Direktorat Riset dan Pengabdian Masyarakat Direktorat Jenderal Riset dan Pengembangan Kementerian Riset, Teknologi, dan Pendidikan Tinggi
Gedung BPPT II Lantai 19, Jl. MH. Thamrin No. 8 Jakarta Pusat http://simlitabmas.ristekdikti.go.id/
PROTEKSI ISI LAPORAN AKHIR PENELITIAN
Dilarang menyalin, menyimpan, memperbanyak sebagian atau seluruh isi laporan ini dalam bentuk apapun kecuali oleh peneliti dan pengelola administrasi penelitian
LAPORAN AKHIR PENELITIAN MULTI TAHUN
ID Proposal: 4e231aac-f1bf-463f-aeed-6ad5670f6149 Laporan Akhir Penelitian: tahun ke-3 dari 3 tahun
1. IDENTITAS PENELITIAN A. JUDUL PENELITIAN
Molecular response of marine microalgae to inhibitions of metabolic enzymes at the formation of light- harvesting apparatus
B. BIDANG, TEMA, TOPIK, DAN RUMPUN BIDANG ILMU Bidang Fokus RIRN / Bidang
Unggulan Perguruan Tinggi Tema Topik (jika ada) Rumpun Bidang Ilmu
Material Maju
Teknologi
eksplorasi potensi material baru
Desain dan eksplorasi material pigmen absorber
Kimia
C. KATEGORI, SKEMA, SBK, TARGET TKT DAN LAMA PENELITIAN Kategori (Kompetitif
Nasional/
Desentralisasi/
Penugasan)
Skema Penelitian
Strata (Dasar/
Terapan/
Pengembangan)
SBK (Dasar, Terapan, Pengembangan)
Target Akhir TKT
Lama Penelitian
(Tahun)
Penelitian Penugasan
World Class
Research SBK Riset Dasar SBK Riset Dasar 3 3
2. IDENTITAS PENGUSUL
Nama, Peran
Perguruan Tinggi/
Institusi
Program Studi/
Bagian Bidang Tugas ID Sinta H-Index
TATAS HARDO PANINTINGJATI
BROT Ketua Pengusul
Universitas Ma
Chung Kimia 257147 14
Dr. Ir Delianis Pringgenies Anggota Pengusul
1
Universitas
Diponegoro Ilmu Kelautan
Isolation and culture of marine microalgae
6007503 2
Dra LEENAWATY LIMANTARA
M.Sc, PhD Anggota Pengusul
2
Universitas Pembangunan
Jaya Tangerang
Teknik Sipil Statistical analysis
of metabolomics 6002025 8
Prof. Koichiro Shizuoka - Analisa genetika 0 0
Awai Anggota Pengusul
4
University dan lipid
3. MITRA KERJASAMA PENELITIAN (JIKA ADA)
Pelaksanaan penelitian dapat melibatkan mitra kerjasama, yaitu mitra kerjasama dalam melaksanakan penelitian, mitra sebagai calon pengguna hasil penelitian, atau mitra investor
Mitra Nama Mitra
4. LUARAN DAN TARGET CAPAIAN Luaran Wajib
Tahun
Luaran Jenis Luaran
Status target capaian ( accepted, published, terdaftar
atau granted, atau status lainnya)
Keterangan (url dan nama jurnal, penerbit, url paten, keterangan sejenis lainnya)
3 Publikasi Ilmiah Jurnal
Internasional accepted/published FEBS Letters Luaran Tambahan
Tahun
Luaran Jenis Luaran
Status target capaian (accepted, published, terdaftar atau granted,
atau status lainnya)
Keterangan (url dan nama jurnal, penerbit, url paten, keterangan
sejenis lainnya)
5. ANGGARAN
Rencana anggaran biaya penelitian mengacu pada PMK yang berlaku dengan besaran minimum dan maksimum sebagaimana diatur pada buku Panduan Penelitian dan Pengabdian kepada Masyarakat Edisi 12.
Total RAB 3 Tahun Rp. 137,860,000 Tahun 1 Total Rp. 0
Tahun 2 Total Rp. 0
Tahun 3 Total Rp. 137,860,000
Jenis Pembelanjaan Item Satuan Vol. Biaya
Satuan Total Analisis Data Biaya analisis sampel Unit 2 5,000,000 10,000,000
Analisis Data HR Sekretariat/Administrasi
Peneliti OB 4 300,000 1,200,000
Bahan Barang Persediaan Unit 5 2,000,000 10,000,000
Bahan ATK Paket 10 206,000 2,060,000
Bahan Bahan Penelitian (Habis
Pakai) Unit 24 3,000,000 72,000,000
Pelaporan, Luaran Wajib, dan Luaran Tambahan
Publikasi artikel di Jurnal
Internasional Paket 1 28,000,000 28,000,000
Pelaporan, Luaran Wajib,
dan Luaran Tambahan Biaya seminar internasional Paket 2 4,000,000 8,000,000
Pengumpulan Data Transport OK
(kali) 2 1,500,000 3,000,000
Jenis Pembelanjaan Item Satuan Vol. Biaya
Satuan Total Pengumpulan Data HR Sekretariat/Administrasi
Peneliti OB 4 300,000 1,200,000
Pengumpulan Data HR Pembantu Peneliti OJ 96 25,000 2,400,000
6. HASIL PENELITIAN
A. RINGKASAN: Tuliskan secara ringkas latar belakang penelitian, tujuan dan tahapan metode penelitian, luaran yang ditargetkan, serta uraian TKT penelitian.
Fokus penelitian pada tahun ke-3 adalah untuk menentukan fungsi antioksidasi fukosantin dalam antena penangkap cahaya, yaitu fucoxanthin-chlorophyll a/c binding protein (FCP), yang terdapat pada mikroalga laut Chaetoceros (C.) calcitrans. Fukosantin merupakan karotenoid yang dapat berfungsi untuk meredam spesies oksigen reaktif (ROS), oleh karena itu perlu dilakukan pengujian peranan fukosantin pada komplek FCP yang diberikan perlakuan oksidasi, selain itu dilakukan juga karakterisasi komposisi metabolit utama pada sel diatom ini.
Pada laporan kemajuan ini akan diuraikan hasil penelitian yang sudah diperoleh, diantaranya adalah (1) Stereomutasi fukosantin dalam matrik alami dan dalam pelarut organik; (2) Isolasi FCP dari sel C. calcitrans; (3) Stabilitas FCP yang diberi perlakuan oksidasi secara kimiawi menggunakan hidrogen peroksida (H2O2); (4) Analisis metabolit polar dan non-polar dari sel diatom C. calcitrans.
