LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI PERTANIAN
“ISOLASI DNA”
Disusun oleh:
Nama : Angelika Pasaribu
NIM : 215040201111216
Kelas : N
Asisten : Amrul Mubarok
PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG
2022
Bab I Pendahuluan 1.1 Latar Belakang
DNA adalah polimer asam nukleat yang tersusun secara sistematis dan merupakan pembawa informasi genetik yang diturunkan kepada keturunannya. DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan komponen- komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan pasangan basa. Molekulnya berbentuk double helix yang kemudian membentuk pilinan. DNA yang menyusun kromosom ini merupakan nukleotida rangkap yang tersusun heliks ganda atau double helix, dimana basa nitrogen dan kedua benang polinukleotida saling berpasangan dalam pasangan yang tetap melalui ikatan hidrogen. Mitokondria dan kloroplas pada DNA memiliki ciri khas, yakni hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu sedangkan nukleus memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orangtua.
Pada tumbuhan, DNA terdapat di dalam inti sel dan beberapa organ lain di dalam sel seperti mitokondria dan kloroplas. Isolasi DNA adalah suatu teknik yang digunakan untuk mendapatkan DNA murni. Mekanisme proses isolasi DNA yakni dengan pengeluaran DNA dari tempatnya berada (ekstraksi atau lisis) biasanya dilakukan homogenasi dan penambahan buffer ekstraksi dan buffer lisis untuk pencegahan DNA rusak. Isolasi DNA memiliki prinsip dimana memisahkan DNA genom dari komponen-komponen sel lain (Triani, 2020). Setelah dilakukan isolasi DNA, DNA tersebut dapat digunakan sebagai bahan uji lanjutan contohnya dalam menganalisa kode genetik untuk keperluan medis atau forensik. Sedangkan dalam bidang pertanian dapat digunakan untuk mengetahui kode genetik untuk melakukan perbaikan sifat tanaman
1.2 Tujuan
Tujuan dari pelaksanaan praktikum isolasi DNA adalah praktikan dapat mengetahui dan melakukan proses-proses yang berkaitan langsung untuk melakukan isolasi DNA. Serta mahasiswa dapat menginterpretasi data terkait hasil PCR.
1.3 Manfaat.
Untuk menambah wawasan praktikan mengenai proses–proses yang berkaitan dengan isolasi DNA.
Bab II Tinjauan Pustaka 2.1 Pengertian DNA
Deoxyribonucleic acid (DNA) merupakan makromolekul berupa benang sangat panjang yang terbentuk dari sejumlah besar deoksiribonukleotida, yang masing-masing tersusun dari satu basa, satu gula dan satu gugus fosfat (Rosana, 2014). Menurut Zulfahmi (2013) DNA merupakan sumber informasi genetik pada makhluk hidup yang sangat akurat yang menjadikan penanda atau identitas dari suatu organisme.
2.2 Pengertian Isolasi DNA
Isolasi DNA genom merupakan langkah awal dan sangat menentukan dalam studi genetika dan molekuler suatu spesies (Masdalifah dan Pujiyanto, 2013)
“DNA extraction is a method to purify DNA by using physical and/or chemical methods from a sample separating DNA from cell membranes, proteins, and other cellular components (Cytol, 2019)” “Ekstraksi DNA adalah suatu metode untuk memurnikan DNA dengan menggunakan metode fisik dan/atau kimia dari suatu sampel yang memisahkan DNA dari membran sel, protein, dan komponen seluler lainnya (Cytol, 2019)”
2.3 Tujuan Isolasi DNA
Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Isolasi DNA/RNA merupakan langkah awal yang harus dikerjakan dalam rekayasa genetika sebelum melangkah ke proses selanjutnya. Berdasarkan prinsip isolasi DNA, isolasi DNA melalui proses dengan memecah dan mengekstraksi jaringan tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang terdiri atas sel-sel jaringan, DNA, dan RNA (Faatih, 2009). Selain itu, isolasi DNA juga bertujuan untuk memastikan kemurnian dan konsentrasi hasil ekstraski DNA (Siswoyo, 2020).
2.4 Jenis-Jenis Metode Isolasi DNA
Terdapat beberapa jenis-jenis metode isolasi DNA menurut Romlah et al.
(2018):
a. Metode boilling, yakni pemanasan tinggi selama beberapa menit dimana akan menyebabkan peningkatan permeabilitas dinding sel yang berakibat pada masuknya cairan dan materi lain di sekitar sel dan keluarnya materi- materi dari dalam sel. Suhu tinggi juga bermanfaat untuk inaktivasi enzim, terutama DNase yang dapat merusak DNA.
b. Metode Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide (CTAB), yakni menggunakan nitrogen cair pada tahap awal ekstraksi untuk menghasilkan kualitas DNA terbaik. CTAB merupakan sejenis deterjen yang dapat mendegradasi dinding sel, denaturasi protein, memisahkan karbohidrat Menurut Mulyani et al. (2011) metode yang digunakan untuk isolasi DNA yaitu Metode dengan menggunakan kit ekstraksi DNA (Wizard Genomic DNA Purification, Promega), Metode CTAB (Cationic Hexadecyl
Trimethyl Ammonium Bromide) dengan Phenol, metode modifikasi CTAB (Cationic Hexadecyl Trimethyl Ammonium Bromide), dan metode ekstraksi DNA dengan thermal lysis.
