See discussions, stats, and author profiles for this publication at: https://www.researchgate.net/publication/348835145
UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DENGAN METODE PEREDAMAN RADIKAL BEBAS 2,2-DIPHENYL-1-PICRYLHYDRAZYL (DPPH)
Method · January 2021
CITATIONS
0
READS
5,355
1 author:
Neni Isnaeni
Badan Pengawas Obat dan Makanan 10PUBLICATIONS 1CITATION
SEE PROFILE
All content following this page was uploaded by Neni Isnaeni on 28 January 2021.
The user has requested enhancement of the downloaded file.
Tugas Makalah Mata Kuliah Bioorganik
Dosen Pengampu : Dr. Ir. Antonius Herry Cahyana
UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DENGAN METODE PEREDAMAN RADIKAL BEBAS 2,2-DIPHENYL-1-
PICRYLHYDRAZYL (DPPH)
Disusun oleh :
Neni Isnaeni 1906320853
PROGRAM STUDI MAGISTER KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS INDONESIA
2020
i
DAFTAR ISI
DAFTAR ISI ... i
BAB I PENDAHULUAN ... 1
BAB II UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DENGAN METODE PEREDAMAN RADIKAL BEBAS 2,2-DIPHENYL-1-PICRYLHYDRAZYL (DPPH) ... 3
2.1 DPPH... 3
2.2 Aktivitas Antioksidan dengan metode Peredaman Radikal Bebas DPPH ... 4
2.3 Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun Moringa oleifera (Kelor) ... 12
BAB III KESIMPULAN ... 17
KESIMPULAN ... 17
DAFTAR PUSTAKA ... 18
1 | P a g e
BAB I
PENDAHULUAN
Radikal bebas merupakan atom, molekul atau ion dengan pasangan elektron yang sangat aktif bereaksi kimia dengan molekul lainnya. Dalam sistem biologi radikal bebas sering diturunkan dari oksigen, nitrogen dan molekul sulfur. Radikal bebas merupakan bagian dari kelompok molekul seperti spesi oksigen reaktif (ROS), spesi nitrogen reaktif, (RNS) dan spesi sulfur reaktif (RSS). Contoh ROS yaitu anion superoksida (O2-•), radikal perhidroksi (HO2•), radikal hidroksil (•OH), nitrat oksida dan spesi lain seperti hidrogen peroksida (H2O2), oksigen singlet (1O2), asam hipoklorous (HOCl) dan peroksinitrit (ONOO-). RNS diturunkan dari nitrat oksida melalui reaksi dengan O2-• membentuk ONOO-. RSS mudah dibentuk dari reaksi tiol dengan ROS (Lü et al., 2010).
ROS dihasilkan selama metabolisme sel dan aktivitas fungsional serta berperan penting dalam sinyal sel apoptosis, ekspresi gen dan transportasi ion. Namun, kelebihan ROS dapat menimbukan efek yang tidak diinginkan terhadap banyak molekul seperti lipid, protein, RNA dan DNA karena sifatnya yang sangat kecil dan sangat reaktif. ROS dapat menyerang basa dalam asam nukleat, rantai samping asam amino dan ikatan rangkap dalam asam lemak tak jenuh dimana •OH sebagai oksidan terkuat. ROS menyerang makromolekul yang disebut sebagai stress oksidatif. Sel secara normal mampu melawan kerusakan ROS melalui penggunaan enzim intrasel untuk menjaga homeostasis ROS pada tingkat rendah. Akan tetapi, selama stress lingkungan dan disfungsi sel, ROS akan meningkat drastis dan menyebabkan kerusakan sel yang signifikan di dalam tubuh. Sehingga, kerusakan oksidatif menyebabkan pathogenesis penyakit inflamasi, jantung, diabetes, penyakit Alzheimer, katarak dan penuaan.
Untuk mencegah kerusakan oksidatif oleh ROS, tubuh manusia dan organisme lain mengembangkan sistem pertahanan antioksidan termasuk enzimatik, pengkelat logam dan aktivitas peredaman radikal bebas untuk menetralkan radikal setelah terbentuk.
Antioksidan merupakan molekul yang dapat menetralkan radikal bebas dengan menerima atau mondonorkan elektron untuk menghilangkan elektron tidak berpasangan dari radikal.
Molekul antioksidan secara langsung bereaksi dengan radikal raktif dan merusaknya sementara mereka akan menjadi radikal bebas baru yang kurang aktif, bertahan lama dan kurang reaktif dibanding radikal yang dinetralkan. Antioksidan yang menjadi radikal akan dinetralkan oleh antioksidan atau melalui mekanisme lain untuk menghentikan sifat radikalnya.
2 | P a g e
Berbagai metode evaluasi aktivitas antioksidan telah dikembangkan dengan metode analisis yang berbeda seperti % DPPH (2,2 diphenyl-1-picrylhydrazyl), assay ABTS•+ (2,2'- azino-bis-3ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), FRAP (ferric reducing antioxidant power), ORAC (oxygen radical absorption capacity), CUPRAC (cupric reducing antioxidant capacity), total kapasitas reduksi (Chen, Bertin, & Froldi, 2013), dan penghambatan oksidasi low-density lipoprotein (LDL) (Szabo et al., 2007). Di antara metode-metode tersebut, metode
% DPPH merupakan metode assay yang paling populer digunakan karena prosedur sederhana, mudah, cepat, biaya relatif murah dan efisien. Oleh karena itu, pada makalah ini akan dibahas evaluasi aktivitas antioksidan dengan metode peredaman radikal bebas 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl (% DPPH) meliputi aspek kimiawi, analisis dan aspek lainnya yang terkait metode tersebut, bagaimana mekanisme dan prosedur kerja, analisis serta pengolahan data pengujiannya. Selain itu, juga akan dibahas desain riset uji aktivitas antioksidan dari bahan alam Indonesia yaitu Moringa oleifera (kelor) dengan metode % DPPH.