B. KATA KUNCI: Tuliskan maksimal 5 kata kunci.
diatom; fucoxanthin-chlorophyll a/c binding protein (FCP); spesies oksigen reaktif (ROS);
senyawa metabolit
Pengisian poin C sampai dengan poin H mengikuti template berikut dan tidak dibatasi jumlah kata atau halaman namun disarankan seringkas mungkin. Dilarang menghapus/memodifikasi template ataupun menghapus penjelasan di setiap poin.
C. HASIL PELAKSANAAN PENELITIAN: Tuliskan secara ringkas hasil pelaksanaan penelitian yang telah dicapai sesuai tahun pelaksanaan penelitian. Penyajian dapat berupa data, hasil analisis, dan capaian luaran (wajib dan atau tambahan). Seluruh hasil atau capaian yang dilaporkan harus berkaitan dengan tahapan pelaksanaan penelitian sebagaimana direncanakan pada proposal. Penyajian data dapat berupa gambar, tabel, grafik, dan sejenisnya, serta analisis didukung dengan sumber pustaka primer yang relevan dan terkini.
Pengisian poin C sampai dengan poin H mengikuti template berikut dan tidak dibatasi jumlah kata atau halaman namun disarankan seringkas mungkin. Dilarang menghapus/memodifikasi template ataupun menghapus penjelasan di setiap poin.
Fokus penelitian pada tahun ke-3 adalah untuk menentukan fungsi antioksidasi fukosantin dalam antena penangkap cahaya, yaitu fucoxanthin-chlorophyll a/c binding protein (FCP), yang terdapat pada mikroalga laut Chaetoceros (C.) calcitrans. Fukosantin merupakan karotenoid yang dapat berfungsi untuk meredam spesies oksigen reaktif (ROS), oleh karena itu perlu dilakukan pengujian peranan fukosantin pada komplek FCP yang diberikan perlakuan oksidasi, selain itu dilakukan juga karakterisasi komposisi metabolit utama pada sel diatom ini.
Pada laporan kemajuan ini akan diuraikan hasil penelitian yang sudah diperoleh, diantaranya adalah (1) Stereomutasi fukosantin dalam matrik alami dan dalam pelarut organik; (2) Isolasi FCP dari sel C. calcitrans;
(3) Stabilitas FCP yang diberi perlakuan oksidasi secara kimiawi menggunakan hidrogen peroksida (H2O2); (4) Analisis metabolit polar dan non-polar dari sel diatom C. calcitrans.
(1) Stereomutasi fukosantin dalam matrik alami dan dalam pelarut organik
Fukosantin seperti karotenoid pada umumnya akan mudah mengalami stereomutasi jika diberikan perlakukan eksternal baik dalam matrik alami dan dalam pelarut organik. Perlakukan pengeringan dengan oven pada Padina australis, sebagai sumber potensial fukosantin, dapat menyebabkan perubahan struktur geometri dari fukosantin. Gambar 1 menyajikan kromatogram KCKT dari ekstrak pigmen P. australis yang dikeringkan pada suhu 60°C. Isomer all-trans dan cis dari fukosantin, all-trans (puncak 1), 13ʹ-cis (puncak 2), 13-cis (puncak 3), dan 9ʹ-cis (puncak 4), dapat diidentifikasi berdasarkan spektrum serapan, spektrum massa dan juga profil pemisahan dengan KCKT. Pengeringan P. australis dengan oven pada suhu 60°C menyebabkan isomerisasi all-trans menjadi isomer-isomer cis yang ditunjukkan dengan meningkatnya konsentrasi isomer cis fukosantin. Konsentrasi isomer all-trans fukosantin dari P. australis yang dikeringkan pada suhu 60°C sebesar 229,1 μg/g berat kering mengalami penurunan sebesar 5,3% dibandingkan jika P. australis dikeringkan pada suhu 40°C, sedangkan penurunan konsentrasi all-trans fukosantin lebih besar pada suhu oven 80°C (20,9%) dan 100°C (90,0%). Suhu oven pada 60°C untuk pengeringan P. australis merupakan suhu optimal untuk menjaga konsentrasi all-trans fukosantin, sedangkan oven pada suhu 80°C merupakan suhu optimal untuk menghasilkan konsentrasi tinggi isomer-isomer cis fukosantin.
Gambar 1. Profil elusi KCKT dideteksi pada 450 nm dari ekstrak pigmen P. australis yang dikeringkan menggunakan oven pada suhu 60°C selama 25,5 jam.
C. HASIL PELAKSANAAN PENELITIAN: Tuliskan secara ringkas hasil pelaksanaan penelitian yang telah dicapai sesuai tahun pelaksanaan penelitian. Penyajian dapat berupa data, hasil analisis, dan capaian luaran (wajib dan atau tambahan). Seluruh hasil atau capaian yang dilaporkan harus berkaitan dengan tahapan pelaksanaan penelitian sebagaimana direncanakan pada proposal. Penyajian data dapat berupa gambar, tabel, grafik, dan sejenisnya, serta analisis didukung dengan sumber pustaka primer yang relevan dan terkini.
Isomerisasi all-trans fukosantin juga terjadi dalam pelarut organik dengan pemberian perlakuan thermal pada suhu 90°C selama 180 menit yang dapat dilihat pada Gambar 2. All-trans fukosantin (puncak 1) terkonversi menjadi 2 jenis isomer cis yaitu 13ʹ-cis (puncak 2) and 13-cis (puncak 3) dengan perlakuan thermal dalam asetonitril. Hasil ini, all-trans fukosantin yang terisomerisasi secara dominan menjadi 13ʹ-cis and 13-cis, sesuai dengan stereomutasi fukosantin dalam minyak canola (Zhao et al., 2014).
Gambar 2. Profil elusi KCKT dari all-trans fukosantin setelah perlakuan thermal pada 90C selama 180 menit dalam pelarut asetonitril.
