ISOLASI DNA TOTAL TUMBUHAN ROTAN GETAH (Calamus angustifolius Griff.) SAMPEL RG3 MENGGUNAKAN GENOMIC DNA MINI KIT PLANT
(GENEAID)
Meisita Hariani1, Dewi Indriyani Roslim2
1Mahasiswa Program Studi S1 Biologi
2Dosen Bidang Genetika dan Biologi Molekuler Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Riau
Kampus Bina Widya Pekanbaru, 28293, Indonesia meisita.hariani1661@student.unri.ac.id
ABSTRACT
Rotan getah (Calamus angustifolius Griff.) is a species of plant from the Arecaceae family which belongs to the large-sized rattan group with a height of up to 40 m. This plant is commonly used, especially by the people of Kampar Regency, as a culinary namely 'pangkek'. This study aimed to isolate rotan getah DNA using Genomic Mini Kit Plant (Geneaid). Research methods consisted of total DNA isolation and electrophoresis. Total DNA isolation was carried out using young leaves from one individual RG3 following the Geneaid protocol. The visualisation results of the total DNA bands showed a thin band and without smears with a length of more than 10,000 bp.
Keywords: Calamus angustifolius Griff., DNA total isolation, electrophoresis, Geneaid, rotan getah
ABSTRAK
Rotan getah (Calamus angustifolius Griff.) merupakan tumbuhan dari famili Arecaceae yang termasuk ke dalam golongan rotan berukuran besar dengan tinggi yang mencapai 40 m. Tumbuhan ini banyak dimanfaatkan khususnya oleh masyarakat Kabupaten Kampar sebagai olahan kuliner, yaitu ‘pangkek’. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi DNA rotan getah menggunakan Genomic Mini Kit Plant (Geneaid). Metode penelitian meliputi isolasi DNA total dan elektroforesis. Isolasi DNA total dilakukan menggunakan daun muda dari 1 individu RG3 dengan mengikuti protokol Geneaid. Hasil visualisasi pita DNA total yang dihasilkan menunjukkan pita yang tipis dan tidak ada smear dengan panjang lebih dari 10.000 pb.
Kata kunci: Calamus angustifolius Griff., isolasi DNA total, elektroforesis, Geneaid, rotan getah
PENDAHULUAN
Tumbuhan rotan termasuk ke dalam tumbuhan dari famili Arecaceae, sub famili Lepidocaryoideae, dan tribus Calameae. Terdapat beberapa genus rotan yang ada di Indonesia, yaitu Calamus, Daemonorops, dan Oncocalamus. Berdasarkan tiga genus tersebut, terdapat 306 jenis dengan 128 jenis yang dimanfaatkan. Sekitar 28 jenis digunakan untuk keperluan perdagangan komersial (Salusu et al., 2020).
Famili Arecaceae memiliki akar serabut yang kaku dan keras, tinggi tumbuhan dapat mencapai 30 m dengan batah yang kokoh dan ramping. memiliki tulang daun menyirip dengan pelepah daun dan tangkai daun yang melebar.
Umumnya berdaun majemuk serta berbentuk palmately dan pinnately.
Bunga biasanya pada bagian axilaris (ketiak daun) dan kadang-kadang pada bagian terminal (ujung daun). Buah berbentuk buni (bacca) dan berbentuk batu (drupa). Kebanyakan terdapat 1 biji pada masing-masing buah dengan tipe biji monokotil (Jihad, 2012).
Tumbuhan rotan merupakan tumbuhan merambat di pohon-pohon penopang (turus) dan memiliki duri-duri pengait yang ada pada ujung tangkai pada pelepah daun (Yudodibrata, 1980).
Habitat hidup rotan biasanya daerah yang memiliki curah hujan antara 2000- 4000 mm per tahun dan cuaca kering selama 1-3 bulan, kelembaban minimal 70% atau suhu udara berkisar 24-30oC (Dransfield, 1974).