3 | P a g e
BAB II
UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN DENGAN METODE PEREDAMAN RADIKAL BEBAS 2,2-DIPHENYL-1-
PICRYLHYDRAZYL (DPPH)
2.1 DPPH
Molekul DPPH (2,2 diphenyl-1-picrylhydrazyl atau α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl) merupakan radikal bebas yang stabil yang dapat menerima elekron atau hidrogen radikal untuk menjadi molekul diamagnetik yang stabil. Molekul DPPH memiliki rumus molekul C18H12N5O6 danberat molekul 394,33 g/mol.
Gambar 1 Stuktur molekul DPPH (1-1-2-difenil-2-pikrilhidrazil)
DPPH memiliki elektron tidak berpasangan (radikal) sehingga dalam pelarut (metanol atau etanol) akan memberikan larutan berwarna ungu tua yang ditandai pita serapan kuat pada panjang gelombang 517 nm. Ketika larutan DPPH dicampur dengan substrat (AH) yang dapat menyumbangkan atom hidrogen maka akan muncul bentuk tereduksi dengan hilangnya warna ungu pada larutan tersebut, terbentuk larutan berwarna kuning. Larutan kehilangan warna sebanding dengan meningkatnya konsentrasi antioksidan sebagai elektron antioksidan yang ditangkap oleh DPPH. Semakin tinggi kandungan antioksidan maka warna ungu pada larutan DPPH akan semakin berkurang dan terbentuk larutan berwarna kuning (Molyneux, 2004).
Berkurangnya radikal DPPH dapat dimonitor secara spektrofotometri dengan menurunnya absorbansi pada 517 nm.
Radikal DPPH bereaksi secara selektif dengan radikal dan donor atom H di sisi reaksi yang berbeda. Sementara radikal biasanya menyerang cincin fenil (atau cincin pikril), donor atom H bereaksi dengan atom N divalen. Keterbatasan ruang di sekitar atom N mencegah penambahan radikal sulit pada sisi tersebut. Donor atom H dapat mendekati atom N dan melepaskan atom Hnya dan terbentuk hidrazin DPPH − H.
4 | P a g e
Mekanisme reaksi yang terjadi yaitu :
Gambar 2 Skema reaksi radikal DPPH dengan senyawa radikal lain (•R = H•, radikal alkil, dll)
Molekuler oksigen dalam keadaan triplet-ground, 3O2, meskipun menjadi radikal, tidak bereaksi dengan DPPH radikal (atau sangat perlahan), dan larutan DPPH yang disimpan dalam ruang gelap stabil dalam waktu yang lama. Radikal tidak mengalami dimerisasi dan dalam larutan maupun padatan dalam bentuk monomer bebasnya.
2.2 Aktivitas Antioksidan dengan metode Peredaman Radikal Bebas DPPH Berbagai metode evaluasi aktivitas antioksidan telah dikembangkan dengan metode analisis yang berbeda seperti % DPPH (2,2 diphenyl-1-picrylhydrazyl), assay ABTS•+ (2,2'- azino-bis-3ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), FRAP (ferric reducing antioxidant power), ORAC (oxygen radical absorption capacity), CUPRAC (cupric reducing antioxidant capacity), total kapasitas reduksi (Chen, Bertin, & Froldi, 2013), dan penghambatan oksidasi low-density lipoprotein (LDL) (Szabo et al., 2007). Metode yang paling banyak digunakan adalah FRAP, ABTS, TEAC (Torox equivalent antioxidant capacity), DPPH dan ORAC (Pérez-Jiménez et al., 2008).
Metode DPPH merupakan metode uji yang cepat, murah, akurat dan sederhana untuk mengukur kemampuan senyawa sebagai pemulung/peredam radikal bebas atau donor hidrogen dan mengevaluasi aktivitas antioksidan makanan dan minuman (Pérez-Jiménez et al., 2008).
Metode DPPH digambarkan sebagai metode yang sederhana, cepat dan nyaman tidak bergantung pada polaritas sampel dalam menskrining banyak sampel yang memiliki aktivitas sebagai peredam radikal (Marxen et al., 2007). Metode DPPH sering digunakan untuk mengukur kemampuan peredam radikal bebas dari antioksidan (Perez-Jimenez and Saura- Calixto, 2008; Perez-Jimenez et al., 2008). Untuk penetapan aktivitas radikal scavenging makanan, minuman dan substrat dielaborasi dengan merode yang sangat bervariasi dengan menggunakan DPPH.
