Masyarakat Indonesia mengenal daun salam (Eugenia polyantha) dan daun sirsak (Anona muricata) sebagai sumber obat tradisional. Dengan adanya informasi tentang bakteri endofit pada bagian tanaman khususnya daun, maka perlu dilakukan penelitian bakteri endofit pada kedua daun tersebut. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi bakteri endofit dari daun salam dan daun sirsak serta mengidentifikasi bakteri tersebut menggunakan informasi DNA bakteri endofit.
Penelitian ini diawali dengan tahap isolasi bakteri endofit kemudian DNA genom bakteri diekstrak dan diamplifikasi dengan teknik PCR.
Pendahuluan
Identitas bakteri endofit hasil isolasi dapat diketahui dengan menggunakan sekuen basa nukleotida yang terdapat pada gen 16sRNA. Studi tersebut membuktikan adanya mikroba endofit pada tanaman obat dan gen 16s rRNA dapat digunakan untuk mengidentifikasi bakteri endofit yang dihasilkan. Bakteri endofit yang diperoleh pada penelitian ini dapat digunakan sebagai sumber baru metabolit sekunder untuk penemuan obat baru.
Isolasi bakteri endofit dari tanaman dapat dilakukan dengan menginokulasi sampel tanaman yang telah disterilkan kemudian diinokulasikan ke dalam media. Penelitian ini merupakan tahap awal dari rangkaian tahapan untuk mengeksplorasi bakteri endofit sebagai penghasil metabolit sekunder yang memiliki aktivitas farmakologis. Bahan Isolasi DNA Genom : Isolat Bakteri Endofit dari Daun Salam (Eugenia polyantha Wight) dan Daun Sirsak (Annona muricata L.), Tris-Cl, EDTA, nitrogen cair, protease K, Tris-equilibrated phenol, ammonium acetate, 100% ethanol, etanol 70%, larutan RNase.
Pada penelitian ini isolat bakteri endofit diperoleh setelah sterilisasi permukaan daun salam dan sirsak, dilanjutkan dengan penanaman langsung daun yang telah disterilkan pada cawan petri yang berbeda. Isolat bakteri yang diperoleh pada penelitian ini adalah 6 isolat bakteri endofit, dimana 3 isolat bakteri endofit berasal dari daun sirsak sedangkan 3 isolat bakteri lainnya berasal dari daun salam (Gambar 1 dan 2). Molekul DNA genom bakteri endofit dari daun sirsak dan daun salam diperoleh dengan menggunakan Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, USA).
Data sekuen yang diperoleh dianalisis dan diperoleh hasil bahwa salah satu isolat bakteri endofit daun salam yang diperoleh pada penelitian memiliki kemiripan sebesar 99% dengan. Bakteri endofit daun sirsak yang berhasil diisolasi pada penelitian ini sebanyak 3 isolat, dan salah satu bakteri endofit daun sirsak memiliki persentase kemiripan 99% dengan urutan basa gen 16s rRNA dari bakteri B. Skrining dan identifikasi isolat bakteri endofit untuk pengendalian penyakit hawar daun bakteri bawang merah.
Bakteri endofit adalah bakteri yang hidup di dalam jaringan tanaman inang tanpa merusak tanaman inangnya. Penelitian ini dilakukan untuk mendapatkan bakteri endofit daun salam yang memiliki aktivitas antibakteri secara in vitro karena belum ada informasi tentang bakteri endofit daun salam yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri patogen. Isolasi Bakteri Endofit Tahapan isolasi dilakukan menggunakan metode yang digunakan oleh Kumala (2009) dengan sedikit modifikasi.
Identifikasi gen 16sRNA isolat bakteri endofit WL-SM1 Identifikasi dilakukan dengan menggunakan data sekuens DNA gen 16sRNA isolat WL-SM1 yang telah diproses menggunakan software GENEIOUS R11. Pada penelitian ini, bakteri endofit diisolasi menggunakan metode kultur langsung, dimana potongan daun yang telah disterilkan diletakkan di atas permukaan media agar. Pada penelitian ini diperoleh empat isolat bakteri endofit yang berbeda secara makroskopis dan mikroskopis (Tabel 1).