Tumbuhan rotan memiliki sistem perakaran yang bersifat geotropik dan apogeotropik. Sistem perakaran rotan dalam perkembangan tumbuhnya, tumbuh sekitar 40% ke arah vertikal dan sekitar 60% ke arah horizontal sejajar dengan kondisi permukaan tanah. Rotan memiliki akar serabut dengan panjang
perakaran rotan yang biasanya ditentukan oleh kesuburan suatu lahan.
Rotan memiliki batang yang tertutup rapat oleh pelepah daun berduri rapat apabila batang masih muda. Jika batang semakin tua, daun pada bagian bawah mati dan gugur sehingga batang menjadi terbuka (Sanusi, 2012).
Rotan getah (Calamus angustifolius Griff.) memiliki klasifikasi yaitu kingdom Plantae, divisi Magnoliophyta, kelas Liliopsida, ordo Arecales, famili Arecaceae, genus Calamus, dan spesies Calamus angustifolius Griff. Daerah persebaran tumbuhan rotan getah adalah daerah dataran rendah yang beriklim basah.
Rotan getah tumbuh secara berumpun, dan pada setiap rumpunnya terdiri atas beberapa batang (Baharuddin dan Taskirawati, 2009).
Penelitian berbasis morfologi terkait tumbuhan rotan getah telah dilakukan oleh Alpino et al. (2020).
Alpino et al. (2020) mengatakan bahwa rotan getah memiliki bentuk daun menyirip dengan anak-anak daun yang berpasangan. Tumbuhan ini memiliki tunas di ujung batang yang merupakan cikal bakal tumbuhan ini terbentuk.
Rotan getah memiliki batang soliter dengan diameter 2–2,5 cm dengan panjang ruas 30-35 cm dan batangnya bergetah. Daunnya majemuk menyirip, anak daun lanset dan berpasangan, terdapat sulur panjat pada bagian ujung daun. Pada bagian bawah daun berduri halus dan jelas, tepi daun berduri lembut, tepi ujung daun berbulu. Daun berwarna hijau tua, berwarna kekuningan ketika masih muda dan berwarna cokelat kekuningan apabila daun tersebut kering.
Menurut Sanusi (2012), rotan dapat diolah menjadi berbagai macam produk seperti furnitur maupun produk
barang jadi rotan, hal ini berkaitan erat dengan struktur anatomi rotan tersebut.
Rotan memiliki struktur anatomi rotan yang lebih sederhana jika dibandingkan dengan struktur anatomi kayu yang kompleks. Tumbuhan rotan tidak mempunyai struktur seperti unsur sel yang berarah transversal, hal ini menjadikan rotan mudah dibelah dan sifatnya elastis karena dapat dilengkungkan hingga batas tertentu dan tidak mudah patah.
Rotan tidak hanya digunakan dalam pembuatan furnitur, rotan juga dapat dijadikan sebagai santapan. Bagian yang dijadikan makanan yaitu pada bagian pucuk. Banyak masyarakat menjadikan pucuk rotan untuk disantap sebagai sayur, diantaranya masyarakat yang ada di Kecamatan Siak Hulu, Kabupaten Kampar, Riau, Indonesia.
Menurut Renuka et al. (2007), pucuk pada rotan kerap dijadikan makanan tradisional di beberapa negara yang ada di Asia, dan dianggap makanan lezat di Eropa dan Amerika. Biasanya bagian pucuk diambil pada batang yang memiliki diameter yang lebih mudah untuk dibudidayakan serta dapat menghasilkan bagian pucuk yang banyak dalam selang waktu yang relatif singkat.
Makanan olahan lain dari rotan yaitu sayur asam umbut rotan. Bahan dasar sayur ini di ambil dari bagian umbut rotan muda yang dipotong-potong hingga kecil. Bagian umbut ini kemudian dimasak dengan terung asam, talas dan di campur dengan bumbu-bumbu untuk membuat sayur. Sayur asam umbut rotan di konsumsi sebagai makanan tradisional oleh masyarakat (Kalima dan Susilo, 2015).