5 | P a g e
Metode DPPH unik dalam reaksi sampel dengan DPPH dalam metanol atau aqueous karena memfasilitasi ekstraksi senyawa antioksidan dari sampel. Kelebihan metode ini, DPPH mampu bereaksi dengan seluruh sampel dan waktu yang cukup sehingga memungkinkan DPPH bereaksi perlahan dengan antioksidan yang lemah (Prakash, 2001). Metode DPPH dapat digunakan dalam pelarut aqueous dan organik nonpolar dan dapat digunakan untuk menguji antioksidan hidrofilik maupun lipofilik (Prior et al., 2005). Metode DPPH merupakan metode yang valid, akurat, mudah dan ekonomis untuk mengevaluasi aktivitas pemulungan radikal antioksidan karena senyawa radikal yang stabil dan tidak dihasilkan. Sanchez-Moreno et al (1998, 1999a, b) mengembangkan metodologi baru evaluasi efisiensi antiradikal terhadap DPPH, yang menguntungkan dibanding metode lain, tidak hanya mempertimbangkan konsentrasi antioksidan tetapi juga waktu reaksi pemulungan untuk mencapai plateau. Metode tersebut sangat reprodusibel dan sebanding dengan metode pemulungan radikal bebas lain (Gil et al., 2000). Efisiensi antioksidan diukur pada suhu lingkungan sehingga risiko degradasi termal dari molekul yang diuji dapat dihindari (Bondet et al., 1997). Pada mode jendela optotermal, metode ini juga dapat digunakan untuk evaluasi efisiensi antioksidan dari senyawa yang membentuk larutan opaque. Metode ini juga dapat digunakan untuk pemantauan online perubahan makanan yang mengandung antioksidan alami.
Namun, metode DPPH memiliki beberapa keterbatasan, antara lain yaitu radikal DPPH dapat berinteraksi dengan radikal lain dan waktu respon kurva mencapai steady state tidak linier dengan perbedaan rasio antioksidan dengan DPPH (Brand-Williams et al., 1995;
Sanchez-Moreno et al., 1998). DPPH sensitif terhadap beberapa basa Lewis, tipe pelarut maupun oksigen (Ancerewicz et al., 1998). DPPH hanya larut dalam pelarut organik dan adanya gangguan absorbansi dari sampel merupakan masalah dalam analisis kuantitatif (Arnao, 2000). Absorbansi DPPH di dalam metanol dan aseton menurun saat terpapar cahaya (Min, 1998). Metode DPPH memiliki keterbatasan dalam merefleksikan partisi antioksidan dalam sistem emulsi dan tidak dapat digunakan untuk mengukur aktivitas antioksidan di dalam plasma, karena protein akan mengendap dalam medium reaksi alkohol.
Metode uji DPPH dikembangkan oleh Blois pada tahun 1958. Namun, karena mekanisme reaksinya adalah kolorimetri maka uji DPPH memerlukan spektrofotometer UV.
Penelitian metode DPPH terus dikembangkan dan mengarahkan pada pengembangan pendekatan baru untuk mengukur aktivitas antioksidan. Misalnya, Milardović, Iveković, dan Grabarić (2006) mengembangkan metode baru amperometri untuk aktivitas antioksidan menggunakan DPPH. Baru-baru ini, pendekatan baru untuk mengukur aktivitas antioksidan yang berdasarkan pada perbedaan sumber, seperti sensor grafit (El-Kosasy et al., 2013), pelat
6 | P a g e
TLC (Akar et al., 2017), metode laminasi (Sirivibulkovit, Nouanthavong, & Sameenoi, 2018), dan metode HPLC (Qiu et al., 2012). Metode ini dikembangkan untuk menyederhanakan pengujian DPPH. Namun demikian metode spektrofotometri DPPH banyak diaplikasikan dalam riset dan akademik, tetapi kelemahan terbesar penggunakan spektrofotometer yaitu biaya tinggi. Oleh karena itu, dikembangkan uji aktivitas antioksidan menggunakan lempeng kromatografi lapis tipis (KLT), yang merupakan alternatif metode spektrofotometri dan spektroskopi.
2.2.1 Reagen dan Kondisi Reaksi
Kelarutan senyawa antioksidan berbeda-beda. Senyawa antioksidan bersifat larut air, larut lemak dan tidak larut atau terikat pada dinding sel (Prakash, 2001). Pelarut yang paling banyak digunakan dalam penetapan aktivitas peredaman radikal DPPH adalah metanol dan etanol. Pelarut metanol atau etanol berfungsi untuk melarutkan kristal DPPH serta memiliki sifat yang dapat melarutkan senyawa antioksidan. Metanol digunakan sebagai pelarut oleh Miller et al. (2000); Prakash (2001); Kim et al. (2002); Molyneux (2003);Tarozzi et al. (2004);
Qian and Nihorimbere (2004); Benkeblia (2005); Kaukovirta-Norja et al. (2005); Sroka and Cisovski (2005); Lachman et al. (2006); Gupta et al. (2007); Ivanov (2007); Marxen et al.
(2007); Mihalev et al. (2007); Butkhup and Samappito (2008); Dvořáková et al. (2008);
Lachmanet al. (2008); Pérez-Jiménez et al. (2008); Singh et al. (2008); Tabart et al. (2009);
Kamkar et al. (2010); Shikanga et al. (2010), sementara pelarut etanol digunakan olehh Pavlov et al. (2002); Kwon et al. (2003); Molyneux (2003); Liebenberg (2004); Paulová et al. (2004);
Silva (2004); Yang et al. (2004); Kitao et al. (2005); Othman et al. (2005);Stoilova et al. (2005);
Agshar and Masood (2008) and Gülcin et al. (2010).
