LAPORAN PENELITIAN PENGEMBANGAN IPTEKS ( PPI )
FORMULASI DAN UJI AKTIFITAS ENZIM TIROSINASE PADA MASKER PEEL OFF JERUK NIPIS SEBAGAI ANTIAGING
PENGUSUL:
ARI WIDAYANTI, M.FARM., APT. NIDN 0328017603 No. Kontrak : 204/F.03.07/2019
JURUSAN FARMASI
FAKULTAS FARMASI DAN SAINS
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PROF.DR.HAMKA JAKARTA
2019
i
ii
iii
iv ABSTRAK
Pemanfaatan buah jeruk sebagai obat diantaranya sebagai penambah nafsu makan, penurun panas (antipereutik), diare, menguruskan badan, antiinflamasi, antibakteri dan antioksidan (Haryanto 2012). Kulit jeruknya telah diteliti berperan sebagai antioksidan IC50
54,458 µg/ml (Khasanah, 2014) dan sebagai penghambat enzim tirosinase IC50 42,11 mg/ml (Hindun, 2017). Pada penelitian kali ini kulit jeruk nipis diekstraksi kemudian hasil ekstraksinya akan dibuat menjadi Formula masker peel off. Kulit jeruk nipis teridentifikasi mengandung flavonoid. Flavonoid adalah zat metabolit sekunder pada jeruk nipis yang memiliki konsentrasi paling tinggi pada bagian kulitnya (Okwu, 2008). Flavonoid merupakan salah satu zat metabolit sekunder yang terdapat pada jeruk dan kulit jeruk yang berperan sebagai antioksidan, penghambat enzim tirosinase dan juga bekerja pada bagian akhir dari jalur oksidatif melanogenesis (Abrahimi, A. 2014). Selain itu, beberapa jenis flavonoid seperti hesperidin, naringin, neohesperidin, dan nobeletin telah terbukti in vitro dapat menghambat enzim tirosinase (Sasaki K and Yoshizaki F. 2002). Hasil Masker peel off diukur dengan Sepktro UV Vis dengan penambahan enzim tirosinase, sehingga diharapkan terlihat hasilnya meningkatkan atau menghambat serapan darienzim tirosinase.
v DAFTAR ISI
HALAMAN PENGESAHAN ... i
SURAT KONTRAK PENELITIAN ………. ii
ABTRAK ………. Iv DAFTAR ISI ... v
DAFTAR TABEL ………. vi
DAFTAR GAMBAR ……… vii
BAB 1 PENDAHULUAN A. Latar Belakang Penelitian ……… 1
B. Masalah Penelitian ……… 2
C. Tujuan Penelitian ………. 2
D. Urgensi Penelitian ……… 2
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA A. State if The Art ……… 3
B. Roadmap Penelitian ……… 6
BAB 3 METODE PENELITIAN A. Alur /langkah Penelitian .. ……….. 7
B. Lokasi Penelitian ……… 7
C. Alat dan Bahan yang digunakan ………. 7
D. Konsep atau Prosedur Penelitian ………. 7
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN ……... 12
BAB 5 KESIMPULAN ……… 19
BAB 6 LUARAN ……….. 20
DAFTAR PUSTAKA ……… 21
LAMPIRAN ……… 23
vi
DAFTAR TABEL
Tabel 1. Formula Sediaan Masker Kuliat Jeruk Nipis 9
Tabel 2. Komposisi Uji 10
Tabel 3. Hasil Evaluasi 13
Tabel 4. Hasil Uji Identifikasi 13
Tabel 5. Evalusi Fisik Masker 14
Tabel 6. Uji Waktu Mengering 15
Tabel 7. Uji pH 16
Tabel 8. Hasil Ujim Viskositas 16
Tabel 9. Nilai Inhibisi 18
vii
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Tumbuhan Jeruk Nipis 1
Gambar 2. Proses pembentukan Melanin 5
Gambar 3. Alur Penelitian 11
Gambar 4. Hasil Masker 14
Gambar 5. Kurva Kalibrasi 17
1 BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang Masalah
Jeruk nipis adalah sejenis tanaman perdu yang banyak tumbuh dan dikembangkan di Indonesia. Selain daerah penyebarannya yang sangat luas, jeruk ini juga dapat berbuah terus- menerus sepanjang tahun. Jeruk nipis juga merupakan salah satu tanaman toga yang digunakan oleh masyarakat, baik untuk bumbu masak, obat-obatan, dan minuman segar.
Pemanfaatan buah jeruk sebagai obat diantaranya sebagai penambah nafsu makan, penurun panas (antipereutik), diare, menguruskan badan, antiinflamasi, antibakteri dan antioksidan (Haryanto, S. 2006). Kulit jeruknya telah diteliti berperan sebagai antioksidan IC50 54,458 µg/ml (Khasanah, 2014) dan sebagai penghambat enzim tirosinase IC50 42,11 mg/ml (Hindun, 2017).
Kulit jeruk nipis dapat diolah untuk mendapatkan flavonoid. Flavonoid adalah zat metabolit sekunder pada jeruk nipis yang memiliki konsentrasi paling tinggi pada bagian kulitnya (Okwu, 2008). Flavonoid merupakan salah satu zat metabolit sekunder yang terdapat pada jeruk dan kulit jeruk yang berperan sebagai antioksidan, penghambat enzim tirosinase dan juga bekerja pada bagian akhir dari jalur oksidatif melanogenesis (Abrahimi, A. 2014). Selain itu, beberapa jenis flavonoid seperti hesperidin, naringin, neohesperidin, dan nobeletin telah terbukti in vitro dapat menghambat enzim tirosinase (Sasaki K and Yoshizaki F. 2002).
Inhibitor tirosinase pada saat ini banyak digunakan dalam produk kosmetik dan farmasi sebagai penghambat produksi melanin menjadi berlebih pada lapisan epidermis dan membuat kulit tampak lebih putih (Arung et al, 2006). Mekanisme kerja enzim tirosinase dengan menghambat aktivitas enzim yaitu dengan mereduksi bahan yang dapat menyebabkan oksidasi dopakuinon.