Makanan olahan lainnya dari rotan salah satunya yaitu pangkek. Pangkek merupakan salah satu kuliner khas
Kabupaten Rokan Hulu dan Kabupaten Kampar Kiri Provinsi Riau. Pangkek juga dikonsumsi oleh masyarakat daerah lainnya seperti di Kabupaten Kampar, Kampar Kiri, Sumatera Utara, Kalimantan Tengah dan daerah lainnya penghasil rotan. Bahan dasar pangkek di ambil dari bagian umbut dari rotan yang kemudian dikonsumsi sebagai pendamping nasi seperti gulai dan sayur.
Gulai pangkek memiliki bahan baku utama yaitu pucuk rotan yang telah diolah terlebih dahulu agar menjadi lembut dan dibuat dengan menambahkan bahan-bahan seperti santan, bawang merah, bawang putih, cabai merah, cabai rawir, kemiri, kunyit, serai, lengkuas, garam, gula dan air (Ayu, 2018).
Penelitian secara molekuler terkait tumbuhan rotan getah masih terbatas.
Oleh karena itu, pada penelitian ini dilakukan tahap awal untuk analisis molekuler dari tumbuhan rotan getah yaitu isolasi DNA total dan elektroforesis DNA total.
Isolasi DNA merupakan suatu teknik untuk memisahkan molekul DNA dari komponen sel. Teknik isolasi DNA dapat dilakukan melalui 2 cara yaitu secara konvensional maupun dengan menggunakan kit. Isolasi DNA secara konvensional relatif lebih rumit dan membutuhkan waktu pengerjaan yang lama karena pengerjaan yang dilakukan secara manual dan tahapan kerja yang lebih panjang. Isolasi DNA dengan menggunakan kit lebih praktis karena kit dibuat untuk proses kerja yang lebih efisien (Octavia et al., 2021).
Elektroforesis merupakan salah satu teknik di dalam analisis molekuler.
Elektroforesis adalah suatu proses berpindahnya molekul bermuatan yaitu salah satunya DNA pada suatu medan listrik. Molekul DNA yang berpindah ini akan berhenti pada jarak migrasi tertentu
yang tergantung pada berat muatan, bentuk dan ukurannya. Hasil yang didapatkan dari elektroforesis yaitu bentuk visualisasi pita DNA yang menunjukkan kualitas dan kuantitas dari pita DNA yang didapatkan (Anam et al., 2021).
METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Oktober 2022 - Desember 2022.
Pengambilan sampel dilakukan di Desa Teratak Buluh, Kecamatan Siak Hulu, Kabupaten Kampar, Provinsi Riau.
Isolasi DNA, elektroforesis, PCR, dan elektroforesis hasil PCR dilakukan di Laboratorium Genetika Jurusan Biologi Fakultas dan Matematika Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Riau.
Sekuensing dilakukan di First Base Laboratories, Malaysia melalui PT.
Genetika Science Indonesia, Jakarta.
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini yaitu gunting tanaman, kamera, mikropipet, tips mikropipet, tabung 1,5 ml, mortar, pestel, vortex, waterbath, timbangan analitik, sentrifus, mikrosentrifus, cetakan elektroforesis, mesin elektroforesis, dry bath, mesin PCR, kamera berfilter UV, UV transilluminator dan tabung PCR.
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu daun rotan getah, nitrogen cair, Genomic DNA Mini Kit Plant (Geneaid) yang terdiri atas buffer GP1, buffer GP2, buffer GP3, buffer W1, wash buffer, elution buffer, dan RNAse, parafilm, buffer TBE, DNA ladder, loading dye, ethidium bromide (EtBr), kit PCR (Dream Taq), bubuk agarosa, primer universal: forward (F) yaitu B49317_F2 (5’ CGA AAT CGG TAG ACG CTA CG 3’), dan reverse (R) yaitu A50272_R3 (5’ ATT TGA ACT GGT
GAC ACG AG 3’) (Taberlet et al., 1991).
Prosedur Kerja
Isolasi DNA total dari rotan getah dilakukan dengan menggunakan kit tanaman yaitu Geneaid. Daun sebanyak 100 mg digerus dengan nitrogen cair menggunakan mortar dan pestel hingga daun berbentuk bubuk. Bubuk hasil dari penggerusan pada daun dimasukkan ke dalam tabung berukuran 1,5 ml dan ditambahkan buffer GP1 sebanyak 400 µl dan RNAse sebanyak 5 µl, lalu divorteks selama 10 detik. Sampel kemudian diinkubasi di dalam waterbath pada suhu 60oC selama 10 menit. Elution buffer sebanyak 60 µl kemudian dihangatkan dengan waterbath. Buffer GP2 sebanyak 100 µl ditambahkan pada sampel dan kemudian di vorteks lalu diinkubasi dalam wadah berisi es selama 3 menit.