(2) Isolasi kompleks fucoxanthin-chlorophyll protein (FCP) dari diatom Chaetoceros (C.) calcitrans Sel diatom Chaetoceros (C.) calcitrans dipanen melalui sentrifugasi (Kubota) dengan kecepatan 10000 rpm selama 5 menit sebelum masuk ke tahapan isolasi kompleks fucoxanthin-chlorophyll protein (FCP). Isolasi FCP dilakukan dengan bantuan beberapa buffer dengan berbagai pH. Daftar buffer yang digunakan untuk isolasi dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Buffer yang digunakan untuk isolasi kompleks FCP
Buffer Bahan Jumlah
Buffer A (1000 mL) MES (50 mM) 9.76 g
MgCl2 (10 mM) 0.95211 g
CaCl2 (5 mM) 0.5549 g
NaOH (5N) Diteteskan hingga mencapai pH 6,5
Buffer A dengan gliserol dan DNase
Buffer A 50 mL
Glycerol (25%) 25 µL
DNase (0.5 µg/mL) 12.5 mL
Buffer B (1000 mL) MES (25 mM) 4.88 g
NaCl (10 mM) 0.5844 g
CaCl2 (5 mM) 0.5549 g
NaOH (5N) Diteteskan hingga mencapai pH 5,7
DDM (0.03% w/v) 0.3 g
Buffer B dengan sukrosa Buffer B 500 mL
Sukrosa (1 M, untuk larutan stok) 171.15 g
Buffer C (1000 mL) MES (25 mm) 4.88 g
1
3 2
NaOH (5N) Diteteskan hingga mencapai pH 5,7
DDM (0.03 % w.v) 0.3 g
Buffer C dengan NaCl Buffer C 500 mL
NaCl (250 mM, untuk larutan stok) 7.305 g
Sel diatom sebanyak 0,5 – 1 g dihomogenisasi dengan vortex selama 1 menit dalam Buffer A yang dicampur dengan gliserol (25% v/v) dan DNase (0,5 µg/mL). Sel yang telah dihomogenisasi kemudian disentrifuse (40 000 × g, 4 °C) selama 4 menit untuk menghilangkan pengotor-pengotornya. Pelet hasil sentrifuse dihomogenisasi kembali dengan vortex selama 1 menit dalam Buffer A dan disentrifuse lagi (40 000
× g, 4 °C) selama 4 menit. Langkah ini dilakukan sebanyak tiga kali. Membran sel yang didapatkan setelah sentrifuse (supernatan) disolubilisasi dengan DDM (10 mM atau 0,51 % w/v) dalam Buffer A. Solubilisasi dilakukan dalam kondisi dingin dan gelap selama 20 menit. Untuk mendapatkan kromatofor, membran yang telah disolubilisasi lalu disentrifuse (15 000 × g, 4 °C) selama 10 menit dan diambil supernatannya. Isolasi FCP dari kromatofor dilanjutkan dengan sucrose density gradient centrifugation (SDGC) menggunakan Buffer B yang dicampur dengan sukrosa pada beberapa konsentrasi, yaitu 0,2; 0,4; 0,6 dan 0,8 M. Buffer B dengan tiap konsentrasi sukrosa berbeda ditata dalam tabung sentrifuse. Membran hasil solubilisasi ditempatkan pada lapisan teratas kemudian disentrifuse selama 16 jam (200 000 × g, 4 °C). Fraksi bewarna coklat dari hasil SDGC kemudian dimurnikan dengan ion exchange chromatography menggunakan resin DE52 dan Buffer C yang dicampur dengan NaCl pada beberapa konsentrasi (50, 100, 150, 200 dan 250 mM) untuk mengelusi FCP. NaCl yang masih tertinggal dalam FCP dihilangkan dengan mengelusi FCP pada kolom PD10. Selanjutnya, FCP dipekatkan menggunakan vivaspin untuk meningkatkan absorbansinya. Hasil pengukuran spektra absorpsi UV- Vis terhadap FCP yang telah dimurnikan ditunjukkan pada Gambar 3. Pada spektra absorpsi terlihat jelas puncak serapan pada panjang gelombang 440 dan 672 nm yang sesuai dengan hasil dari penelitian sebelumnya oleh Mizoguchi dkk. (2017) dan Yamano dkk. (2018). Berdasarkan Yamano dkk. (2018), kedua puncak tersebut menunjukkan adanya transisi Soret dan Qy dari klorofil a. Puncak serapan kecil pada panjang gelombang 587 dan 636 nm menandakan transisi Qx dan Qy dari klorofil c. Sementara itu, area lebar di bawah panjang gelombang 450-550 nm menunjukkan dideteksinya karotenoid jenis fukosantin. Puncak 440 nm tampak diapit oleh bahu pada 420 dan 460 nm di mana keduanya mempunyai intensitas yang relatif sama,
Gambar 3. Spektra absorpsi dari FCP yang telah dimurnnikan menunjukkan adanya puncak serapan pada panjang gelombang 440 dan 672 nm
Identifikasi pigmen yang menyusun FCP juga dapat dilakukan dengan menganalisa profil spektra fluoresens (emisi dan eksitasi) dari sampel. Gambar 4 menunjukkan spektra emisi (warna merah, biru, hijau, dan kuning) dari FCP yang dieksitasi pada beberapa panjang gelombang yaitu 420, 407, 440, dan 460 nm. Keempat spektra emisi tersebut sama-sama menunjukkan puncak pada panjang gelombang 678 nm serta sedikit shoulder pada 730 nm di mana ini menggambarkan transisi Qy dari klorofil a yang terikat pada kompleks FCP. Selain itu, terlihat jelas puncak kecil pada 645 nm pada spektra emisi yang dieksitasi pada panjang gelombang 440 dan 460 nm, sementara pada dua spektra emisi lainnya hanya tampak seperti shoulder. Sayap emisi pada panjang gelombang 645 nm tersebut menandakan fluoresens dari klorofil c (Akimoto et al., 2014; Yamano et al., 2018).
peak maxima = 407 nm (total volume = 18 ml) 407
Absorbance 672
Wavelength (nm)
300 400 500 600 700 800
0 0.2 0.4 0.6 0.8
440
672
Absorbance
Wavelength (nm) 420 460
587 636
300 400 500 600 700 800
0 0.2 0.4 0.6 0.8
Gambar 4. Spektra fluoresens emisi dan eksitasi dari FCP
(3) Stabilitas FCP yang diberi perlakuan oksidasi secara kimiawi
Untuk mempelajari kestabilan FCP, dilakukan eksperimen dengan menggunakan oksidator kuat, yaitu H2O2 dengan konsentrasi 150 mM dan 300 mM. Spektra FCP diatur pada λ440 = ± 1. Pengamatan dilakukan selama 2 jam dan tiap rentang waktu tertentu (0, 5, 15, 30, 60, 90, 120 menit) dilakukan pengukuran spektra absorpsi FCP. Gambar 5 menunjukkan hasil pengukuran spektra absorpsi FCP kontrol dan FCP yang dicampur dengan H2O2.