Konsentrasi larutan kerja DPPH yang digunakan dalam rentang yang luas yaitu 0,05 mM - 1.5 M (Kim et al., 2002). Konsentrasi yang cukup sering digunakan pada 0.10 mM (Miller et al., 2000; Kwon et al., 2003; Gupta et al., 2007; Asghar and Masood, 2008; Singh et al., 2008; Kamkar et al., 2010; Gülcin et al., 2010; Shikanga et al., 2010), 0.06 mM (Qian and Nihorimbere, 2004; Lachman et al., 2006; Ivanov, 2007; Mihalev et al., 2007), 0.05 mM (Ismail and Hong, 2002; Silva, 2004; Kitao et al., 2005; Othman et al., 2007) dan 0.09 mM (Liebenberg, 2004; Tarozi et al., 2004; Sroka and Cisowski, 2005).
Perbedaan konsentrasi DPPH menyebabkan perbedaan yang substansial dalam rasio antara volume sampel dan reagen. Dalam beberapa literatur ditemukan bahwa rasio dari 3: 1 (Gupta et al., 2007; Gülcin et al., 2010) menjadi 1: 600 (Lachman et al., 2006). Hampir setiap metode mengembangkan rasio volume sampel/reagen sendiri. Rasio 1:1 digunakan oleh 5
7 | P a g e
metode penelitian (Ismail dan Hong, 2002; Molyneux, 2003; Kitao et al., 2005; Othman et al., 2007; Singh et al., 2008) dan rasio 1:7,5 digunakan dengan dua metode (Ivanov, 2007; Mihalev et al., 2007).
Lama waktu reaksi aktivitas radical scavenging antara larutan DPPH dan sampel bervariasi antara 1 menit (Sroka and Cisowski, 2005) sampai 240 menit (Miller et al., 2000;
Prakash, 2001). Peneliti yang berbeda menggunakan 5 menit (Lahman et al., 2006; Tabart et al., 2009), 10 menit (Lahman et. al., 2008), 15 menit (Pavlov et al. 2002), 20 menit (Ismail and Hong, 2002; Kitao et al., 2005; Othman et al., 2005; Ivanov, 2007; Mihalev et al., 2007;
Singh et al., 2008), 30 menit (Kim et al., 2002; Kwon et al., 2003; Molyneux, 2003; Tarozzi et al., 2004; Yang et al., 2004; Stoilova et al., 2005; Gupta et al., 2007; Wang and Li, 2007;
Gülcin et al., 2010; Kamkar et al., 2010), 60 menit (Liebenberg, 2004; De et al., 2007), 90 menit (Asghar and Masood, 2008) dan 120 menit (Dvořáková et al., 2008). Durasi reaksi yang paling banyak digunakan adalah 20 menit dan 30 menit. Durasi waktu reaksi diperlukan agar reaksi antioksidan dengan radikal bebas dapat berlangsung sempurna. Setiap larutan standar atau sampel harus diperlakukan sama.
Penentuan aktivitas radical scavenging oleh DPPH dilakukan pada beberapa panjang gelombang yang berbeda. Absorbansi uji diukur pada panjang gelombang 492 nm (Shikanga et al., 2010) dan 540 nm (Liebenberg, 2004). Panjang gelombang 515 nm digunakan oleh Brand-Williams et al. (1995); Miller et al. (2000); Molyneaux (2003); He and Nihorimbere (2004); Benkeblia (2005); Kaukovirta-Norja et al. (2005); Sroka and Cisowski (2005); Lahman et al. (2006); Ivanov (2007); Mihalev et al. (2007); Dvořáková et al. (2008); Lahman et al.
(2008); Pérez-Jiménez et al. (2008), 516 nm by Molyneaux (2003); Kaukovirta-Norja et al.
(2005), 517 nm oleh Prakash (2001); Ismail and Hong (2002); Pavlov et al. (2002); Kwon et al. (2003); Molyneaux (2003); Silva (2004); Yang et al. (2004); Kitao et al. (2005); Kaukovirta- Norja et al. (2005); Othman et al. (2005); Paulová et al. (2005); Gupta et al. (2007); Wang and Li (2007); Asghar and Masood (2008); Singh et al. (2008); Tabart et al. (2009); Kamkar et al.
(2010); Gülcin et al. (2010), 518 nm oleh Molyneaux (2003); Stoilova et al. (2005), 520 nm oleh Kim et al. (2002); Molyneaux (2003) dan 525 nm oleh Tarozzi et al. (2004). Berdasarkan data penelitian tersebut, pengukuran absorbansi paling banyak dilakukan pada panjang gelombang 517 nm dan 515 nm.