Penelitian ini menunjukkan adanya bakteri endofit pada daun salam dan dari empat isolat yang diperoleh hanya satu yang memiliki aktivitas antibakteri terhadap S.
Meodologi Penelitian
Hasil dan Pembahasan
Hal ini sangat penting karena bakteri yang akan diisolasi hanya bakteri yang tumbuh pada jaringan tanaman. Molekul DNA dapat diamati menggunakan senyawa kabisat, salah satunya ethidium bromide, dengan bantuan sinar UV.
Kesimpulan dan Saran
Bakteri endofit mampu menghasilkan metabolit sekunder yang memiliki bioaktivitas seperti enzim, zat pengatur tumbuh, antimikroba, antijamur dan antikanker (Kumala 2014). Terdapat informasi kemampuan bakteri endofit dalam menghasilkan senyawa dengan berbagai bioaktivitas seperti agen antibakteri. Selain itu, penelitian ini juga akan mengidentifikasi bakteri endofit yang memiliki aktivitas antidiare menggunakan gen 16 sRNA.
Pengujian potensi antibakteri bakteri endofit dapat dilakukan dengan berbagai cara yaitu metode difusi dan metode pengenceran. Metode difusi terbagi menjadi tiga yaitu difusi cakram menggunakan kertas cakram yang direndam dalam bahan antibakteri, difusi silinder. Setelah daun diletakkan pada media NA, dilanjutkan inkubasi pada suhu ruang, terlihat tumbuh isolat bakteri di sekitar daun (Pratiwi 2015).
Skrining isolat bakteri daun salami yang memiliki aktivitas antibakteri Skrining in vitro dilakukan dengan metode difusi cakram terhadap bakteri Salmonella typhii. Setelah media uji memadat, cakram kertas yang telah direndam dalam supernatan hasil fermentasi bakteri endofit selama 5 menit ditempatkan dalam media uji dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 2 hari (Simarmata et al. 2007). Isolasi DNA genom isolat bakteri dengan aktivitas antidiare Isolasi dilakukan dengan menggunakan Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, USA).
Isolat bakteri yang akan digunakan untuk prosedur isolasi terlebih dahulu ditumbuhkan dalam Nutrient Broth (NB) dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24 jam. Langkah awal adalah memasukkan 1 ml biakan bakteri endofit ke dalam mikrotube 1,5 ml, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 15.000 x g selama 2 menit, membuang supernatan hingga tersisa pelet saja. Di dalam jaringan tumbuhan baik di akar, batang maupun daun terdapat bakteri endofit yang hidup bersimbiosis dengan tumbuhan dan membentuk koloni di dalamnya (Bacon & White, 2000).
Isolasi mikroba endofit sebagai sumber penghasil senyawa antidiare diawali dengan pemilihan tanaman yang telah digunakan untuk mengatasi diare (Tanvir et al., 2016). Berdasarkan uji aktivitas dengan metode difusi cakram terlihat adanya zona bening di sekitar kertas cakram yang direndam dalam isolat fermentasi WL-SM1. Hasil analisis DNA filogenetik isolat bakteri WL-SM1 dengan 10 isolat bakteri secara online di laman www.ncbi.nlm.nih.gov.
Berdasarkan informasi pada pohon filogenetik, isolat WL-SM1 memiliki kekerabatan yang dekat dengan bakteri Bacillus subtilis strain IAM 12118 (NR_112116) dengan persentase kemiripan sebesar 99,9%, sehingga isolat bakteri endofit pada penelitian ini dapat disebut B. Bakterial . Isolasi dan Karakterisasi Endofit Umbi Kentang (Solanum tuberosum L.) menggunakan Primer PCR-RAPD.