(a) (b)
(c)
Gambar 5. Spektra absorpsi dari FCP kontrol (a) dan FCP yang dicampur dengan H2O2 150 mM (b) dan H2O2 300 mM (c) dengan pengamatan pada menit 0, 5, 15, 30, 60, 90, 120
678
645
Em (Ex-420) Em (Ex-407) Em (Ex-440) Em (Ex-460) Ex (Em-678)
Intensity
Wavelength (nm)
730 420
440 407 460
200 300 400 500 600 700 800
0 200 400 600 800 1000
min 0 min 5 min 15 min 30 min 60 min 90 min 120
Absorbance
Wavelength (nm)
300 400 500 600 700 800
0 0.2 0.4 0.6 0.8
1 min 0 min 5
min 15 min 30 min 60 min 90 min 120
Absorbance
Wavelength (nm)
300 400 500 600 700 800
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
min 0 min 5 min 15 min 30 min 60 min 90 min 120
Wavelength (nm)
Absorbance
200 300 400 500 600 700 800
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Perubahan absorbansi pada pola spektra Gambar 5, baik pada puncak 445nm, 460 nm, 541 nm, dan 672 nm, hampir tidak dapat diamati karena penurunannya sangat minimal. Namun demikian, perubahan absorbansi dapat dilihat melalui perhitungan persentase penurunan absorbansi yang disajikan pada Gambar 6. Hasil eksperimen oksidasi terhadap FCP pada puncak 445 nm menunjukkan penurunan absorbansi yang tidak terlalu besar. Pada FCP kontrol, dapat diamati bahwa penurunan absorbansi sekitar 0,53% yaitu dari 1,129 pada awal pengamatan menjadi 1,123 setelah 120 menit. Sementara pada FCP yang dicampur dengan 150 mM H2O2, penurunan absorbansinya lebih besar yaitu sekitar 1,12%, dari 0,978 pada menit ke 0 menjadi 0,967 pada menit ke 120. Oksidator dengan konsentrasi lebih tinggi (300 mM) juga menimbulkan penurunan intensitas yang lebih tinggi di mana pada menit ke 120 penurunan intensitasnya mencapai 4,19% pada puncak 445 nm.
Selanjutnya, pengaruh penambahan oksidator juga diamati pada panjang gelombang 460 nm (Gambar 6b) di mana penurunan intensitas pada FCP kontrol masih lebih kecil dibandingkan pada puncak 445 nm yaitu sebesar 0,40 %. Semakin tinggi konsentrasi H2O2 yang ditambahkan pada FCP maka penurunan intensitasnya juga semakin tinggi. Penambahan 150 mM dan 300 mam H2O2 menyebabkan penurunan intensitas sebesar 1,96% dan 8,15% pada panjang gelombang 460 nm setelah perlakuan selama 120 menit.
Sementara itu pada puncak 672 nm (Gambar 6d), hasil pengamatan FCP kontrol pada menit ke 0 menunjukkan absorbansi pada 0,534 dan turun sebesar 4,68% menjadi 0,509 setelah berjalan selama 120 menit.
Namun demikian, penurunan absorbansi pada FCP yang dicampur dengan H2O2 lebih kecil dibandingkan pada kontrol. Absorbansi menit ke 0 pada FCP yang dicampur dengan 150 mM H2O2 adalah 0,438, dan turun sebesar 4,34% menjadi 0,419. Penurunan intensitas sebesar 11,46% didapati saat konsentrasi oksidator H2O2 ditingkatkan menjadi 300 mM.
(a) (b)
(c) (d)
Gambar 6. Penurunan absorbansi dari FCP kontrol (—) dan FCP yang dicampur dengan H2O2 150 mM (—) dan 300 mM (—) . Pengamatan dilakukan pada panjang gelombang 445 nm (a), 460 nm (b), 541 nm (c),
dan 672 nm (d)
Penurunan intensitas pada panjang gelombang 541 nm tampak paling besar dibandingkan pada panjang gelombang yang lain (Gambar 6c). Bahkan pada FCP kontrol, penurunannya mencapai 8,68% selama 120 menit eksperimen. Namun demikian, pada FCP yang ditambahan 150 mM H2O2, penurunan intensitasnya tercatat sebesar 6,74% (lebih rendah dibandingkan FCP kontrol). Penurunan intensitas ini semakin besar dengan
meningkatnya konsentrasi H2O2 sebagai oksidator di mana penambahan 300 mM H2O2 mampu menurunkan intensitas sebesar 17,37% pada panjang gelombang 541 nm.
Dari eksperimen ini dapat diambil kesimpulan bahwa keberadaan H2O2 mempunyai pengaruh paling kecil terhadap puncak 445 nm karena adanya karotenoid yang mampu memproteksi klorofil. Di sisi lain, dengan adanya H2O2, kestabilan puncak 672 nm yang merupakan Qy dari klorofil mengalami degradasi yang lebih besar daripada puncak 445 dan 460 nm. Hasil ini serupa dengan eksperimen Fiedor dkk. (2012) yang mempelajari kestabilan B870 dan Spheroidene-LH1 dengan oksidator yang sama. Dalam hasil penelitian tersebut dijelaskan adanya efek protektif karotenoid terhadap kompleks LH1 di mana setelah berjalan 90 menit, puncak karotenoid-LH1 lebih tinggi dibandingkan puncak B870 (Fiedor et al., 2012).
(a) (b) (c)
(d) (e) (f)
(g) (h) (i)
Gambar 7. Spektra fluorosens FCP pada eksperimen dengan H2O2 yang diamati pada menit ke 0, 30, 60, 90 , dan 120: spektra emisi yang dieksitasi pada 445 nm dan eksitasi dengan emisi pada 645 (a), 678 (b), dan 730 nm (c); spektra emisi yang dieksitasi pada 460 nm dan eksitasi dengan emisi pada 645 (d), 678 (e), dan 730 nm (f); spektra emisi yang dieksitasi pada 541 nm dan eksitasi dengan emisi pada 645 (g), 678 (h), dan 730 nm (i).
Perubahan spektra pada FCP yang dioksidasi dengan H2O2 juga diamati pada spektra fluoresensnya (emisi dan eksitasi). Pengamatan pola spektra emisi dilakukan dengan mengeksitasi FCP pada panjang gelombang 445, 460, dan 541 nm. Sementara untuk pengamatan pola spektra eksitasi dilakukan pada panjang gelombang 645, 678, dan 730 nm yang merupakan puncak serta shoulder yang muncul pada spektra emisinya.