Melanin merupakan zat yang memberikan warna coklat atau coklat kehitaman pada kulit, berpean sebagai pelindung kulit terhadap paparan radiasi ultra violet (UV) (Hoogduijin MJ, Cemeli E, and Ross K. 2004). Proses pembentukan senyawa melanin (melanogenesis) terjadi dengan bantuan biokatalis terutama enzyme tirosinase. Enzim tirosinase mengkatalisis dua reaksi utama dalam biosintesis melanin, yaitu hidroksilasi L-tirosin menjadi L-dopa dan oksidasi L-dopa menjadi dopakuinon. Senyawa dokuinon mempunyai kereaktifan yang sangat tinggi dan dapat dipolimerisasi secara spontan membentuk melanin (Costin, G.E,. and Hearing, V.J., 2007). Pembentukan melanin dapat meningkat bila aktivitas enzim tirosinase
2
meningkat yang terutama karena adanya pajanan sinar UV. Peningkatan sintesis melanin menyebabkan hiperpigmentasi (Chang, T.S. 2009).
Peel-off mask penggunaannya pada wajah memiliki konsistensi seperti krim yang setelah kering akan memiliki efek mengeras atau mengeratkan kulit. Lapisan tipis yang diberikan pada kulit yang berfungsi sebagai barrier dan mencegah penetrasi kotoran kedalam kulit, juga dapat digunakan untuk menghilangkan kotoran pada permukaan kulit. Penggunaannya dapat memberikan kesan segar dan bersih yang disebabkan karena reaksi cleansing action (Darsika dkk, 2015).
B. Masalah Penelitian
Pada penelitian ini dapat dirumuskan masalah sebagai berikut : Apakah masker peel- off yang mengandung ekstrak etanol 96% kulit buah jeruk nipis (Citrus Aunrantifolia) mempunyai aktivitas penghambatan terhadap tirosinase? Berapa besar penghambatan terhadap tirosinase dari ekstrak etanol 96% kulit buah jeruk nipis (Citrus Aunrantifolia)?
C. Tujuan Penelitian
Penelitian ini dilakukan dengan tujuan: untuk menguji penghambatan tirosinase masker peel-off dari ekstrak etanol 96% kulit buah jeruk nipis (Citrus Aunrantifolia), untuk menentukan IC50 aktivitas penghambatan tirosinase pada masker peel-off dari ekstrak kulit buah jeruk nipis (Citrus Aunrantifolia).
D. Urgensi Penelitian
Dari penelitian ini diharapkan dapat menghasilkan produk masker peel-off ekstrak etanol 96% kulit jeruk nipis (Citrus Aunrantifolia) yang berasal dari bahan alam dapat menghambat aktivitas enzim tirosinase.
3 BAB II
KAJIAN PUSTAKA A. STATE OF ART
1. Jeruk Nipis (Citrus Aurantifolia)
Gambar 1. Tumbuhan Jeruk Nipis (Citrus aurantifolia)
Jeruk nipis mengandung unsur-unsur senyawa kimia yang bemanfaat, misalnya: asam sitrat, asam amino (triptofan, lisin), minyak atsiri (sitral, limonen, felandren, lemon kamfer, kadinen, gerani-lasetat, linali-lasetat, aktilaldehid, nonildehid), damar, glikosida, asam sitrun, lemak, kalsium, fosfor, besi, belerang vitamin B1 dan C, saponin, flavonoid (Chang, 2001).
Kulit jeruk nipis dapat diolah untuk mendapatkan pektin dan flavonoid. Flavonoid adalah zat metabolit sekunder pada jeruk nipis yang memiliki konsentarasi paling tinggi pada bagian kulitnya (Okwu, 2008). Flavonoid merupakan salah satu zat metabolit sekunder yang terdapat pada jeruk dan kulit jeruk yang berperan sebagai antioksidan, penghambat enzim tirosinase dan juga bekerja pada bagian akhir dari jalur oksidatif melanogenesis (Abrahimi, A. 2014). Selain itu, beberapa jenis flavonoid seperti hesperidin, naringin, neohesperidin dan nobeletin telah terbukti in vitro dapat menghambat enzim tirosinase tirosinase (Sasaki K and Yoshizaki F. 2002).
2. Masker Peel-Off
Masker peel-off merupakan salah satu jenis sediaan masker yang praktis dan mudah saat penggunaanya. Selain itu sediaan masker ini telah diaplikasikan untuk anti penuaan dini.
Masker peel-off biasanya dalam bentuk gel atau pasta yang dioleskan ke kulit muka. Setelah alcohol yang terkandung dalam masker menguap, terbentuklah lapisan film yang tipis dan transparan pada kulit muka. Setelah berkontak selama 15-30 menit, lapisan tersebut diangkat dari permukaan kulit dangen cara dikelupas (Lestari PM, dkk, 2013). Manfaat masker peel-
4
off antara lain dapat mengangkat sel kulit mati agar kulit bersih dan segar,mengembalikan kelembutan kulit, dan dengan pemakaian teratur dapat mengurangi kerutan halus pada kulit wajah (Lestari PM, dkk, 2013).
Di dalam tubuh manusia terdapat antioksidan seperti superoksida dismutase (SOD), glutation dan katalase. Antioksidan dapat juga kita peroleh dari asupan makanan yang mengandung vitamin A, C, beta karoten, vitamin E dan senyawa fenolik (Sies et al, 1992).
Bila proses radikal bebas terus menerus berlangsung di dalam tubuh, persediaan tersebut tidaklah cukup sehingga diperlukan antioksidan dari asupan luar fisik baik secara oral maupun topical (Masaki H, 2010). Antioksidan topical dapat melindungi kulit dari stress oksidatif, kerusakan kulit, membantu memperbaiki kondisi kulit dan sebagai anti-aging (Morganti et al, 2002).
