAL PRAKTIKUM BIOKIMIA ISOLASI DNA EPHITELIAL MULUT
Disusun Oleh
Nama : Zesi Nur Albaina Kelas : KC2022
NIM : 22030234118
JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS NEGERI SURABAYA
2024
A. Judul Percobaan
Isolasi DNA Ephitelial Mulut B. Hari / Tanggal Percobaan
Rabu / 28 Februari 2024 pukul 13.00 C. Selesai Percobaan
Rabu / 28 Februari 2024 pukul 18.00 D. Tujuan Percobaan
Mampu mengerjakan isolasi DNA sesuai prosedur, dengan sampel DNA diambil dari sel ephitelial mulut
E. Dasar Teori
1. DNA (Deoxyribonucleic Acid)
Deoxyribonucleic acid (DNA) merupakan polinukleotida untai ganda yang memiliki karakteristik komponen penyusun antara lain gula deoksiribosa, gugus fosfat dan basa nitrogen (adenin, guanin, timin dan sitosin). Untai DNA tersusun dari rangkaian nukleotida yang terhubung melalui ikatan fosfodiester yang terbentuk diantara gula pentosa dan gugus fosfat. Sedangkan, untai ganda DNA terhubung melalui ikatan hidrogen yang terbentuk diantara pasangan basa nitrogen. Pasangan basa nitrogen pada DNA meliputi adenin dan timin (dua ikatan hidrogen) serta guanin dan sitosin (tiga ikatan hidrogen). Satu putaran lengkap untai DNA terdiri dari sepuluh bp (base pairs / pasangan basa) sepanjang 34Å atau setara dengan 3,4 nm (Nur’aini, 2019).
Struktur DNA pertama kali diungkap oleh James Watson dan Franson Crick pada tahun 1953 berdasarkan atas foto difraksi sinar yang dibuat oleh Rosalind Franklin dan Maurice Wilkins. Berdasarkan atas data yang diperoleh Watson dan Crick membuat struktrur DNA yang disebut untai ganda (double helix). Untai ganda DNA tersusun oleh dua rantai polinukleotida yang terpilin. Kedua rantai tersebut berikatan dengan adanya ikatan hidrogen antara basa adenin dengan timin sebanyak dua ikatan dan antara guanine dan sitosin sebanyak tiga ikatan (Lehninger, 1982).
Gambar 1. Struktur untai ganda DNA (Alberts et al., 2014) Seiring berajalannya waktu, bentuk DNA lain seperti DNA A dan DNA Z juga diajukan. Namun, struktur DNA B merupakan struktur yang paling umum ditemukan di dalam sel. Untai ganda DNA, memiliki orientasi antiparalel yaitu terdiri dari untai ujung 5’ ke ujung 3’ (5’→3’) dan untai ujung 3’ ke ujung 5’ (3’→5) yang berpasangan (Nelson dan Cox, 2008).
2. Isolasi DNA
DNA dari berbagai organisme bisa diisolasi. Isolasi DNA dapat dilakukan melalui tiga tahapan yaitu lisis (pemecahan dinding sel), ekstraksi DNA, dan presipitasi DNA. Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini karena danya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA.
Proses isolasi DNA adalah proses awal sebelum melakukan rekayasa genetika. DNA genom meliputi gen dan intergen. DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida. DNA dapat mengalami denaturasi dan renaturasi serta diisolasi untuk dipelajari (Suryo, 2004 dalam Al Ikhtisot, 2018).
Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan prepitasi.
1) Sentrifugasi
Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada didasar (pellet), sedangkan substansi yang lebih ringan akan berada di atas (supernatant). Pellet yang dihasilkan merupakan sel jaringan yang telah mengendap sedangkan supernatannya adalah sisa komponen protein/lipopolisakarida dari dinding sel bakteri. DNA yang dihasilkan dalam proses ini biasa disebut sebagai DNA templat (Lio dkk., 2019)
2) Presipitasi
Menurut tim dosen kimia (2018) pada presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran. Langkah-langkah isolasi DNA:
a) Pengumpulan Sel-sel
Sampel dari satu individu didapat dengan cara berkumur menggunakan 10 ml aquades, air mineral, dan larutan isotonik selama 1 menit. Sampel yang didapat dimasukkan ke gelas kimia.