Bab III Metodologi 3.1 Alat dan Fungsi
No Alat Fungsi
1 Mortar dan pistil Untuk menghaluskan spesimen
2 Tips Sebagai tempat bahan yang diuji
3 Gelas Ukur Untuk mengukur larutan
4 Tubes 1,5 ml Sebagai wadah spesimen
5 Tissue Untuk membersihkan sisa air pada
alat
6 Gunting Untuk memotong daun (spesimen)
7 Mikro Pipet Untuk memindahkan larutan
8 Spatula Untuk mengaduk dan mengambil
bahan praktikum
9 Erlenmeyer Untuk wadah bahan yang akan diuji
10 Microwave Untuk menginkubasi spesimen
11 Mesin PCR Untuk memperbanyak DNA
12 Oven Untuk sterilisasi bahan secara kering dengan suhu yang ditentukan
13 Vortex Untuk menghomogenkan larutan
14 Timbangan Analitik Untuk menimbang spesimen
15 Stirer Untuk mengaduk dan memanaskan
bahan
16 pH meter Untuk mengukur larutan ph
17 Mesin Elektroforesis Untuk menguji kualitas DNA
18 Waterbath Membuat suhu konstan
19 Centrifuge Untuk memisahkan larutan
20 Autoclave Untuk mensterilkan bergbagai alat
21 Gel Doc Untuk mendeteksi pita-pita DNA
22 Lemari Es Untuk pendinginan bahan
3.2 Bahan dan Fungsi
No Bahan Fungsi
1 Kit Isolasi DNA Tanaman (Promega) Sebagai bahan lisis dalam isolasi DNA
2 Nitrogen cair Untuk mengawetkan sampel
3 Buffer TE RNAse Sebagai pengelusi DNA
4 Ethanol 70% Untuk menurunkan aktivitas
molekul air 5 Isopropanol DNA ladder Untuk menarik air atau
mengkondisikan dehidrasi
6 Agarosa Untuk memisahkan DNA
dari bahan lain 7 Buffer Elektroforesis (TAE/TBE) Untuk meneruskan arus
listrik
8 Loading dye Pewarna untuk memantau
migrasi molekul
9 Ethidum Bromida Pewarna DNA pada gel
elektroforensis
10 PCR reaction kit Untuk memisahkan DNA
dari bahan lain 11 Primer mikrosatelit SSR Untuk memperbanyak atau
amplifikasi DNA pada PCR
3.3 Diagram Alir
Menyiapkan alat dan bahan (Isolation Genomic s
DNA Kit Promega) Timbang 0,1 g sampel daun
Inkubasi pada oven atau waterbath pada tempertur 65 C selama 15 menit Masukkan 600 µL Nucleic Lysis Solution ke dalam tube ukuran 1.5 mL dan tambhakan sampel daun yang sudah dihaluskan, tutup kembali tube (jangan lupa beri label di tube)
Masukan dalam mortar, tambahkan N2 Cair, segera di gerus sampai
halus (jangan sampai mencair)
Tambahkan 3 µL RNase dan homogenkan dengan cara inverting
Inkubasi pada temperature 37 C selama 15 menit
Dinginkan pada temperature ruang selama 5 menit
Sentrifuge pada 14.000 rpm selama 1 menit pada temperature ruang
Sentrifuge pada kecepatan 14.000 rpm selama 3 menit
Tambahkan 600 µL isopropanol pada temperature ruang
Homogenkan dengan pelan dengan cara inverting atau tap/bolak balik tube
Vortex selama 20 detik
Pindahkan secara hati-hati supernatant pada bagian atas kedalam tube baru 1,5 mL, jangan
sampai residu ikut terpipet
Buang supernatant secara hati-hati, jangan sampai pellet pada bagian bawah ikut terbuang
Tambahkan 200 µL Protein Precipitation Solution
Tambahkan 600 µL ethanol 70% pada temperature ruang, homogenkan dengan pelan
Simpan Dalam Freezer pada temperature 2-8 C Sentrifuge pada 14.000 rpm selama 1 menit
pada temperature ruang
Isolasi DNA
Inkubasi pada temperature 65 C selama 1 jam atau inkubasi pada temperature 4 oC selama 1
malam
Tambahkan DNA Rehydration sebanyak 100 µl dan larutkan pellet DNA dengan cara mengetuk-
ketuk tube secara perlahan
Kering anginkan sisa ethanol selama 15 menit, dengan cara di balik dengan alas kertas tissue Buang Kembali supernatant secara hati-hati, jangan sampai pellet DNA ikut terbuang atau
terpipet