Aktivitas radical scavenging dapat dihitung dengan menggunakan larutan standar yang berbeda. Larutan standar merupakan senyawa antioksidan alami maupun sintetik yang sudah diketahui karakterististik dan kadarnya. Larutan standar tersebut berfungsi sebagai pembanding atau acuan untuk menghitung aktivitas pemulungan radikal larutan sampel yang mengandung
8 | P a g e
antioksidan. Larutan standar juga berfungsi sebagai kontrol positif untuk me Berdasarkan kajian literatur, ada 5 standar senyawa antioksidan yang digunakan. Antioksidan yang sering digunakan adalah vitamin C (asam askorbat), Trolox dan vitamin E (α-Tocopherol). Vitamin C (asam askorbat) digunakan oleh Kwon et al. (2003); Molyneaux (2003); Liebenberg (2004);
Paulová et al. (2004); Tarozzi et al. (2004); Othman et al. (2005); Lahman et al. (2006); Wang and Li (2007); Asghar and Masood (2008); Lahman et al. (2008); Shikanga et al. (2010).
Trolox dipilih oleh Miller et al. (2000); Prakash (2001); Liebenberg (2004); Paulová et al.
(2004); Silva (2004); Dragović-Uzelac et al. (2007); Ivanov (2007); Mihalev et al. (2007);
Tabart et al. (2009). Vitamin E (α-Tocopherol) digunakan oleh Ismail and Hong (2002);
Molyneaux (2003); Silva (2004); Gupta et al. (2007); Marxen et al. (2007); Asghar and Masood (2008). Antioksidan yang jarang digunakan yaitu BHT (Ismail and Hong, 2002; Asghar and Masood, 2008) dan BHA (Singh et al., 2008).
Vitamin C (asam askorbat)
Butil hidroksi anisol (BHA)
Trolox Butil hidroksi toluene (BHT)
Vitamin E (α-Tocopherol)
Gambar 3 Beberapa senyawa antioksidan
9 | P a g e
2.2.2 Analisis dan Pengolahan Data
Aktivitas radical scavenging oleh DPPH atau penghambatan radikal DPPH (dinyatakan dalam %) dapat dihitung dengan beberapa rumus berikut ini :
𝐴 = (𝐴𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙− 𝐴𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙)
𝐴𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑥 100 %
(Bankeblia, 2005; Kitao et al., 2005; Molyneaux, 2003; Pavlov et al, 2002; He and Nihorimbere, 2004; Singh et al.,al., 2008; Wang and Li, 2007; Kamkar et al., 2010).
𝐵 = (1 −𝐴𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
𝐴𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙) 𝑥 100 %
(Lahman et al., 2008; Lahman et al., 2006; Othman et al., 2005; Gülcin et al., 2010).
𝐶 = [1 −(𝐴𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙− 𝐴𝑏𝑙𝑎𝑛𝑘𝑜)
𝐴𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 ] 𝑥 100 %
(Stoilova et al., 2005; Yang et al., 2004)
𝐷 = [1 −𝐴𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
𝐴𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙] 𝑥 100 % (Ismail and Hong, 2002)
𝐸 = 𝐴𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
𝐴𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑥 100%
(Liebenberg, 2004)
𝐹 = (𝐴𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙− 𝐴𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙) (Sroka and Cisowski, 2005).
Beberapa peneliti (Kim et al., 2002; Kwon et al., 2003; Liebenberg, 2004; Asghar and Masood, 2008; Marxen et al., 2007; Prakash, 2001; Kaukovirta-Norja et al., 2005; Sanchez- Moreno et al., 1999; Pérez-Jiménez et al., 2008; Amit et al., 2010) mengekspresikan hasil aktivitas antioksidan dalam EC50 (konsentrasi efisiensi) yaitu konsentrasi substrat yang dapat menyebabkan DPPH kehilangan 50% aktivitasnya (warna). Hasil tambahan sebagai waktu untuk mencapai steady state pada tEC50 dan efisiensi antiradical (EC = 1/EC50 tEC50) diusulkan oleh Pérez-Jiménez et al. (2008).
Molyneux (2003) merekomendasikan untuk meningkatkan akurasi metode untuk kuvet spektrofotometri 1-cm dengan maksimum volume 4 mL, menggunakan 2 mL larutan DPPH dan 2 mL larutan sampel (rasio 1:1), pelarut metanol atau etanol (bukan air atau aseton), konsentrasi larutan DPPH 50 – 100 μM, waktu reaksi selama 30 menit dan standar atau kontrol positif yang digunakan asam askorbat (vitamin C) dan α-tocopherol (Vitamin E). Menurut
10 | P a g e
Molyneux, EC50 memiliki kekurangan dimana semakin tinggi aktivitas antioksidan maka semakin rendah nilai parameternya.
Aktivitas antioksidan pada radikal DPPH ditandai dengan perubahan warna ungu tua menjadi warna yang berkurang intensitasnya menjadi hilang. Semakin tidak berwarna atau semakin berkurang intensitas warnanya maka aktivitas antioksidan sampel tersebut semakin tinggi. Antioksidan dalam sampel akan menyumbangkan proton (atom H) pada radikal DPPH sehingga radikal menjadi molekul yang stabil (tidak radikal). Untuk menghitung IC50 atau EC50
antioksidan dengan menggunakan regresi linier kurva kalibrasi larutan standar atau sampel.
Persentase aktivitas antioksidan dari senyawa yaitu 50% sebagai nilai y dimasukkan ke dalam persamaan kurva kalibrasi sehingga dapat diperoleh berapa nilai x yaitu konsentrasi antioksidan dalam sampel (IC50 atau EC50).