b) Pemecahan sel (Lisis sel) dan Pencernaan Protein
Sel yang berasal dari suspensi yang dipekatkan diperoleh dengan cara mensentrifuge 1000 μL sampel air kumur hingga terpisah antara sel dan supernatan, lalu supernatan dibuang dan dilakukan pengulangan sebanyak dua kali. Selanjutnya ditambah 1 ml larutan tris-EDTA kemudian divortex (lisis).
c) Pengendapan DNA
Sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambah 0,1 mL NaCl 2,5 M, Diaduk dengan membolak balikkan tabung, Ditambah 1 mL etanol dingin tetes demi tetes (20 tetes), Dibiarkan selama 5 menit. Nantinya akan terbentuk benang-benang putih.
3. Ephitelial Mulut
DNA dapat diperoleh dari sel epitel (Trost et al., 2019). Salah satu sumber sel epitel adalah saliva. Saliva adalah cairan tubuh yang berasal
dari kelenjar ludah untuk homeostasis rongga mulut. Saliva melindungi mukosa mulut dari asam, baik yang berasal dari makanan maupun dari sisa makanan yang dimuntahkan (Dawes et al., 2015). Saliva utuh (whole saliva) berasal dari kelenjar ludah mayor, kelenjar ludah minor, cairan krevikular gingiva, sekret hidung, serum dan darah dari luka di mulut, bakteri, virus, jamur, sel epitel, komponen seluler lain, dan sisa makanan Saliva mengandung 94-99% air dengan komposisi dan ekskresi yang tergantung pada umur, jenis kelamin, dan faktor stimulasi. Pada orang sehat, produksi saliva sekitar 600 mL per hari dengan rata-rata 0,3-0,4 mL per menit (Chojnowska et al., 2018; Roblegg, Coughran and Sirjani, 2019;
Vila et al., 2019).
4. Spektofotometri UV-VIS
Spektrofotometri adalah suatu metode analisa instrumental yang didasarkan pada interaksi radiasi elektromagnetik dengan materi.
Sedangkan Spektrofotometri UV-Vis adalah metode analisis dengan menggunakan radiasi UV (ultra violet) dan Vis (visible / tampak). Pada metode ini, larutan sampek yang menyerap radiasi elektromagnetik (REM) dari sumber yang cocok, dan jumlah yang diserap berhubungan dengan konsentrasi analit dalam larutan sampel. Kemudian unruk spektrofotometer adalah alat atau instrumen yang digunakan untuk mengukur jumlah cahaya yang diserap
Konsentrasi DNA diukur melalui spektrofotometer yang didasarkan pada prinsip penyerapan sinar ultraviolet oleh nukleotida dan protein dalam larutan. Penyerapan sinar UV oleh DNA dicapai pada panjang gelombang 260 nm, sedangkan penyerapan protein dicapai pada panjang gelombang 280 nm. Pada panjang gelombang 260 nm, apabila optical density (OD260) sama dengan 1, maka konsentrasi molekul DNA setara 50 ug ml-1 (untuk DNA heliks ganda) 40 ug ml-1 (untuk RNA) dan 20 ug ml-1 (untuk oligonukleotida) (Murtiyaningsih, 2017).
Pada umumnya terdapat dua tipe instrumen spektrofotometer, yaitu single-beam dan double-beam. Single-beam instrument dapat digunakan untuk analisa kuantitatif dengan mengukur absorbansi pada panjang
gelombang tunggal. Single-beam instrument mempunyai beberapa keuntungan yaitu sederhana, harganya murah, dan mengurangi biaya yang ada merupakan keuntungan yang nyata. Beberapa instrumen menghasilkan single-beam instrument untuk pengukuran sinar ultra violet dan sinar tampak. Panjang gelombang paling rendah adalah 190 sampai 210 nm dan paling tinggi adalah 800 sampai 1000.