Sampel kemudian dipindahkan ke filter column yang telah dirakit dengan collection tube dan disentrifus dengan kecepatan 1000 xg selama 1 menit.
Supernatan dibuang dan sampel dipindahkan ke tabung 1,5 ml baru dan ditambahkan buffer GP3 sebanyak 750 µl. Sampel lalu dipindahkan ke GD column baru yang telah dirakit dengan collection tube dan disentrifus dengan kecepatan 13.000 xg selama 30 detik lalu supernatan dibuang, tempatkan kembali GD column ke collection tube. Buffer W1 sebanyak 400 µl ditambahkan lalu disentrifus dengan kecepatan 16.000 xg selama 30 detik lalu supernatan dibuang, tempatkan kembali GD column ke collection tube. Wash buffer ditambahkan sebanyak 600 µl lalu disentrifus pada kecepatan 16.000 xg selama 30 detik lalu supernatan dibuang, tempatkan kembali GD column ke collection tube.
Larutan disentrifus pada kecepatan 16.000 xg selama 3 menit untuk mengeringkan matriks. Pindahkan larutan yang ada pada GD column ke tabung 1,5 ml. Elution buffer yang sudah dipanaskan sebelumnya ditambahkan sebanyak 30 µl. Sampel diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit dan disentrifus pada kecepatan 16.000 xg selama 30 detik, dan didapatkan DNA elusi 1. Sampel yang ada pada GD column dipindahkan ke tabung 1,5 ml baru, lalu ditambahkan elution buffer sebanyak 30 µl. Sampel kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit dan disentrifus pada kecepatan 16.000 xg selama 30 detik, dan didapatkan DNA elusi 2. DNA elusi 1 dan 2 disimpan pada freezer dengan suhu dibawah 4oC untuk menjaga keutuhan DNA.
Hasil isolasi DNA total tumbuhan rotan getah selanjutnya akan dilihat kualitas dan kuantitasnya dengan elektroforesis. Elektroforesis DNA total dilakukan dengan menggunakan bubuk agarosa sebagai medium. Bubuk agarosa sebanyak 1 g dilarutkan dalam 100 ml 1X buffer TBE, lalu dipanaskan dengan dry bath hingga mendidih dan larutan menjadi bening. Setelah larutan menjadi bening, larutan agarosa yang masih panas diturunkan suhunya dengan cara tabung digoyang membentuk angka 8 secara perlahan hingga suhu larutan tidak begitu panas. Kemudian EtBr sebanyak 3 µl ditambahkan lalu dihomogenkan. Cetakan agarosa dan sisir kemudian disiapkan, lalu larutan agarosa dituang dan ditunggu hingga memadat. Setelah itu, sisir dilepaskan secara perlahan dan terbentuklah sumur.
Parafilm dipotong sedikit dan diletakkan di atas permukaan yang datar.
Setiap sampel diambil sebanyak 2 µl dan diletakkan sejajar di atas parafilm. Setiap
sampel dicampurkan dengan 2 µl loading dye dengan metode pipetting, kemudian dimasukkan ke dalam setiap sumur gel agarosa yang berbeda. DNA ladder sebanyak 2 µl diambil dan dicampurkan dengan 2 µl loading dye, kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel agarosa yang paling ujung kiri.
Elektroforesis dilakukan pada tegangan 50 V selama 40 menit. Hasil elektroforesis divisualisasikan dengan UV transilluminator, hasilnya kemudian difoto menggunakan kamera berfilter UV.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Prinsip isolasi DNA total ada 3 yaitu lisis, ekstraksi dan purifikasi yang bertujuan untuk merusak dinding sel, mengeluarkan DNA dan menghasilkan DNA total yang bersih tanpa kontaminan dari senyawa kimia. Menurut Nugroho et al. (2015), terdapat beberapa faktor yang dapat memengaruhi isolasi DNA yaitu diantaranya kualitas sel tanaman yang dipilih dan umur sel untuk isolasi DNA, penanganan dan penyimpanan sel sebelum isolasi, dan enzim yang digunakan saat isolasi DNA.