3. Melanin dan Tirosinase
Melanin mempunyai peranan yang sangat penting dalam perlindungan kulit terutama terhadap paparan sinar ultraviolet yang berbahaya bagi kulit. Melanin juga mempunyai pengaruh dalam pewarnaan kulit dan beberapa aspek fenotip, seperti warna rambut, dan mata (Kyoung-Chan et al, 2010). Melanin dibentuk oleh beberapa kombinasi dari reaksi enzimatik yang terkatalisasi dan beberapa reaksi kimia. Seluruh proses yang mengarah pada pembentukan pigmen makromulekul gelap atau melanin dikenal dengan melanogenesis (Chang, 2009) melanogenesis terjadi di tempat yang spesifik di dalam organel yang dikenal dengan melanosome, yang mana melanosome ini diproduksi di melanosit yang hanya 1%
dari sel-sel yang berada di epidermis (Brenner dan Hearing, 2008). Namun, pembentukan melanin yang tidak normal dapat mengoksidasi tirosin menjadi dopaquinone yang dikatalisasi oleh enzim tirosinase (TYR). Setelajnya dopaquinone akan diubah menjadi dopa dan dopachrome melalui reaksi kembali menjadi dopa dan dopachrome melalui reaksi auto- oksida. Dopa merupakan substrat dari tirosinase. Terakhir, melanin terbentuk melalui serangkaian reaksi oksidasi dari dihidrosindole (DHI) asam dihidrosindole-2-karboksilat (DHICA). Disaat yang bersamaan dopaquinone juga diubah menjadi cysteinyldopa atau gluthionyldopa dengan bantuan dari cysteine atau glutathione untuk membentuk pheomelanin. Dan tahap akhir melanogenesis adalah bercampurnya eumelanin dan pheomelanin untuk membentuk pigmen makromolekul gelap yang dikenal dengan melanin (Chang, 2009).
Tirosinase merupakan enzim yang secara luas terdistribusi dalam mikroorganisme, tumbuhan dan binatang, selain itu tirosinase juga telah dikenal sebagai enzim yang
5
mengandung tembaga. Pada jamur dan makhluk-makhluk bertulang belakang, tirosinase berperan untuk mengkatalisis beberapa langkah pembentukan melanin yang berasal dari tirosin (Chang, 2012). Oleh karena itu untuk menghambat pembentukan melanin dapat dilakukan dengan penghambatan kerja dari enzim tirosinase oleh suatu senyawa yang dikenal dengan tirosinase inhibitor.
Inhibitor tirosinase pada saat ini banyak digunakan dalam produk kosmetik dan farmasi sebagai penghambat produksi melanin menjadi berlebih pada lapisan epidermis dan membuat kulit tampak lebih putih (Arung et al, 2006). Mekanisme kerja enzim tirosinase dengan menghambat aktivitas enzim yaitu dengan mereduksi bahan yang dapat menyebabkan oksidasi dopakuinon.
Gambar 2. Proses Pembentukan Melanin 4. Uji Inhibitor Tirosinase
Pengukuran aktivitas pemutih kulit dapat dilakukan dengan tiga cara. Pertama, uji in vivo dengan mengukur warna kulit dan jumlah melanin menggunakan instrumen pada kulit yang telah diberikan sediaan. Kedua, uji ex vivo dengan menggunakan inkubasi kultur epidermis manusia dengan senyawa pemutih lalu mengukur banyaknya dendrit yang terbentuk. Ketiga, uji in vitro dengan mengukur produk dopakrom. Cara ketiga merupakan cara yang paling mudah dilakukan karena tidak menggunakan manusia sebagai subjek atau kultur epidermis.
Prinsip kerja dari metode in vitro ini berdasarkan pada adanya dopakrom yang merupakan hasil oksidasi L-DOPA oleh tirosinase. Senyawa pemutih kulit akan berkompetisi dengan L- DOPA untuk berikatan dengan tirosinase. Kompetisi tersebut akan mengurangi jumlah produk dopakrom yang dihasilkan sehingga aktivitas penghambatan oleh senyawa pemutih
6
dapat dihitung. Dopakrom yang terbentuk akan berwarna jingga tua hingga merah sehingga dapat diukur serapannya dengan cara kolorimetri dengan menggunakan alat spektrofotometri UV-Vis pada panjang gelombang maksimum.
( ) ( )
( ) (2.1) B. Road Map Penelitian
PENELITIAN
- Uji efektivitas sediaan masker - Uji Keamanan
/dermatologis 2019-2020
- Ekstraksi kulit jeruk nipis - Formulasi masker peel
off
- Uji sediaan dengan Spektro UV VIS 2018-2019
W A K T U
7 BAB III
METODE PENELITIAN A. Alur /langkah Penelitian
1. Pengumpulan alat, bahan, dan Determinasi tanaman 2. Pembutan serbuk simplisia kulit jeruk nipis
3. Ekstraksi kulit jeruk nipis dengan etanol 96%
4. Pembuatan masker peel-off 5. Uji inhibitor tirosinase 6. Analisis data
B. Lokasi Penelitian
1. Laboratorium Teknologi Sediaan Farmasi FFS UHAMKA
2. Determinasi tanaman dan pengumpulan bahan Jeruk nipis diperoleh dari Badan Penelitian Tanaman Rempah dan Obat yang dideterminasi di LIPI.
C. Alat dan Bahan yang digunakan Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain adalah serangkaian alat ekstraksi dengan metode maserasi dan evaporasi, alat-alat gelas, mikropipet, timbangan analitik dan digital, pH meter, viskometer, spektrofotometri UV-Vis.
Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain adalah kulit jeruk nipis (Citrus Aunrantifolia), aqua destillata, etanol 96%, propilenglikol, polivinil alkohol (PVA), hidroksi propil metil celulosa (HPMC), tirosinase dari jamur (Sigma, Amerika Serikat), metiparaben, propilparaben, larutan buffer, L-DOPA, FeCl3, HCl 2N, HCl pekat, Liebermann Burchard, logam Mg.
D. Konsep atau Prosedur Penelitian
1. Pembuatan serbuk simplisia kulit jeruk nipis
Kulit jeruk nipis yang telah dikumpulkan disortir dan dibersihkan kemudian dikeringkan dengan cara diangin-anginkan. Sampel yang telah dikeringkan, diserbuk dengan menggunakan blender, serbuk yang dihasilkan diayak menggunakan ayakan mesh 60 hingga diperoleh serbuk yang halus dan seragam. Hasilnya dimasukan ke dalam wadah tertutup.