min 0 min 30 min 60 min 90 min 120
EMISI 678
645
730 (Ex at 445 nm)
EKSITASI (Em at 645 nm)
Wavelength (nm)
Intensity
451
587
200 300 400 500 600 700 800
0 200 400 600 800 1000 1200
min 0 min 30 min 60 min 90 min 120 EMISI 678
730 (Ex at 445 nm) EKSITASI
(Em at 678 nm)
Wavelength (nm)
Intensity
415
512 620645
200 300 400 500 600 700 800
0 200 400 600 800 1000
1200 min 0
min 30 min 60 min 90 min 120
EMISI 678
645
730 (Ex at 445 nm)
EKSITASI (Em at 730 nm)
Wavelength (nm)
Intensity
420 673
200 300 400 500 600 700 800
0 200 400 600 800 1000 1200
min 0 min 30 min 60 min 90 min 120
EMISI
EKSITASI
(Ex at 460 nm)
(Em at 645 nm)
678
645
730 451
587
Wavelength (nm)
Intensity
200 300 400 500 600 700 800
0 200 400 600 800 1000
1200 min 0min 30
min 60 min 90 min 120 EMISI EKSITASI
(Ex at 460 nm) (Em at 678 nm)
678
730 415
512
Wavelength (nm)
Intensity
620 645
200 300 400 500 600 700 800
0 200 400 600 800 1000 1200
min 0 min 30 min 60 min 90 min 120
EMISI
EKSITASI
(Ex at 460 nm)
(Em at 730 nm)
678
645
730 420
Wavelength (nm)
Intensity
673
200 300 400 500 600 700 800
0 200 400 600 800 1000 1200
min 0 min 30 min 60 min 90 min 120
EMISI EKSITASI (Ex at 541 nm) (Em at 645 nm)
451 678
587
Wavelength (nm)
Intensity
200 300 400 500 600 700 800
0 200 400 600 800 1000
1200 min 0
min 30 min 60 min 90 min 120
EMISI EKSITASI
(Ex at 541 nm) (Em at 645 nm)
678 415
512
Wavelength (nm)
Intensity
620
200 300 400 500 600 700 800
0 200 400 600 800 1000 1200
min 0 min 30 min 60 min 90 min 120
EMISI
EKSITASI
(Ex at 541 nm)
(Em at 730 nm)
678
420 673
Wavelength (nm)
Intensity
730
200 300 400 500 600 700 800
0 200 400 600 800 1000 1200
Spektra emisi yang ditampilkan pada Gambar 7 memiliki intensitas yang berbeda-beda karena dieksitasi pada panjang gelombang yang berbeda pula. Misalnya pada Gambar 7a-c, spektra emisinya didapatkan melalui eksitasi pada panjang gelombang 445 nm. Bila dibandingkan dengan spektra emisi yang dieksitasi pada panjang gelombang 460 nm (Gambar 7d-f) dan 541 nm (Gambar 7g-i), penggunaan eksitasi 445 nm mampu memberikan sinyal emisi tertinggi karena 445 nm merupakan puncak tertinggi pada spektra UV-Vis (Gambar 5) sehingga dapat memberikan energi eksitasi yang tinggi pula.
Spektra emisi yang dihasilkan melalui eksitasi baik pada panjang gelombang 445, 460, dan 541 nm memiliki pola yang relatif sama sepanjang pengamatan selama 120 menit, tetapi dengan intensitas yang berbeda-beda karena adanya tambahan oksidator H2O2. Misalnya pada puncak emisi di 678 nm (Gambar 8b), selama pengamatan di menit ke 30 hingga 60, intensitas emisinya mengalami peningkatan, namun mengalami penurunan di menit ke 90, dan kemudian naik kembali di menit ke 120. Intensitas puncak emisi 645 nm di spektra emisi yang lain (yang dieksitasi pada panjang gelombang 460 dan 541 nm) memiliki pola pergerakan yang serupa (Gambar 8a-c).
(a) (b)
(c)
Gambar 8. Pola pergerakan intensitas spektra emisi pada puncak 645 nm (a) dan 678 bm (b) serta dan shoulder pada 730 nm (c).
Keberadaan H2O2 sebagai oksidator menimbulkan perubahan biokimia pada mikroalga terutama pada pigmennya. Pada laporannya tahun 2019, Hussain dkk. mempelajari pengaruh penambahan H2O2 terhadap perubahan pada pigmen dalam mikroalga Synechococcus (S.) aeruginosus. Secara singkat dapat dijelaskan bahwa dengan semakin tingginya penambahan H2O2, perubahan yang terjadi pada pigmen yang terkandung dalam mikroalga tersebut menjadi semakin besar. Perlakuan penambahan 1 mM H2O2 pada S. aeruginosus tidak mempengaruhi kandungan klorofil secara signifikan. Namun ketika konsentrasi H2O2 ditingkatnya menjadi 25 mM, kandungan klorofil yang tersisa adalah sekitar 25%. Peningkatan konsentrasi H2O2 juga menyebabkan penurunan kandungan beta-karoten walaupun tidak sebesar klorofil di mana penambahan 25 mM H2O2 menurunkan konsentrasi beta-karoten menjadi sekitar 40%. Penurunan konsentrasi pigmen juga terjadi pada fikosianin, allofikosianin, fikoeritrin, serta total karotenoid. Drabkova dkk. (2007) menjelaskan bahwa beberapa mikroalga rentan terhadap H2O2 karena mempunyai kompleks antena penangkap cahaya di luar membran tilakoid sehingga langsung terpapar oksidasi.
(4) Analisis metabolit polar dan non-polar pada diatom C. calcitrans
Analisis komponen senyawa metabolit pada diatom C. calcitrans dilakukan menggunakan GCMS dengan 2 metode. Untuk analisis senyawa metabolit polar, digunakan kolom Rtx-5MS. Sementara untuk senyawa asam lemak (non-polar), analisis dilakukan dengan kolom Rtx-WAX. Data senyawa yang keluar pada waktu retensi tertenti diidentifikasi dengan mencocokkan spektra massa dengan library dari WILEY. Senyawa dengan similaritas tinggi (≥ 85%) diidentifikasi sebagai metabolit pada C. calcitrans. Masing-masing senyawa yang teridentifikasi dihitung nilai area/g dw untuk mengetahui jumlah komposisi senyawa yang terkandung.
Gambar 9. Kelompok senyawa metabolit beserta nilai area/g dw pada C. calcitrans yang terdeteksi mealui analisis GCMS dengan kolom Rtx-5MS.
(a) (b)
Gambar 10. Komposisi senyawa asam amino (a) dan gula (b) pada diatom C. calcitrans
Gambar 9 menunjukkan komposisi dan nilai area/g dw dari kelompok senyawa yang diidentifikasi dari analisis GCMS menggunakan kolom Rtx-5MS di mana terdapat 4 kelompok yang terdeteksi, yaitu golongan aldehid, asam amino, gula, dan gula alkohol. Kelompok aldehid dan gula alkohol masing-masing memiliki satu senyawa yang terdeteksi, yaitu butiraldehid (6,21 × 107 area/g dw) dan inositol (3,38 × 106 area/g dw).