Evaluasi aktivitas antioksidan dengan adanya perubahan absorbansi DPPH harus diinterpretasikan dengan hati-hati karena absorbansi DPPH pada panjang gelombang 517 nm dapat menurun oleh cahaya, oksigen, pH, dan jenis pelarut yang ditambahkan ke dalam antioksidan.
2.2.3 Prosedur Kerja
Tahapan yang dilakukan dalam uji aktivitas antioksidan dengan metode peredaman radikal bebas DPPH yaitu sebagai berikut :
1. Optimasi metode analisis (pelarut, waktu reaksi, rasio sampel dan reagen, panjang gelombang pengukuran)
a) Dibuat larutan DPPH sebagai radikal bebas dengan melarutkan 0.0024 g DPPH dalam pelarut metanol atau etanol (0.06 mM)
b) Optimasi metode dengan memvariasikan beberapa variabel reaksi berikut:
Faktor Nama - +
A Pelarut Metanol Etanol
B Durasi reaksi 20 menit 30 menit
C Rasio sampel/reagen 0.2 mL/1.5 mL 1.5 mL/1.5 mL
D Panjang gelombang 515 nm 517 nm
c) Hasil metode dinilai menggunakan desain percobaan sebagai desain faktorial dua tingkat dan faktorial fraksional. Delapan jalur percobaan dilakukan dua kali pengulangan secara acak pada kombinasi tingkat faktor tertentu.
11 | P a g e
d) Interpretasi hasil trials dan pengaruh variabel dengan analisis variansi (ANOVA).
2. Penentuan efek DPPH dan pelarut sampel
a) Siapkan larutan sampel dengan mengencerkan dengan pelarut organik yang berbeda yaitu metanol dan etanol.
b) Masing-masing larutan sampel direaksikan dengan larutan DPPH di dalam pelarut metanol atau etanol dengan rasio 1:1. Lakukan beberapa kali pengulangan.
c) Larutan dikocok dan disimpan di tempat gelap selama 30 menit.
d) Setelah 30 menit, ukur absorbansinya pada panjang gelombang 517 nm.
e) Analisis data seperti konsentrasi minimum, maksimum, rata-rata, standar deviasi dan koefisien variansinya
3. Optimasi larutan standar yang digunakan dengan memvariasikan senyawa standar antioksidan (vitamin C atau vitamin E) dan pelarutnya (metanol atau etanol).
a. Masing-masing buat beberapa tingkat konsentrasi larutan standar di dalam 2 pelarut yang berbeda secara terpisah (vitamin C dalam metanol dan etanol, vitamin E dalam pelarut metanol dan etanol).
b. Masing-masing larutan standar direaksikan dengan larutan DPPH dengan rasio volume larutan standar dan reagen 1:1.
c. Larutan dikocok dan disimpan di tempat gelap selama 30 menit.
d. Setelah 30 menit, ukur absorbansinya pada panjang gelombang 517 nm.
e. Masing-masing buat kurva kalibrasinya. Hitung persamaan linieritas dan koefisien regresinya dari kurva kalibrasi yang diperoleh. Semakin linier artinya koefisien regresi semakin mendekati 1 maka kurva kalibrasi tersebut semakin baik.
4. Penetapan aktivitas antioksidan sampel dengan peredaman radikal bebas DPPH a) Siapkan larutan sampel dengan mengencerkan dengan pelarut sesuai kondisi optimum
yang diperoleh pada percobaan sebelumnya
b) Siapkan larutan blanko yaitu pelarut yang telah dipilih
c) Siapkan larutan DPPH dengan melarutkan 0.0024 g DPPH di dalam 100 mL pelarut sesuai kondisi optimum (0.006 mM)
d) Siapkan larutan uji yaitu dengan mereaksikan larutan sampel dengan larutan DPPH dengan rasio optimum yang telah diperoleh misalnya 1:1. Larutan dikocok, simpan selama 30 menit di tempat yang gelap. Setelah 30 menit, ukur absorbansinya pada panjang gelombang 517 nm terhadap larutan blanko
e) Siapkan larutan kontrol yaitu dengan mereaksikan larutan blanko dengan larutan DPPH dengan rasio optimum yang telah diperoleh misalnya 1:1. Larutan dikocok, simpan
12 | P a g e
selama 30 menit di tempat yang gelap. Setelah 30 menit, ukur absorbansinya pada panjang gelombang 517 nm terhadap larutan blanko.
f) Hitung % scavenging activity radikal bebas DPPH atau % inhibisi radikal bebas DPPH dengan formula berikut :
𝐴 = (𝐴𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙− 𝐴𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙)
𝐴𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑥 100 %
g) Hitung IC50 antioksidan dalam sampel dengan menggunakan regresi linier yang diperoleh dari kurva kalibrasi. Persentase aktivitas antioksidan dari senyawa yaitu 50%
sebagai nilai y dimasukkan ke dalam persamaan kurva kalibrasi sehingga dapat diperoleh berapa nilai x yaitu konsentrasi antioksidan dalam sampel.