2. Metode Ekstraksi
8
Serbuk simplisia 500 gram di ekstraksi dengan cara maserasi dengan menggunakan etanol 96%. Serbuka simplisia kering kulit jeruk nipis direndam dengan etanol 96%
sampai terendam sempurna dalam toples yang berwarna gelap. Selama 6 jam pertama rendam sambil sesekali diaduk, kemudian didiamkan selama 18 jam. Pengadukan dilakukan bertujuan untuk meratakan seluruh bagian serbuk simplisia agar terendam dengan etanol 96%. Setelah itu pisahkan maserat dengan cara filtrasi. Kemudian lakukan penyarian ulang atau remaserasi sebanyak tiga kali dengan jenis dan jumlah pelarut yang sama. Untuk menentukan akhir maserasi dilakukan secara organoleptis, dengan melihat warna dan pemeriksaan zat aktif secara kualitatif pada maserat terakhir. Maserat kemudian diuapkan dengan vacum rotary evaporator. Dan hasil ekstrak evaporator dikentalkan dengan oven atau waterbath pada suhu ± 50˚C (Depkes RI 2008).
4. Penapisan Fitokimia Ekstrak Etanol Kulit Buah Jeruk Nipis a. Idenifikasi Flavonoid
Sebanyak 1 gram ekstrak kental ditambahkan metanol. Kemudian dipanaskan lalu disaring panas dan dipekatkan dipenangas air, lalu ditambahkan HCl pekat dan logam Mg. Hasil positif terbentuk warna merah menunjukan adanya flavonoid (Depkes RI 2000)
b. Identifikasi Alkaloid
Masukkan 0,5 gram ekstrak kental dalam tabung reaksi, ditambahkan 1 ml HCl 2N dan 9 ml aquadest, panaskan diatas penangas air pada suhu 100˚C selama 2 menit, dinginkan dan saring. Masukkan kedalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan 1-2 tetes pereaksi buchardat, jika terbentuk endapan coklat-hitam, maka positif terdapat alkaloid (Depkes RI 2000)
c. Identifikasi Tanin
Diambil 2 tetes ekstrak kental, masukkan kedalam tabung reaksi, tambahkan 10 ml air panas, panaskan diatas penangas air suhu 100˚C selama 1 jam, kemudian dinginkan dan saring. Filtrat ditetesi dengan FeCl3 1% terbentuk warna hijau tua sampai biru atau hitam (Depkes RI 2000)
d. Identifikasi Saponin
Diambil 2 tetes ekstrak kental, dimasukkan kedalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan 10 ml air panas dan didinginkan lalu dikocok kuat-kuat. Terbentuk buih yang stabil selama ± 10 menit setinggi 1-10 cm buih tidak hilang, maka positif menunjukkan adanya saponin (Depkes RI 2000)
9 3. Pembuatan Masker Peel Off
Polivinil alkohol ditambahkan akuadest empat kalinya lalu dipanaskan sampai warnanya bening dan homogen. HMPC dikembangkan dengan akuadest dibiarkian selama 30 menit. Campur keduanya dalam lumpang gerus homogen. Tambahkan propilenglikol, nipagin, nipasol yang telah dilarutkan dengan etranol 96% gerus sampai terbentuk massa yang homogen. Ekstrak etanol kulit jeruk nipis dilarutkan sisa etanol 96% ditambahkan ke basis sedikit demi sedikit gerus homogen.
Tabel 1. Tabel Formula Sediaan Masker Peel-off Ekstrak Kulit Jeruk Nipis (Citrus Aunrantifolia)
Bahan Konsentrasi (%) F1 F2
Ekstrak - 35
PVA 10 10
HPMC 1 1
Propilenglikol 15 15 Metilparaben 0,2 0,2 Propilparaben 0,1 0,1 Etanol 96% 15 15 Aqua Destilata Ad 100 100
4. Uji Inhibitor Tirosinase (Arung, Shimizu, dan Kondo, 2006) a. Pembuatan Larutan L-DOPA 2,5 mM
L-DOPA ditimbang seksama sebanyak 12,4 mg, kemudian dilarutkan dengan dapar fosfat (pH 6,8) dalam labu ukur sampai 25,0 ml. Pada saat preparasi hingga uji penghambatan tirosinase dilakukan, larutan ini dihindarkan dari cahaya.
b. Pembuatan Dapar Fosfat 50 mM dengan pH 6,8
Untuk menyiapkan 200 ml dapar fosfat 50 mM, kalium dihidrogen fosfat ditimbang seksama sebanyak 1,36 gram, kemudian dilarutkan dengan aqua dest 100 ml. Larutan tersebut ditambahkan larutan NaOH 0,2 N sebanyak 11 ml dan ditambahkan aqua dest hingga hamper mencapai 200 ml. pH larutan diukur dan diteteskan NaOH hingga pH mencapai 6,8.
c. Pembuatan Larutan Tirosinase
10
Tirosinase ditimbang sebanyak 1,16 mg kemudian dilarutkan dengan dapar fosfat pH 6,8 dalam labu ukur sampai 10,0 ml. Tirosinase yang dilarutkan memiliki aktivitas 496 unit/ml. setelah preparasi hingga uji penghambatan tirosinase, larutan ini disimpan dalam suhu rendah (2-8oC).
d. Pembuatan Larutan Asam Kojat
Asam kojat sebanyak 50 mg ditimbang seksama dan dilarutkan dalam 10ml dapar fosfat 50 mM pH 6,8 sehingga diperoleh konsentrasi 5000 µg/ml. Larutan tersebut dipipet sebanyak 1 ml, dimasukkan ke dalam labu ukur 50ml, lalu dicukupkan volumenya dengan dapar fosfat hingga didapatkan konsentrasi 100,0 µg/ml. Selanjutnya dilakukan pengenceran hingga didapatkan larutan asam kojat dengan konsentrasi 15 ppm, 30 ppm, dan 45 ppm sebagai variasi konsentrasi pada pengujian untuk mandapatkan nilai IC50.