Gambar 2. Diagram Alat Spektrofotometri UV-VIS (Single beam) Double-beam dibuat untuk digunakan pada panjang geombang 190 sampai 750 nm. Double-beam instrument mempunyai dua sinar yang dibentuk oleh potongan cermin yang berbentuk V yang disebut pemecah sinar. Sinar pertama melewati larutan blanko dan sinar kedua secara serentak melewati sampel. Sumber sinar polikromatis, untuk sinar UV adalah lampu deuterium, sedangkan sinar Visibel atau sinar tampak adalah lampu wolfram. Monokromator pada spektrometer UV-Vis digunakaan lensa prisma dan filter optik. Sel sampel berupa kuvet yang terbuat dari kuarsa atau gelas dengan lebar yang bervariasi. Detektor berupa detektor foto atau detektor panas atau detektor dioda foto, berfungsi menangkap cahaya yang diteruskan dari sampel dan mengubahnya menjadi arus listrik (Suhartati, 2017).
Gambar 3. Diagram Alat Spektrofotometri UV-VIS (double beam) 5. Isotonik
Sebanyak ± 10 mL larutan isotonik di masukan ke dalam mulut untuk digunakan sebagai berkumur. Hasil bilasan kumur selanjutnya ditampung dalam pot steril dan dilakukan panen sel epitel. Larutan ini berfungsi sebagai media pelarut dan pengikat sel epitel mulut. Isolasi DNA merupakan proses ekstraksi DNA dari berbagai sumber, seperti sel darah, rambut, sperma, jaringan, noda darah, air liur, dan sel epitel (Koentjoro dkk., 2021).
6. Buffer Tris-EDTA
Tris EDTA Buffer adalah campuran antara larutan Tris-HCl dengan EDTA pada konsentrasi tertentu. Untuk mengidentifikasi DNA atau RNA, perlu mengisolasinya. Selama isolasi sistem buffer yang tepat diperlukan untuk menjaga pH reaksi tetap konstan dan melindungi asam nukleat.
Metode isolasi DNA menggunakan lysis buffer merupakan metode isolasi yang menggunakan larutan buffer untuk proses pemecahan selnya.
Fungsi larutan buffer adalah untuk menjaga struktur DNA selama proses lisis dan pemurnian. Pada tahap akhir pemberian buffer TE untuk menjaga DNA terjaga selama penyimpanan (Iqbal dkk., 2016).
7. Aquades
Cara yang dapat dilakukan untuk memisahkan memurnikan DNA tersebut adalah dengan centrifuge colom, dimana pada akhir setelah proses pencucian dengan menggunakan alkohol sehingga sisa garam dan fenol yang terdapat pada sampel akan keluar dan meninggalkan pelet DNA.
Elusi untuk proses penarikan pelet DNA dari spin kolom ini dapat
menggunakan aquades steril atau nukleotida free water (Utaminingsih dkk., 2022).
8. Vortex
Isolasi DNA memiliki tahap penghomogenan dengan vortex mixer berfungsi untuk membantu proses lisis sel, tetapi proses ini mengakibatkan Sebagian DNA akan keluar terpotong-potong atau hancur oleh enzim endonuclease sehingga mengakibatkan smear (sisa dari larutan-larutan yang masih terbawa selama proses isolasi atau juga dapat berupa DNA yang terdegradasi pada proses isolasi) ketika dielektroforesis (Mulyani dkk., 2011).