Sementara itu, kelompok asam amino dan gula masing-masing memiliki 6 dan 5 senyawa yang terdeteksi melalui GCMS (Gambar 10). Dapat dilihat pada Gambar 10 bahwa senyawa yang terdeteksi sebagai asam amino adalah glisin, asam aspartat, prolin, asam glutamat, asparagin, dan tirosin. Asam glutamat memiliki nilai area paling besar dibandingkan asam amino lainnya, yaitu 2,04 × 107 area/g dw. Nilai area selanjutnya untuk golongan asam amino adalah : asparagine 8,63 × 106 area/g dw; asam aspartat 7,11 × 106 area/g dw; tirosin 4,52
× 106 area/g dw; glisin 2,67 × 106 area/g dw; prolin 1,65 × 106 area/g dw. Jumlah nilai area dari asam amino yang terdiri dari 6 senyawa tersebut adalah 4,50 × 107 area/g dw. Senyawa metabolit yang terdeteksi dengan Rtx-5MS dalam jumlah paling tinggi adalah golongan gula. Dengan nilai area total sebesar 1,26 × 108 area/g dw, kelompok gula yang terkandung dalam C. calcitrans adalah fruktosa, glukosa, mannosa, melibiosa, dan sukrosa. Melibiosa merupakan kelompok gula yang mempunyai nilai area tertinggi di antara senyawa gula yang lain (8,94 × 107 area/g dw). Selanjutnya, nilai area untuk glukosa, mannosa, sukrosa, dan fruktosa adalah 1,79 × 107 area/g dw; 1,30 × 107 area/g dw; 2,89 × 106 area/g dw; dan 2,47 × 106 area/g dw.
Gambar 11. Komposisi dan nilai area/g dw dari asam lemak yang terdeteksi dalam analisis dengan GCMS pada C. calcitrans dengan kolom Rtx-WAX
Penggunaan kolom Rtx-WAX dalam analisis metabolit GCMS berfungsi untuk mendeteksi kelompok asam lemak yang terkandung pada C. calcitrans. Gambar 11 menunjukkan komposisi dari kelompok asam lemak yang terdapat pada C. calcitrans beserta nilai area/g dw-nya. Asam lemak yang terkandung pada C.
calcitrans adalah asam heksadekanoat (asam palmitat), asam heksadekatrienoat (asam roughanat), asam octadekanoat (asam stearat), dan metil eikosa pentaenoat (EPA teresterifikasi). Asam palmitat merupakan asam lemak yang paling tinggi kandungannya dalam diatom C. calcitrans yaitu 7,39 × 109 area/g dw. Urutan kandungan asam lemak selanjutnya adalah asam roughanat (1,83 × 109 area/g dw), EPA teresterifikasi (3,51 × 108 area/g dw), dan asam stearat (1,51 × 108 area/g dw). Dibandingkan metabolit lainnya (aldehid, asam amino, gula, gula alkohol) di mana total nilai areanya adalah 1,1 × 109 area/g dw, asam lemak pada diatom C. calcitrans memiliki kandungan total yang lebih tinggi, yaitu 9,72 × 109 area/g dw.
Beberapa literatur menunjukkan hasil yang bervariasi mengenai komposisi maupun kandungan metabolit dari diatom. Lemus dkk. (2006) melaporkan kandungan protein, lipid, dan karbohidrat dapat bervariasi tergantung pada kondisi pertumbuhannya. Sistem kultur semikontinyu mampu menghasilkan protein dengan konsentrasi paling tinggi yaitu 22 pg/sel. Sementara kandungan lipid dan karbohidratnya lebih rendah, yaitu 19 pg/sel, dan 4,2 pg/sel. Sementara itu dalam publikasinya, de Jesus-Campos dkk (2020) menyebutkan bahwa protein pada diatom C. muelleri memiliki kandungan tertinggi dibandingkan lipid dan karbohidrat. Konsentrasi masing-masing senyawa juga dapat berubah jika diatom ditumbuhkan pada medium dengan konsentrasi nitrogen yang berbeda-beda. Semakin tinggi konsentrasi nitrogen pada medium berkontribusi pada meningkatnya kandungan protein pada diatom karena unsur nitrogen diperlukan dalam pembentukan protein.
Sementara itu, trend penurunan dijumpai pada kandungan karbohidrat di mana dengan bertambahnya konsentrasi nitrogen, kandungan karbohidrat pada diatom menjadi semakin turun. Kandungan lipid juga memiliki trend pergerakan yang hampir sama seperti karbohidrat.
D. STATUS LUARAN: Tuliskan jenis, identitas dan status ketercapaian setiap luaran wajib dan luaran tambahan (jika ada) yang dijanjikan pada tahun pelaksanaan penelitian. Jenis luaran dapat berupa publikasi, perolehan kekayaan intelektual, hasil pengujian atau luaran lainnya yang telah dijanjikan pada proposal. Uraian status luaran harus didukung dengan bukti kemajuan ketercapaian luaran sesuai dengan luaran yang dijanjikan. Lengkapi isian jenis luaran yang dijanjikan serta mengunggah bukti dokumen ketercapaian luaran wajib dan luaran tambahan melalui Simlitabmas mengikuti format sebagaimana terlihat pada bagian isian luaran
Berikut adalah status luaran wajib berupa Jurnal Ilmiah Internasional Bereputasi:
Judul: Simultaneous purification of fucoxanthin isomers from brown seaweeds by open-column and high-performance liquid chromatography. Target Jurnal: Journal of Chromatography B, Impact factor:
3.205, Q2 SJR, Status: Submitted, 03.09.2021.
Luaran Tambahan Konferensi Internasional:
Sebagai Speaker dalam. Acara: The 4rd International Conference on Marine Science 2021 “Marine Science and Technology Contributions to the Sustainable Development Goal Life below Waters”, Bogor, 24-25 Agustus 2021, diselenggarakan oleh Department Of Marine Science And Technology Faculty Of Fisheries And Marine Science IPB University. Judul Presentasi: Exploring bioactive pigments from marine bacterial isolate from the Indonesian seas. Bukti kegiatan: Sertifikat, buku abstrak, dan publikasi pada International Proceedings indexed by SCOPUS (status prosiding sudah acceptance).
E. PERAN MITRA: Tuliskan realisasi kerjasama dan kontribusi Mitra baik in-kind maupun in-cash (jika ada). Bukti pendukung realisasi kerjasama dan realisasi kontribusi mitra dilaporkan sesuai dengan kondisi yang sebenarnya.
Bukti dokumen realisasi kerjasama dengan Mitra diunggah melalui Simlitabmas mengikuti format sebagaimana terlihat pada bagian isian mitra
Tidak ada mitra yang terlibat.
F. KENDALA PELAKSANAAN PENELITIAN: Tuliskan kesulitan atau hambatan yang dihadapi selama melakukan penelitian dan mencapai luaran yang dijanjikan, termasuk penjelasan jika pelaksanaan penelitian dan luaran penelitian tidak sesuai dengan yang direncanakan atau dijanjikan.