e. Pengukuran Panjang Gelombang Maksimum
Untuk menentukan panjang gelombang maksimum, 2,4 ml larutan dapar fosfat 50 mM (pH 6,8) dan 666 µl larutan L-DOPA (2,5 mM) dipipet ke dalam tabung reaksi. Inkubasi pada suhu kamar selama 10 menit. Kemudian ditambahkan 184 µl larutan tirosinase (496 unit/ml) ke dalam tabung reaksi tersebut. Inkubasi kembali pada suhu kamar selama 25 menit agar reaksi berjalan. Kemudian diukur serapannya dengan spektrofotometer UV- Vis yang telah diatur panjang gelombangnya dari 200-800 nm.
f. Uji Penghambat Tirosinase IC50
Ekstrak ditimbang secara seksama, kemudian dilarutkan dalam propilenglikol 1:10 kemudian dibuat konsentrasi 15 ppm, 30 ppm, dan 45 ppm dengan aqua dest. Disiapkan larutan L-DOPA (2,5 mM), larutan dapar fosfat 50 mM (pH 6,8), larutan tirosinase (496 unit/ml), dan tabung reaksi. Masing-masing tabung reaksi terdiri dari:
Tabel 2. Komposisi bahan yang digunakan dalam Uji Penghambatan Tirosinase IC50 Bahan Tabung (µL)
A B C D
Larutan Dapar Fosfat 2200 2200 2200 2200 L-DOPA (2,5 mM) 666 666 666 666
Basis masker peel-off 200 200 - -
Masker peel-off ekstrak kulit buah jeruk nipis - - 200 200 Tirosinase 184 - 184 -
11
Tabung A, larutan dapar fosfat dan L-DOPA, dan basis masker peel-off dipipet ke dalam tabung reaksi, kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 10 menit. Setelah itu ditambahkan larutan tirosinase kedalam tabung reaksi, diinkubasi kembali selama 25 menit pada suhu kamar. Kemudian diukur serapannya dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang hasil optimum.
Tabung B, larutan dapar fosfat dan L-DOPA, masker peel-off dipipet ke dalam tabung reaksi, kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 35 menit. Kemudian diukur serapannya dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang hasil optimasi.
Tabung C, larutan dapar fosfat dan L-DOPA, aqua destillata dipipet ke dalam tabung reaksi, kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 10 menit. Setelah itu ditambahkan larutan tirosinase kedalam tabung reaksi, diinkubasi kembali selama 25 menit pada suhu kamar. Kemudian diukur serapannya dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang hasil optimasi.
Tabung D, larutan dapar fosfat dan L-DOPA, masker peel-off ekstrak kulit buah jeruk nipis dipipet ke dalam tabung reaksi, kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 35 menit. Kemudian diukur serapannya dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang hasil optimasi.
Nilai aktivitas penghambatan enzim tirosinase diperoleh dengan menghitung penghambatan dopakrom yang terbentuk menggunakan rumus persamaan (2.1).
E. Fishbond Penelitian
PENELITIAN Penelitian saat ini
TERDAHULU---
Gambar 3. Alur Penelitian Uji aktifitas Kulit Jeruk
Nipis
Formulasi Masker peel off Kulit jeruk nipis
Formulasi Masker Peel off
Uji aktifitas enzim tirikinase dengan spektro UV VIS
Produk Masker Peel off Kulit Buah jeruk Nipis
yang sesuai dengan persyaratan farmasetika
dan berkasiat sebagai anti aging
12 BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN A. Pembuatan Simplisia Kulit Jeruk Nipis
Bahan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah kulit jeruk nipis (Citrus aurantifolia) yang telah dideterminasi di Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), Pusat Konservasi Tumbuhan Kebun Raya Bogor. Tujuan dari determinasi tanaman adalah memastikan identitas tanaman yang diteliti agar terhindar dari kesalahan dalam pengambilan kulit jeruk nipis. Hasil determinasi menunjukan bahwa tanaman yang diteliti adalah Citru aurantifolia (Lampiran 3). Kulit jeruk nipis yang digunakan 1,5 kg kering dan setelah dihaluskan simplisia serbuk diperoleh sebanyak 880 gram. Serbuk simplisia yang sudah didapatkan, disimpan sampai siap digunakan.
B. Ekstraksi Kulit Jeruk Nipis dengan etanol 96%
Pada penelitian ini untuk mendapatkan ekstrak kulit jeruk nipis digunakan proses ekstraksi menggunakan metode maserasi dengan pelarut etanol 96%. Metode ini dipilih dalam proses ekstraksi karena selain metode maserasi merupakan metode yang cukup mudah dan sederhana, maserasi bertujuan untuk melarutkan semua zat yang terkandung dalam sampel menggunakan pelarut yang sesuai serta dapat mencegah rusaknya zat aktif yang terkandung dalam simplisia yang bersifat termolabil. Keuntungan dalam penggunaan metode maserasi adalah bahan yang sudah halus memungkinkan untuk direndam dalam pelarut sampai meresap dan akan melunakan susunan sel, sehingga zat yang mudah larut akan larut (Ansel 1989). Serbuk simplisia sebanyak 500 gram yang dibagi atas dua wadah dengan masing-masing wadah berisi 250 gram direndam dengan pelarut etanol 96% selama sehari.
Penggunaan pelarut etanol 96% pada penelitian ini untuk menarik senyawa polar yang terkandung didalam kulit jeruk nipis. Hasil ekstraksi kemudian dipekatkan menggunakan rotary evaporator. Pemekatkan berarti peningkatkan jumlah senyawa terlarut secara penguapan pelarut tanpa menjadi kondisi kering, maka ekstrak yang diperoleh adalah ekstrak kental dan pekat (Depkes RI 2000).