Pada penelitian ini, isolasi pita DNA total pada tumbuhan rotan getah telah dilakukan dengan menggunakan kit Geneaid (Genomic DNA mini kit plant).
Isolasi DNA dilakukan pada 3 individu dari tumbuhan yang sama. Menurut Sari et al. (2014), penggunaan kit dalam analisis secara molekuler dapat meningkatkan daya guna dan efisiensi dalam proses kerja. Isolasi DNA menggunakan kit geneaid menghasilkan DNA total (dari inti, mitokondria, dan kloroplas).
Elektroforesis termasuk ke dalam salah satu tahapan di dalam analisis secara molekuler. Elektroforesis dapat memisahkan sampel DNA berdasarkan
ukuran dan struktur fisik dari molekul.
Pada elektroforesis, gel agarosa adalah gel yang paling biasa digunakan.
Menurut Artati (2016), elektroforesis dengan gel agarosa dapat memisahkan sampel DNA dengan variasi ukuran yang besar, yaitu dari DNA berukuran beberapa ratus hingga 20.000 pb.
Pada saat elektroforesis digunakan 1% agarosa. Penggunaan 1% gel agarosa ini dikarenakan konsentrasi 1% memiliki ukuran pori pemisahan yang bagus untuk ukuran fragmen DNA sekitar 200 pb–10 kb (Widiyanti et al., 2014).
Berdasarkan hasil elektroforesis DNA total, didapatkan sampel rotan getah berukuran lebih dari 10.000 pb (Gambar 4.1). Pita DNA total yang didapatkan pada sumur RG3 pada Gambar 4.1 menunjukkan bahwa DNA yang terbentuk tipis dan tidak tampak adanya smear. Tingkat ketebalan pita DNA mengindikasikan konsentrasi hasil isolasi DNA. Jika pita DNA tipis maka konsentrasi hasil isolasi DNA yang dihasilkan rendah, begitu juga sebaliknya. Ada atau tidak adanya smear menandakan keutuhan DNA.
Gambar 1 Profil pita DNA total tumbuhan rotan getah. pb= pasang basa.
L= 1 kb DNA ladder (Thermo scientific), RG3= rotan getah 3.
Menurut Irmawati (2003), pita DNA yang tebal dan tidak smear menunjukkan konsentrasi yang tinggi dan DNA total yang diekstrak dalam kondisi utuh. Pita DNA yang smear menunjukkan bahwa terdapat ikatan antar molekul DNA yang terputus pada saat proses ekstraksi berlangsung, sehingga genom DNA terpotong menjadi bagian-bagian yang lebih kecil.
Ikatan antar molekul yang terputus dapat disebabkan oleh adanya gerakan fisik yang berlebihan saat proses pemipetan, pada saat dibolak-balik di dalam tabung, temperatur yang terlalu tinggi, dan karena aktivitas bahan-bahan kimia tertentu. Sholihah (2014) juga mengatakan bahwa smear yang terbentuk pada pita DNA total disebabkan oleh pemipetan DNA yang berulang-ulang sehingga DNA menjadi terpotong.
KESIMPULAN
Pita DNA total tumbuhan rotan getah (Calamus angustifolius Griff.) sampel RG3 yang diperoleh dari hasil visualisasi elektroforesis menunjukkan bahwa pita DNA total yang dihasilkan tipis, tidak terbentuk adanya smear dan memiliki panjang lebih dari 10.000 pb.
Hasil isolasi DNA total tumbuhan rotan getah ini dapat digunakan untuk penelitian lebih lanjut mengenai analisis molekuler tumbuhan rotan getah.
DAFTAR PUSTAKA
Alpino A, Yoza D, Mardhiansyah M.