2.2.4 Diagram Alir prosedur kerja
2.3 Aktivitas Antioksidan Ekstrak Daun Moringa oleifera (Kelor)
Moringa oleifera (kelor) merupakan tanaman asli daerah tropis dan subtropik dan telah dibudidayakan di semua area di Indonesia. Hampir semua bagian dari tumbuhan ini dapat dimakan dan semua bagian memiliki potensi yang baik sebagai obat (Abdulkarim, Long, Lai,
Optimasi metode analisis (memvariasikan
waktu reaksi, pelarut, rasio reagen dan sampel, panjang gelombang pengukuran)
Penentuan efek DPPH dan pelarut sampel
Optimasi larutan standar (memvariasikan
2 standar antioksidan dan 2 pelarut) Penetapan aktivitas
antioksidan sampel (sesuai kondisi optimum
yang diperoleh)
Analisis dan interpretasi data
13 | P a g e
Muhammad, & Ghazali, 2005). Semua bagian dari tumbuhan ini dilaporkan memiliki aktivitas biologi seperti mengurangi hiperglikemia, antiinflamatori, antidiabetes, antimikroba, antikanker dan antioksidan. Daun M. oleifera banyak memiliki kandungan nutrient yang dapat diserap oleh tubuh seperti vitamin, mineral dan asam lemak (Moyo, Masika, Hugo, &
Muchenje, 2011). Selain itu, daun kelor mengandung berbagai senyawa seperti flavonoid, fenolik dan karotenoid yang berfungsi sebagai antioksidan (Alhakmani, Kumar, & Khan, 2013;
Vongsak, Sithisarn, & Gritsanapan, 2014). Di Asia dan Afrika, daun kelor direkomendasikan sebagai suplemen karena kaya nutrien untuk ibu menyusui dan bayi. Beberapa senyawa telah diisolasi dari tumbuhan ini yaitu senyawa nitril, minyak mustard glikosida, glikosida benzil, glikosida fenolik, glikosida flavonoid, glikosida tiokarbamat dan asam amino (Farooq et.al., 2012). Ekstrak aktivitas antioksidan metanol dari daun kelor menunjukkan IC50 = 1.60 ± 0.03 mg/mL dengan uji DPPH dan IC50 = 1.02 ± 0.06 mg/mL menggunakan uji ABTS (Charoensin, S., 2014).
2.3.1 Desain Riset Evaluasi Aktivitas Antioksidan dari Ekstrak Daun Kelor 1. Alat dan Bahan
Alat
Alat-alat yang digunakan yaitu alat-alat gelas, blender, sentrifugasi, timbangan mikro, timbangan analitik, vortex, ultrasonic bath, inkubator untuk menginkubasi sampel, lemari asam, rotary evaporator, serta instrumen Spektrofotometer UV-Vis yang berfungsi untuk menganalisis reaksi.
Bahan
Daun kelor (Moringa oleifera), kertas saring, pelarut analytical grade : metanol, etil asetat, diklorometana, n-heksana, DMSO dan etanol p.a., Reagen DPPH dan ABTS, Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid) digunakan sebagai standar antioksidan.
2. Prosedur Kerja Ekstraksi Daun Kelor
a. Daun kelor dikeringkan pada suhu ruang kemudian dihaluskan dengan blender hingga menjadi serbuk.
b. Sebanyak 20 gram serbuk daun kelor diekstraksi dengan 250 mL pelarut (metanol, n- heksana, etil asetat dan diklorometana) dengan cara maserasi di dalam pelarut selama 3 jam kemudian diultrasonik selama 30 menit dengan ultrasonic bath.
14 | P a g e
c. Ekstrak disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 5 menit.
d. Masing-masing hasil ekstrak disaring dengan kertas saring. Filtrat diuapkan di dalam lemari asam atau menggunakan rotary evaporator untuk menghilangkan pelarut. Hasil ekstraksi selanjutnya disebut crude extracts sehingga akan didapatkan 4 crude extract (metanol, n-heksana, etil asetat dan diklorometana).
e. Crude ekstrak disimpan pada suhu 4℃ untuk pengujian selanjutnya.
Analisis Aktivitas Antioksidan
a. Digunakan metanol sebagai blanko, Trolox sebagai kontrol positif (larutan standar), dan crude extracts (metanol, n-heksana, etil asetat dan diklorometana) sebagai sampel.
b. Dibuat beberapa tingkat konsentrasi larutan standar dengan melarutkan standar Trolox di dalam pelarut metanol.
c. Dibuat beberapa tingkat konsentrasi larutan sampel dengan melarutkan crude extract metanol di dalam metanol. Lakukan prosedur yang sama dengan tiga crude extracts lainnya.
d. Disiapkan larutan DPPH sebagai radikal bebas dengan konsentrasi 6 × 10-5 M dalam pelarut metanol.
e. Dibuat larutan kontrol dengan mencampur 1 mL larutan DPPH dengan 33.33 µL pelarut metanol. Inkubasi selama 20 menit pada suhu 37℃. Ukur absorbansinya dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 515 nm. Dilakukan 3 kali pengulangan.
f. Buat larutan kontrol positif yaitu dengan mencampur 1 mL larutan DPPH dicampur dengan 33.33 µL larutan standar Trolox. Inkubasi selama 20 menit pada suhu 37℃.
Ukur absorbansinya dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 515 nm. Dilakukan 3 kali pengulangan.
g. Dibuat larutan sampel dengan prosedur berikut : 1 mL larutan DPPH dicampur dengan 33.33 µL larutan sampel. Inkubasi selama 20 menit pada suhu 37℃. Ukur absorbansinya dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang 515 nm. Dilakukan 3 kali pengulangan.
h. Hitung persentase hambatan radikal DPPH dengan formula berikut :
% 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑠𝑖 = (𝐴𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙− 𝐴𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙)
𝐴𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑥 100 % i. Hitung IC50 dari masing-masing larutan crude extracts.