Setelah proses ekstraksi selesai untuk uji karakteristik ekstrak dilakukan perhitungan presntase rendamen ekstrak. Hasil maserasi kulit jeruk nipis yang didapat dapat dilihat pada table dibawah ini:
13
Table 3. Hasil Ekstraksi Kulit Jeruk Nipis
No. Jenis Hasil
1. Simplisia kulit jeruk nipis 1,5 kg
2. Serbuk kering 880 gram
3. Ekstrak etanol 96% 87,6241 gram
Pada tabel diatas menunjukan adanya penyusutan berat simplisia, mulai dari simplisia kulit jeruk nipis hingga menjadi ekstrak etanol 96% kulit jeruk nipis. Simplisia kulit jeruk nipis diserbukkan dengan menggunakan blender kemudian diayak dengan ayakan mesh nomor 60. Serbuka simplisia ditimbang sebanyak 500 gram dimasukkan kedalam toples kaca untuk dilakukan maserasi dengan etanol 96%. Kemudian seluruh maserat yang didapat dipekatkan dengan rotary evaporator pada suhu 40°C sehingga didapatkan hasil ekstrak etanol kental kulit jeruk nipis sebanyak 87,6241 gram.
C. Hasil Penapisan Fitokimia Kulit Jeruk Nipis
Penapisan fitokimia ekstrak etanol kulit jeruk nipis dilakukan untuk mengetahui kandungan metabolit sekunder yang terkandung pada ekstrak. Hasil penapisan pada tabel 5 menunjukkan bahwa dalam ekstrak etanol kulit jeruk nipis positif mengandung metabolit sekunder flavonoid, alkaloid, tanin, saponin.
Tabel 4. Hasil Uji Identifikasi Skrining Fitokimia
Identifikasi Hasil Keterangan
Flavonoid + Merah kecoklatan
Alkaloid + Ada endapan
Tanin + Hijau kehitaman
Saponin + Terbentuk busa
Keterangan: (+) Ada
D. Hasil Pemeriksaan Mutu Ekstrak Kulit Jeruk Nipis 1. Organoleptis
Pemeriksaan organoletis dilakukan terhadap ekstrak etanol kulit jeruk nipis. Pemeriksaan meliputi bentuk, bau, rasa, dan warna (Depkes RI, 2000). Hasil dapat pemeriksaan organoleptis ekstrak kulit jeruk nipis dapat dilihat pada tabel 4.
14
Tabel 5. Evaluasi Fisik Terhadap Ekstrak Kental Kulit Jeruk Nipis
No Jenis Uji organoleptik
Bentuk Bau Warna Rasa
1. Serbuk Serbuk Halus Khas Kuning hingga hijau Pahit 2. Ekstrak kental Kental Khas Kuning tua Pahit 2. Kadar Air
Penetapan kadar air dilakukan untuk mengetahui batasan minimal atau rentang tentang bsarnya kandungan air di dalam bahan. Hal ini terkait dengan kemurnian dan adanya kontaminan dalam bahan tersebut. Kandungan air yang tinggi dapat menjadi media yang baik bagi pertumbuhan mikroorganisme. Nilai untuk menghindari cepatnya petumbuhan mikroorganisme dalam bahan selama proses penyimpanan. Pengujian kadar air dilakukan di BALITTRO-Bogor, uji kadar air menggunakan metode xylol dengan menggunakan alat Aufhauser dan hasil dapat dilihat pada lampiran 5.
3. Kadar Abu
Penetapan kadar abu memberikan gambaran terhadap kandungan mineral internal dan eksternal yang berasal dari proses awal sampai terbentuknya ekstrak. Penetapan kadar abu juga bermaksud untuk mengetahui jumlah pencemar organik seperti pasir dan tanah yang sering ada di dalam sediaan nabati. Pengujian kadar abu dilakukan di BALITTRO-Bogor, uji kadar abu menggunakan metode gravimetri dan hasil dapat dilihat pada lampiran 5.
F. Pembuatan Masker Peel-Off
Pada penelitian ini dibuat sediaan masker gel peel-off karena lebih efektif dan efisien serta lebih mudah dioleskan diwajah, dibiarkan sampai mongering dan membentuk lapisan film tipis, transparan dan elastis sehingga mudah dilepaskan tanpa dicuci. Sediaan ini bisa memberikan efek yang sesuai terkandung. Formula maske gel yang dibuat sebanyak 2 variasi konsentrasi ekstrak yaitu 15% dan 25%. Eksipien pada formula masker gel yang digunakan adalah PVA sebagai gelling agent yang memiliki sifat adhesive atau dapat membentuk sebuah lapisan film yang dapat mongering. HPMC berfungsi sebagai peningkat viskositas dari basis masker gel. Propilenglikol berfungsi sebagai humektan yang memiliki kemampuan dapat mengikat air (hidrsi) agar sediaan tetap menjadi lembab dan tidak kering bila digunakan. Nipagin dan nipasol digunakan sebagai pengawet, sedangkan etanol 96%
berfungsi sebagai pelarut zat aktif selain itu dapat digunakan untuk mempercepat waktu pengeringan gel sehingga pembentukan film pada masker gel peel-off.
G. Evaluasi Masker Gel Peel-Off
15
Sediaan masker gel peel-off kemudian dievaluasi sifat fisiknya meliputi organoleptis, homogenitas, kecepatan mengering, viskositas, uji pH, uji daya lekat.
1. Organoleptis
Hasil dari pemeriksaan organoleptis masker gel peel-off mengandung ekstrak (F2 dan F3) keseluruhan berwarna coklat, berbau khas jeruk, serta kedua masker gel peel-off terlihat tidak homogen. Kemungkinan ketidakhomogen masker gel peeel-off pada F2 dan F3 dikarenakan pada saat mencampurkan HPMC dengan PVA tidak teraduk hingga merata, sehingga masih terbentuk butiran endapan. Sedangkan formula yang tidak mengandung ekstrak (F1) terlihat jernih (tidak berwarna), tidak berbau, serat masker gel peel-off terlihat homogen.
Gambar 4. Hasil Pembuatan Masker Gel Peel-Off Ekstrak Kulit Jeruk Nipis 2. Kecepatan Mengering
Pengujian waktu kering bertujuan untuk mengetahui berapa lama gel mongering pada permukaan kulit dan membentuk lapisan film. Waktu mengering masker gel berkisar antara 15 menit sampai 20 menit. Dari hasil yang diperoleh semua formula masih memenuhi waktu kering masker gel peel-off yang baik.