2020. Keanekaragaman dan Potensi Rotan di Taman Wisata Alam Buluh Cina Desa Buluh Cina Kabupaten Kampar. Jurnal Ilmu- Ilmu Kehutanan 4(2): 7-12.
Anam K, Cahyadi W, Azmi I, Senjarini K, Oktarianti R. 2021. Analisis Hasil Elektroforesis DNA dengan
10.000 pb
Image Processing Menggunakan Metode Gaussian Filter. IJEIS (Indonesian Journal of Electronics and Instrumentation Systems) 11(1): 37-48.
Artati D. 2016. Sensitivitas Gel Red sebagai Pewarna DNA pada Gel Elektroforesis. Buletin Teknik Litkayasa Akuakultur 11(1): 11- 14.
Ayu DF. 2018. Ensiklopedia Produk Pangan Indonesia Jilid 2. Bogor:
IPB Press.
Baharuddin dan Taskirawati I. 2009.
Hasil Hutan Bukan Kayu.
Makassar: Unhas Press.
Dransfield J. 1974. A Short Guide to Rattan. Bogor: BIOTROP.
Irmawati. 2003. Perubahan Keragaman Genetik Ikan Kerapu Tikus Generasi Pertama Pada Stok Hatchery. Thesis. Bogor: IPB Jihad M. 2012. Identifikasi Morfologi
Famili Arecaceae di Kabupaten Gowa. Skripsi. UIN Alauddin Makassar.
Kalima, T, Susilo A. 2015. The Future Prospect of Rattan as Food Resources in Central Kalimantan.
In Proceeding of 6th International Conference on Global Resource Conservation: 62-68.
Nugroho K, Terryana RT, Lestari P.
2015. Optimasi Metode Isolasi DNA pada Jatropha spp. Jurnal Agroteknologi 5(2): 15-22.
Octavia D, Mukaromah AS, Martiansyah I, Mimin M, Ma'mun S, Rukmanto H. 2021. Isolasi DNA tumbuhan hasil eksplorasi di Nusakambangan dengan metode kit di Laboratorium Treub, Kebun Raya Bogor. In Prosiding Seminar Nasional Biologi 7(1): 291-299.
Renuka C, Thomas JP, Rugmini P. 2007.
Effects of light on the growth and production of edible shoots of rattan. Journal of Tropical Forest Science 19(3):164-167.
Salusu HD, Nurmarini E, Patulak IM.
2020. Kemungkinan Pemanfaatan Beberapa Jenis Rotan Non Komersial Ditinjau Dari Sifat- Sifat Fisik Mekanik. Buletin Poltanesa 21(2):32-36.
Sanusi D. 2012. Rotan: Kekayaan Belantara Indonesia. Surabaya:
Brilian Indonesia.
Sari SK, Muthia NM, Dwi L, Eko SS.
2014. Optimasi Teknik Isolasi dan Purifikasi DNA pada Daun Cabai Rawit (Capsicum frutescens cv.
Cakra Hijau) menggunakan Genomic DNA Mini Kit (Plant) GeneAid. Seminar nasional XI Pend. Bio FKIP UNS 11(1): 65-70.
Sholihah SM. 2014. Hubungan Kekerabatan Beberapa Kultivar Pisang (Musa sp.) untuk Sifat Ketahanan terhadap Penyakit Berdasarkan Resistance Gene Analog (RGA). Skripsi. Jurusan Biologi Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim, Malang.
Taberlet P, Gielly L, Pautou G, Bouvet J.
1991. Universal primers for amplification of three non-coding regions of chloroplast DNA. Plant Molecular Biology 17(5):1105- 1109.
Widiyanti NLPM, Maryam S, Parwata IP, Mulyadiharja S. 2014.
Perbandingan Tampilan Pita Penanda DNA (Deoxyribonucleic Acid) Standar dan Penentuan Panjang DNA Kromosom Y yang Diisolasi dari Darah Manusia pada Pemisahan dengan Menggunakan
Media Berbeda. In Prosiding Seminar Nasional MIPA.
Yudodibrata H. 1980. Suatu Tinjauan Tentang Rotan dan Beberapa Permasalahannya. Yogyakarta:
UGM.