2.3.2 Diagram Alir Riset
15 | P a g e
1. Ekstraksi Daun Kelor (Moringa oleifera)
Daun kelor dikeringkan dan diserbukkan (20 g dalam 250 mL pelarut)
Dilakukan ekstraksi pada kondisi optimum Pelarut :
Metanol, n-heksana, etil asetat, diklormetana
Maserasi selama 3jam Ultrasonik selama 30 menit
Sentrifugasi selama 5 menit pada 5000 rpm
Crude Ekstrak
16 | P a g e
2. Analisis Aktivitas Antioksidan
Siapkan larutan blanko (metanol), standar (Trolox) dan sampel
(crude extract)
Buat larutan DPPH (0.06 mM dalam metanol)
Buat beberapa tingkat konsentrasi larutan standar dalam metanol
Buat beberapa tingkat konsentrasi larutan crude
extracts dalam metanol
Larutan kontrol Larutan sampel Kontrol positif
1 mL larutan DPPH + 33.33 µL larutan kontrol/kontrol positif/sampel
Inkubasi selama 20 menit pada suhu 37℃
Ukur absorbansi
Hitung % inhibisi dan IC50
17 | P a g e
BAB III KESIMPULAN
Berbagai metode telah dikembangkan untuk mengevaluasi aktivitas antioksidan dari bahan alam Indonesia. Di antara metode-metode tersebut, metode % DPPH merupakan metode assay yang paling populer digunakan karena kemudahannya, cepat, biaya relatif murah, akurat dan sederhana untuk mengukur kemampuan senyawa sebagai pemulung/peredam radikal bebas atau donor hidrogen. Selain itu, metode DPPH tidak bergantung pada polaritas sampel dalam menskrining banyak sampel yang memiliki aktivitas sebagai antioksidan.
DPPH memiliki elektron tidak berpasangan (radikal) sehingga dalam pelarut (metanol atau etanol) akan memberikan larutan berwarna ungu tua yang ditandai pita serapan kuat pada panjang gelombang sekitar 515 - 517 nm. Aktivitas antioksidan pada radikal DPPH ditandai dengan perubahan warna ungu tua menjadi warna yang berkurang intensitasnya bahkan menjadi hilang. Antioksidan dalam sampel akan menyumbangkan proton (atom H) pada radikal DPPH sehingga radikal menjadi molekul yang stabil (tidak radikal). Semakin tinggi kandungan antioksidan maka warna ungu pada larutan DPPH akan semakin berkurang dan terbentuk larutan berwarna kuning/kuning pucat. Berkurangnya radikal DPPH dapat dimonitor secara spektrofotometri dengan menurunnya absorbansi pada 515 atau 517 nm.
18 | P a g e
DAFTAR PUSTAKA
Amorati, R., & Valgimigli, L. (2015). Advantages and limitations of common testing methods for antioxidants. Free Radical Research, 49(5), 633–649.
https://doi.org/10.3109/10715762.2014.996146
Erviana, L., Malik, A., & Najib, A. (2016). UJI AKTIVITAS ANTIRADIKAL BEBAS EKSTRAK ETANOL DAUN KEMANGI (Ocimum basilicum L.) DENGAN MENGGUNAKAN METODE DPPH. Jurnal Fitofarmaka Indonesia, 3(2), 164–168.
https://doi.org/10.33096/jffi.v3i2.217
Fitriana, W. D., Ersam, T., Shimizu, K., & Fatmawati, S. (2016). Antioxidant activity of Moringa oleifera extracts. Indonesian Journal of Chemistry, 16(3), 297–301.
https://doi.org/10.22146/ijc.21145
Kandi, S., & Charles, A. L. (2019). Statistical comparative study between the conventional DPPH [rad] spectrophotometric and dropping DPPH [rad] analytical method without spectrophotometer: Evaluation for the advancement of antioxidant activity analysis. Food Chemistry, 287(February), 338–345. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2019.02.110
Kedare, S. B., & Singh, R. P. (2011). Genesis and development of DPPH method of antioxidant assay. Journal of Food Science and Technology, 48(4), 412–422.
https://doi.org/10.1007/s13197-011-0251-1
Marinova, G., & Batchvarov, V. (2011). methods DPPH. Bulgarian Journal of Agricultural Science, 17(1), 11–24.
Nimse, S. B., & Pal, D. (2015). Free radicals, natural antioxidants, and their reaction mechanisms. RSC Advances, 5(35), 27986–28006. https://doi.org/10.1039/c4ra13315c Wang, Y., Gao, Y., Ding, H., Liu, S., Han, X., Gui, J., & Liu, D. (2017). Subcritical ethanol
extraction of flavonoids from Moringa oleifera leaf and evaluation of antioxidant activity.
Food Chemistry, 218, 152–158. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2016.09.058
Yong-Bing, X., Gui-Lin, C., & Ming-Quan, G. (2019). Antioxidant and anti-inflammatory activities of the crude extracts of moringa oleifera from kenya and their correlations with flavonoids. Antioxidants, 8(8). https://doi.org/10.3390/antiox8080296
.
View publication stats