Tabel 6. Hasil Uji Waktu Kering Sampel Waktu Kering (Menit)
F1 30
F2 16
F3 17
F1 F2 F3
16 3. Uji pH
Nilai pH dari ketiga sediaan masker gel peel-off berkisar antara 5,65 sampai 6,38.
Sediaan masker gel yang mengandung ekstrak memiliki pH yang lebih asam dibandingkan dengan sediaan yang tidak mengandung ekstrak. Dari data yang dihasilkan, nilai pH ketiga sediaan masker gel masih dalam rentang pH normal kulit yaitu 4,5-6,5. Masker gel sebaiknya memiliki pH yang sesuai dengan pH yang sesuai dengan pH kulit yaitu 4,5-6,5 karena jika gel memiliki pH yang terlalu basa maka dapat menyebabkan kulit menjadi kering, sedangkan jika pH terlalu asam akan menimbulkan iritasi kulit (Djajadisastra, 2004).
Tabel 6. Hasil Uji pH
Sampel pH
F1 5,65
F2 6,25
F3 6,38
4. Viskositas
Pada pemeriksaan viskositas masker gel peel-off menggunakan Viscometer Brookfield DV-E LV dengan spindel s63 dan Rpm 10, 20, 30, 50, 60. Dari uji viskositas masker gel peel-off ekstrak kulit jeruk nipis pada formula 2 (ekstrak 15%) viskositas yang diperoleh lebih tinggi dibandingkan formula 3 (ekstrak 25%).
Tabel 7. Hasil Uji Viskositas Formula 1 (blanko)
Rpm
10 20 30 50 60
cP 513,3 722 410 495 560,66
% 4,27 12,03 10,26 20,63 28,03
Formula 2 (15%) Rpm
10 20 30 50 60
cP 756,67 688 818,67 715,67 758
% 6,3 11,47 20,47 29,83 37,9
Formula 3 (25%) Rpm
10 20 30 50 60
cP 470 502 516 525,33 520,67
% 3,9 8,37 12,9 21,9 26,03
17 5. Uji Aktivitas Inhibitor Tirosinase
Hasil Pengukuran Panjang Gelombang Maksimum
Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan untuk menentukan panjang gelombang yang akan dilakukan pada pengukuran serapan untuk pengujian aktivitas inhibitor tirosinase. Berdasarkan hasil pengukuran, diperoleh puncak serapan yang tertinggi yang merupakan hasil panjang gelombang maksimum pada 478,5 nm. Puncak serapan tertinggi menunjukkan pembentukan dopakrom yang paling banyak.
Hasil Uji Penghambat Tirosinase Dari Ekstrak Kulit Jeruk Nipis
Uji aktivitas inhibitor tirosinase dilakukan memvariasikan konsentrasi ekstrak kulit jeruk nipis yang digunakan dari 85, 65, 45, 25 ppm. Kemudian diukur serapannya dan dihitung persen inhibisinya. Plot ke dalam kurva antara konsentrasi ekstrak vs persen inhibisi dan dapat dilihat pada gambar 7.
Gambar 5. Kurva Konsentrasi Ekstrak (ppm) vs % Inhibisi Hasil Uji Penghambat Tirosinase Dari Masker Gel Ekstrak Kulit Jeruk Nipis
Untuk menghindari pengaruh bahan eksipien yang digunakan dalam formulasi masker gel pada uji aktivitas, maka digunakan masker gel kontrol negatif dengan kandungan bahan eksipien yang sama dengan masker gel yang mengandung ekstrak kulit jeruk nipis. Dalam uji aktivitas inhibitor tirosinase asam kojat digunakan sebagai kontrol positif. Asam kojat dipilih sebagai kontrol positif karena merupakan bahan yang paling banyak digunakan dalam penelitian inhibitor tirosinase (Aytemir dan Karakaya, 2012). Asam kojat adalah inhibitor yang memiliki efek inhibisi dan kestabilan yang besar dalam suatu produk kosmetik (Miyazawa dan Tamura, 2007).
0 5 10 15 20 25
25 45 65 85
Konsentrasi (ppm)
% inhibisi
18
Setelah dilakukan pengukuran serapan dopakrom pada tiap sampel masker gel, maka diperoleh hasil persen inhibisi tirosinase dari masing-masing masker gel. Besarnya persen inhibisi tirosinase dapat dilihat pada tabel 10.
Tabel 9. Nilai Persen Inhibisi Tirosinase Masker Gel Ekstrak Kulit Jeruk Nipis Sampel Rata-rata (%) Inhibisi Tirosinase
Formula 2
17,89
Formula 3
18,86
Dari tabel 8 didapatkan bahwa persen inhibisi tirosinase masker gel formula 2 yang mengandung ekstrak kulit jeruk nipis 15 % sebesar 17,89 %, sedangkan masker gel formula 3 yang mengandung ekstrak kulit jeruk nipis 25 % sebesar 18,86 %. Besarnya nilai persen inhibisi tergantung konsentrasi ekstrak yang digunakan. Masker gel formula 3 yang mengandung ekstrak kulit jeruk nipis lebih banyak dibanding dengan masker gel formula 2.
Kontrol positif memiliki nilai persen inhibisi tirosinase sebesar 18,03 %. Besarnya nilai persen inhibisi kontrol positif masih lebih kecil nilainya dibandingkan dengan masker gel yang mengandung ekstrak sehingga dapat dikatakan masker gel yang mengandung ekstrak jeruk nipis memiliki aktivitas inhibitor tirosinase yang lebih besar.
19 BAB 5 KESIMPULAN
5.1. Kesimpulan
Pada evaluasi organoleptis masker gel peel-off didapatkan hasil yang terlalu encer pada ketiga formula dan tidak homogen pada formula 2 dan 3. Kemungkinan tidak homogennya masker gel peel-off pada formula 2 dan 3 dikarenakan pada saat mencampurkan HPMC dan PVA tidak teraduk hingga merata. Masker gel ekstrak kulit jeruk nipis memiliki sifat sebagai inhibitor tirosinase. Pada formula 2 (dengan ekstrak 15 %) memiliki aktivitas penghambat tirosinase sebesar 17,89 %. Sedangkan pada formula 3 (dengan ekstrak 25 %) hasil yang didapatkan sebesar 18,86..