Terdapat kendala dalam melakukan penelitian pada saat kondisi pandemi covid-19 dengan adanya pemberlakuan pembatasan sosial berskala besar dan atau pemberlakukan pembatasan kegiatan masyarakat, dimana di laboratorium MRCPP, Universitas Ma Chung berlaku penjadualan bekerja di kantor dan bekerja di rumah sesuai dengan Memo Rektor Universitas Ma Chung yang sudah diterbitkan sebagai berikut:
1. Memo Rektor Nomor 008/Memo/REKTOR/VII/2021 tanggal 2 Juli 2021 Perihal: Pengaturan Pelaksanaan Pekerjaan selama Masa Pemberlakuan Pembatasan Kegiatan Masyarakat (PPKM) Darurat 2. Memo Rektor Nomor 010/Memo/REKTOR/VII/2021 tanggal 20 Juli 2021 Perihal: Perpanjangan
Pelaksanaan Pekerjaan dengan Skema Bekerja dari Rumah (BDR)
3. Memo Rektor Nomor 012/Memo/REKTOR/VII/2021 tanggal 25 Juli 2021 Perihal: Pengaturan
Pelaksanaan pada Masa Perpanjangan PPKM Level 4
4. Memo Rektor Nomor 014/Memo/REKTOR/VIII/2021 Perihal: Pengaturan Pelaksanaan Pekerjaan periode 3 sampai dengan 13 Agustus 2021
5. Memo Rektor Nomor 016/Memo/REKTOR/VIII/2021 tanggal 14 Agustus 2021 Perihal: Pengaturan Pelaksanaan Pekerjaan Periode 16 – 30 Agustus 2021
Oleh karena itu progres dari hasil penelitian belum sesuai dengan yang direncanakan pada proposal.
G. RENCANA TINDAK LANJUT PENELITIAN: Tuliskan dan uraikan rencana tindaklanjut penelitian selanjutnya dengan melihat hasil penelitian yang telah diperoleh. Jika ada target yang belum diselesaikan pada akhir tahun pelaksanaan penelitian, pada bagian ini dapat dituliskan rencana penyelesaian target yang belum tercapai tersebut.
Berdasarkan pada road map penelitian pada tahun ke 3 (Gambar 12), ada beberapa rencana tahapan yang akan dilaksankan, yaitu:
(1) Melanjutkan pengujian stabililas FCP dengan penambahan H2O2 dan potasium ferisianida (K3Fe(CN)6) pada beberapa konsentrasi dengan dan tanpa penambahan sodium askorbat yang diamati menggunakan spektrometer fluorosensi dan spektrofotometer UV-Tampak (Metode 1).
(2) Menambahkan pengukuran spektrum emissi yang dieksitasi pada 532, 636, dan 672 nm serta spektrum eksitasi yang diemisi pada 645 dan 730 nm menggunakan spektrometer fluorosensi (Metode 2).
(3) Memisahkan dan mengidentifikasi produk oksidasi dari pigmen golongan klorofil a dan klorofil c serta karotenoid dari komplek FCP yang diberi perlakuan oksidasi kimiawi menggunakan KCKT (Metode 2) (4) Menganalisis profil senyawa metabolit primer dan sekunder dari diatom menggunakan LC-MS/MS dan
GC-MS (metode 3).
Gambar 12. Road map penelitian pada tahun ke-3 mulai dari hipotesis sampai produk final
H. DAFTAR PUSTAKA: Penyusunan Daftar Pustaka berdasarkan sistem nomor sesuai dengan urutan pengutipan.
Hanya pustaka yang disitasi pada laporan akhir yang dicantumkan dalam Daftar Pustaka.
1. Akimoto, S., Teshigahara, A., Yokono, M., Mimuro, M., Nagao, R., & Tomo, T. (2014). Excitation relaxation dynamics and energy transfer in fucoxanthin–chlorophyll a/c-protein complexes, probed by time-resolved fluorescence. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics, 1837(9), 1514–1521 2. Fiedor, J., Sulikowska, A., Orzechowska, A., Fiedor, L., & Burda, K. (2012). Antioxidant effects of
carotenoids in a model pigment-protein complex. Acta Biochimica Polonica, 59(1), 61–64
3. Mizoguchi, T., Isaji, M., Yamano, N., Harada, J., Fujii, R., & Tamiaki, H. (2017). Molecular structures and functions of chlorophylls-a esterified with geranylgeranyl, dihydrogeranylgeranyl, and tetrahydrogeranylgeranyl groups at the 17-propionate residue in a diatom, Chaetoceros calcitrans. Biochemistry, 56(28), 3682–3688.
4. Yamano, N., Mizoguchi, T., & Fujii, R. (2018). The pH-dependent photophysical properties of chlorophyll-c bound to the light-harvesting complex from a diatom, Chaetoceros calcitrans. Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry, 358, 379–385
5. Zhao, D., Kim, S. M., Pan, C. H. & Chung, D. (2014). Effects of heating, aerial exposure and illumination on stability of fucoxanthin in canola oil. Food Chem., 145, 505–513.
6. Hussain 2019 Hussain, J.M., Jeevanantham, G., Vinoth, M., Muruganantham, P., & Ahamed, A.K.
(2019). Biochemical response of microalgae Synechococcus aeruginosus to hydrogem peroxide stress.
Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry, 8(2), 97–104.
7. Drabkova, M., Matthijs, H.C.P., Admiraal, W., Marsalek, B. (2007). Selective effects of H2O2 on cyanobacterial photoysnthesis. Photosynthetica, 45(3), 363–369.
8. Lemus, N. Urbano, T., Arrendo-Vega, B., Guevara, M., Vasquez, A., Carreon-Palau, L., & Vallejo, N.
(2006). Growth and biochemical profile of Chaetoceros muelleri cultured in batch and semicontinous systems. Ciencias Marinas, 32(3), 597–603.
9. de Jesus-Campos, D., Lopez-Elias, J.A, Medina-Juarez, L.A., Carvallo-Ruiz, G., Fimbres-Olivarria, D.,
& Hayano-Kanashiro, C. (2020). Chemical composition, fatty acid profile and molecular hanges derived from nitrogen stress in the diatom Chaetoceros muelleri. Aquaculture Reports, 16, 100281.
Dokumen pendukung luaran Wajib #1
Luaran dijanjikan: Publikasi Ilmiah Jurnal Internasional
Target: accepted/published Dicapai: Submited
Dokumen wajib diunggah:
1. Bukti submit 2. Naskah artikel
Dokumen sudah diunggah:
1. Naskah artikel 2. Bukti submit
Dokumen belum diunggah:
- Sudah lengkap
Nama jurnal: Journal of Chromatography B
Peran penulis: corresponding author | EISSN: 1570-0232 Nama Lembaga Pengindek: SJR
URL jurnal: https://www.journals.elsevier.com/journal-of-chromatography-b
Judul artikel: Simultaneous purification of fucoxanthin isomers from brown seaweeds by open-column and high-performance liquid chromatography
Journal of Chromatography B
Simultaneous purification of fucoxanthin isomers from brown seaweeds by open- column and high-performance liquid chromatography
--Manuscript Draft--
Manuscript Number:
Article Type: Full Length Article
Keywords: Fucoxanthin isomers; Brown seaweeds; carotenoids; simultaneous purification;
HPLC; absorption and mass spectrometry Corresponding Author: Tatas Hardo Panintingjati Brotosudarmo, Ph.D.