F. Alat dan Bahan 1. Alat
- Tabung sentrifuge 2 buah
- Tabung reaksi 2 buah
- Gelas kimia 100 mL 3 buah
- Blue tip dan mikropipet 10 buah dan 1 buah
- Gelas ukur 10 mL 1 buah
- Rak tabung reaksi 1 buah
- Vortex 1 buah
- Sentrifuge 1 buah
- Spektrofotometri UV-VIS 1 buah
2. Bahan
- Minuman isotonik 10 mL
- Buffer Tris-EDTA 2 mL
- Larutan NaCl 2,5 M 2 mL
- Etanol dingin 2 mL
- Aquades 100 mL
G. Alur Percobaan
1. Pengumpulan Sel Sel
2. Pemecahan Sel (Lisis Sel) - Diambil sebanyak 10 ml
- Digunakan untuk berkumur selama 1 menit
- Diambil hasil kumur dan ditampung dalam gelas kimia untuk digunakan sebagai sel ephitel isolasi DNA
Larutan Isotonik Aquades
Larutan Sel Ephitel
10 ml larutan sel ephitelial
- Diambil menggunakan mikropipet - Dimasukkan ke dalam tabung sentrifuge - Disentrifuge dengan kecepatan 10.000 rpm
selama 5 menit - didekantasi Endapan
- Ditambahkan 1 ml Buffer Tris-EDTA - Divortex selama 30 detik
Supernatan
Endapan hancur
3. Pengendapan DNA
Reaksi:
1 ml NaCl 2,5 M
- Dimasukkan kedalam tabung sentrifuge
- Dipindahkan semua isi tabung sentrifuge ke tabung reaksi dengan hati-hati agar tidak muncul busa - Ditambahkan 1 ml etanol dingin
- Dibiarkan selama 5 menit
- Diamati hasil DNA yang terbentuk
- Diukur absorbansinya pada panjang gelombang 260 nm DNA seperti benang putih melayang
Nilai Absorbansi
H. Daftar Pustaka
Al Ikhtisot, I. H. (2018). KERAGAMAN GENETIK DNA MIKROSATELIT LOKUS AY287 PADA ITIK LOKAL (Doctoral dissertation, Universitas Mataram).
Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Morgan, D., Raff, M., Roberts, K., &
Walter, P. (2015). Molecular Biology of The Cell (sixth). Garland Science, Taylor & Francis Group, New York.
Chojnowska, S. et al. (2018) ‘Human saliva as a diagnostic material’, Advances in Medical Sciences, 63(1), pp. 185–191.
Dawes, C. et al. (2015) ‘The functions of human saliva: A review sponsored by the World Workshop on Oral Medicine VI’, Archives of Oral Biology, 60(6), pp. 863–874.
Iqbal, M., Buwono, I. D., & Kurniawati, N. (2016). Analisis Perbandingan Metode Isolasi DNA Untuk Deteksi White Spot Syndrome Virus (WSSV) Pada Udang Vaname (Litopenaeus vannamei). Jurnal Perikanan Kelautan, 7(1).
Lehninger AL. (1982). Dasar-Dasar Biokimia Jilid 3. Maggy Thenawijaya, penerjemah. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Principles of Biochemistry.
Lio, T. M. P., & Sugireng, S. (2019). Deteksi Gen Glukokinase pada Remaja di Pesisir Kota Kendari Sulawesi Tenggara. BIOMA: JURNAL BIOLOGI MAKASSAR, 4(2), 183-189.
Mulyani, Y., Purwanto, A., & Nurruhwati, I. (2011). Perbandingan beberapa metode isolasi DNA untuk deteksi dini koi herpes virus (KHV) pada ikan mas (Cyprinus carpio L.). Jurnal Akuatika, 2(1).
Murtiyaningsih, H. (2017). Isolasi DNA genom dan identifikasi kekerabatan genetik nanas menggunakan RAPD (Random Amplified Polimorfic DNA). Agritrop: Jurnal Ilmu-Ilmu Pertanian (Journal of Agricultural Science), 15(1).
Nelson, D. and Cox, M. (2008). Principles of Biochemistry. Fifth. New York:
Sara Tenney, W.H.Freeman and Company.
Nur’aini, S., Mukaromah, A. S., & Muhlisoh, S. (2019). Pengenalan deoxyribonucleic acid (DNA) dengan marker-based augmented reality. Walisongo Journal of Information Technology, 1(2), 91-100.
Suhartati, T. (2017). Dasar-dasar spektrofotometri UV-Vis dan spektrometri massa untuk penentuan struktur senyawa organik.
Tim Dosen Biokimia. (2024). Petunjuk Praktikum Biokimia. Surabaya: Jurusan kimia FMIPA UNESA.
Trost, B. et al. (2019) ‘Impact of DNA source on genetic variant detection from human whole-genome sequencing data’, Journal of Medical Genetics, 56(12), pp. 809–817.
Utaminingsih, S., Utami, S. D., & Sophian, A. (2022). Isolasi DNA pada Produk Otak-Otak Ikan Bandeng. Muhammadiyah Journal of Nutrition and Food Science (MJNF), 3(1), 36-41.