20
BAB 6. LUARAN YANG DICAPAI
Luaran yang dicapai berisi Identitas luaran penelitian yang dicapai oleh peneliti sesuai dengan skema penelitian yang dipilih.
Jurnal
IDENTITAS JURNAL
1 Nama Jurnal JIFI , Universitas Pancasila
2 Website Jurnal http://jifi.farmasi.univpancasila.ac.id/index.php/jifi 3 Status Makalah Submitte
4 Tanggal Submit 29 Agustus 2019 5 Bukti Screenshot
submit
21
DAFTAR PUSTAKA
Abrahimi, A. 2014. In vitro antioxidant, anti-diabetic, cholinesterase and tyrosinase inhibitory potential of fresh juice from Citrus hystrix and C.maxima fruits. School of Life Sciences. Department of Environmental Sciences. Bharathiar University.
Coimbatore 641 046. Tamil Nadu. India
Arts, I.C. and P.C. Hollman, Polyphenols and disease risk in epidemiologic studies. Am J Clin Nutr, 2005. 81(1 Suppl): p. 317S-325S.
Arung ET, Kusuma IW, Iskandar YM. Yasutake S. Shimizu K. Kondo R. 2005 Screening of Indonesian plants of tyrosinase inhibitory activity. Journal Wood Science 51: 520- 525
Arung , E. T., K. Shimizu., and R. Kondo. 2006. Inhibitory Effect of Artocarpanone from Artocarpus heterophyllus on Melanin Biosynthesis. J. Biol. Pharm. Bull..
Brenner M, Hearing VJ. 2008. The protective Role of Melanin Against UV Damage in Human Skin. Photochemistry and Photobiology 84: 539-549
Chang TS. 2009. An Updated Review of Tyrosinase Inhibitor. International Journal of Molecular Sciences 10: 2440-2475
Chang TS. 2012. Tyrosinase and Tyrosinase Inhibitor. Journal of Biocatalysis and Biotransformation 1 (2): 1-2
Costin, G. E., and Hearing, V. J. 2007. Human Skin Pigmentation: Melanocytes Modulated Skin Color in Response to Stress. FASEB Journal. 21(4):976-94.
Darsika, C., K.V, S., K, S., Grace Fatima, X., dan Shanmuganathan, S., 2015. Preparation and Evaluation of Herbal Peel Off Face Mask. American Journal Of Pharmatech Research, 5: 123-128
Departemen Kesehatan RI. 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat.
Direktorat Jendral Pengawasan Obat Dan Makanan Direktorat Pengawasan Obat Tradisional, Jakarta. Hlm. 31-32
Eliyanoor Basyar. 2012. Penuntun Praktikum Farmakognosi Mikroskopik dan Makroskopik.
Jakarta. Binu Ilmu Mandiri
European Commision Scientific Committee on Cunsumer Products. 2008. Opinion on Kojic Acid Directorate-General for Health & Consumer. Brussels. Hlm. 6-8
Ganceviciene, R., Liakou, A.I., Theodoridis, A., Makrantonaki, E., dan Zouboulis, C.C., 2012. Skin anti-aging strategies. Dermato-endocrinology, 4: 308–319.
Gandjar, I. G., & Rohman, A. 1999. Kimia Farmasi Analisis. Universitas Gadjah Mada Yogyakarta
Guardiola, S. dan Mach, N., 2014. Therapeutic potential of Hibiscus sabdariffa: A review of the scientific evidence. Endocrinología y Nutrición (English Edition), 61: 274–295.
22
Haryanto, S., 2006. Sehat dan Bugar Alami. Jakarta: Penebar Plus
Hindun. S. 2017. Potensi Limbah Kulit Jeruk Nipis (Citrus aurantifolia) Sebagai Inhibitor Tirosinase. Jawa Barat: Fakultas Farmasi Universitas Padjadjaran Jawa Barat
Hoogduijn MJ, Cemeli E, and Ross K. 2004. Melanin Protects Melanocytes And Keratinocytes Against H2O2-Induced DNA Strand Breaks Through Its Ability To Bind Ca2+. Exp Cell Res. 294: 60-67
Khasanah. I. 2014. Uji Aktivitass Antioksidan Ekstrak Etanolik Kulit buah Jeruk Nipis (Citrus aurantifolia) Dengan Metode DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil).
Semarang: Fakultas Farmasi Universitas Wahid Hasyim Semarang
Kyoung-Chan P, Young HS, Ryung CH, Dong-Seok K. 2010. Biology of Melanogenesis and The Search for Hypopigmenting agent. Elsevier Dermatologica Sinica 28: 53-58 Lintner, Karl & Sederma France. Substantion of Skin Whitening Claims. Diambil dari
www.incosmeticsasaa.com/files/pres_wkshp1_substantion_of_skin_whitening_clai ms.pdf (diakses pada tanggal 26 November 2018 pukul 21.15 WIB)
Okwu. 2008. Citrus fruits: A rich source of phytochemicals and their roles inhuman health.
Int J Chem Sci 6(2): 451-471
Sasaki. K dan Yoshizaki F. 2002. Nobiletin as a tyrosinase inhibitor from the peel of citrus fruit. Biol Pharm Bull. 25: 806-808
Sudarmadji, S.; Haryono B.; Suhardi. 1989. Prosedur Analisis untuk Bahan Makanan dan Pertanian. Yogyakarta. Liberty
Tranggono, R. I. dan Latifah, F. 2007. Buku Pegangan Kosmetik. Jakarta: PT. Gramedia Pustaka Utam. Hal. 11-13, 25-27
Winarsi H. 2007. Antioksidan Alami dan Radikal Bebas Potensi dan Aplikasinya Dalam Kesehatan. Yogyakarta: Penerbit Kanisius
23 Lampiran 1. Biodata Peneliti
24
25 Lampiran 2. SURAT PERNYATAAN
26
Lampiran . Bukti Submitte di JIFI ( Jurnal Ilmiah Farmasi Indonesia ) Univ. Pancasila