Universitas Ma Chung Malang, INDONESIA
First Author: Arif Agung Wibowo
Order of Authors: Arif Agung Wibowo
Heriyanto Heriyanto Yuzo Shioi
Leenawaty Limantara
Tatas Hardo Panintingjati Brotosudarmo, Ph.D.
Abstract: Simultaneous purification of fucoxanthin isomers from brown seaweeds by two steps of open-column chromatography (OCC) and reversed-phase (RP)-high-performance liquid chromatography (HPLC) is described. Analysis and identification of fucoxanthin isomers were performed by chromatographic and spectrophotometric properties such as retention time (tR), spectral shape, maximal absorption wavelength (λmax), Q-ratio, and mass spectrometry (MS) data including the ratio of fragment ions. The optimal conditions for a simultaneous separation and purification were examined by changing several parameters of HPLC, i.e., mobile phase composition, equilibration time, and column oven temperature. The purification procedure consisted of the following two steps: first, highly purified fucoxanthin fraction was obtained by a silica-gel OCC. Then, four major fucoxanthin isomers, all-trans, 13ʹ-cis, 13-cis, and 9ʹ-cis, were
simultaneously separated and purified by RP-HPLC with an analytical C30 column and gradient elution in a mixture of water, methanol, and methyl tert-butyl ether. The purity of fucoxanthin isomers purified was > 95% for all-trans and 9ʹ-cis, 85% for 13ʹ-cis, and
> 80% for 13-cis. A large-scale purification by RP-HPLC using a preparative C18 column was effective for the purification of all-trans and 9ʹ-cis with a yield of 95%. This developed technique was fully applicable to analyze the enhanced production of fucoxanthin isomers by iodine-catalyzed stereomutation which composed of 9 isomer species including 9-cis.
Suggested Reviewers: Masashi Hosokawa
Hokkaido University: Hokkaido Daigaku [email protected]
Antonio Meléndez-Martínez Universidad de Sevilla [email protected] Ritsuko Fujii
Osaka City University: Osaka Shiritsu Daigaku [email protected]
Powered by Editorial Manager® and ProduXion Manager® from Aries Systems Corporation
Cover Letter
September 03, 2021
Dear Prof. David S. Hage Editor in Chief
We would greatly appreciate your consideration of our manuscript entitled “Simulation purification of fucoxanthin isomers from brown seaweeds by open-column and high-performance liquid
chromatography” for consideration for publication in Journal of Chromatography B.
Fucoxanthin is one of important carotenoids due to its bioactivity potentials for human health, particularly as antidiabetic and anticancer. The cis-isomer of fucoxanthin was known to have better bioactivity than all-trans form. Various types of high performance and open column liquid
chromatography have been developed, but there is no specific and general purification technique used to obtain fucoxanthin isomers, except for all-trans which is easily purified as a mixture of several isomers. In this paper we demonstrate a substantial improvement of the purification method achieved by a two-step chromatography to produce high-yield and high-purity of fucoxanthin isomers, namely all-trans, 13ʹ-cis, 13-cis, and 9ʹ-cis.
We believe that these insights will be of keen interest to the board readership of Journal of Chromatography B, particularly those who have interest in separation and application analysis of bioactive compounds, specifically the isomeric forms of fucoxanthin carotenoid.
Thank you for your consideration.
Yours sincerely,
Tatas H.P. Brotosudarmo Associate Professor
Ma Chung Research Center for Photosynthetic Pigments Department of Chemistry
Universitas Ma Chung Villa Puncak Tidar N01
Malang 65151 Jawa Timur, Indonesia
Phone: 62-341-550-171, FAX: 62-341-550-175 E-mail: [email protected] Cover Letter
Highlights
Four main fucoxanthin isomers were simultaneously purified by RP-HPLC on a C30
column
This method is a simple, rapid, and highly effective to purify fucoxanthin isomers
The purity of isomers was: all-trans and 9ʹ-cis, > 95%; 13ʹ-cis, 85%; 13-cis, > 80%
This method is applicable to the main isomers produced by artificial stereomutation
Highlights
Abstract
Simultaneous purification of fucoxanthin isomers from brown seaweeds by two steps of open- column chromatography (OCC) and reversed-phase (RP)-high-performance liquid chromatography (HPLC) is described. Analysis and identification of fucoxanthin isomers were performed by chromatographic and spectrophotometric properties such as retention time (tR), spectral shape, maximal absorption wavelength (λmax), Q-ratio, and mass spectrometry (MS) data including the ratio of fragment ions. The optimal conditions for a simultaneous separation and purification were examined by changing several parameters of HPLC, i.e., mobile phase composition, equilibration time, and column oven temperature. The purification procedure consisted of the following two steps: first, highly purified fucoxanthin fraction was obtained by a silica-gel OCC. Then, four major fucoxanthin isomers, all-trans, 13ʹ-cis, 13-cis, and 9ʹ-cis, were simultaneously separated and purified by RP-HPLC with an analytical C30 column and gradient elution in a mixture of water, methanol, and methyl tert-butyl ether. The purity of fucoxanthin isomers purified was > 95% for all-trans and 9ʹ-cis, 85% for 13ʹ-cis, and > 80%
for 13-cis. A large-scale purification by RP-HPLC using a preparative C18 column was effective for the purification of all-trans and 9ʹ-cis with a yield of 95%. This developed technique was fully applicable to analyze the enhanced production of fucoxanthin isomers by iodine-catalyzed stereomutation which composed of 9 isomer species including 9-cis.
Keywords: Fucoxanthin isomers, brown seaweeds, carotenoids, simultaneous purification, HPLC, absorption and mass spectrometry
Abstract
1
Simultaneous purification of fucoxanthin isomers from brown seaweeds by open-column and high- performance liquid chromatography
Arif Agung Wibowoa, Heriyantoa,b, Yuzo Shioib, Leenawaty Limantarab,c, Tatas Hardo Panintingjati Brotosudarmoa,b*
aDepartment of Chemistry, Universitas Ma Chung, Villa Puncak Tidar N-01, Malang 65151, Indonesia
bMa Chung Research Center for Photosynthetic Pigments (MRCPP), Villa Puncak Tidar N-01, Malang 65151, Indonesia
cCenter for Urban Studies, Universitas Pembangunan Jaya, Jl. Cendrawasih Raya B7/P, South Tangerang 15413, Banten, Indonesia
*Corresponding author
E-mail: [email protected]
Manuscript File Click here to view linked References
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65
