i
LAPORAN TAHUNAN
PENELITIAN HIBAH BERSAING
PRODUKSI BIOMASSA, LIPID DAN PROTEIN SEL TUNGGAL MIKROALGA Nannochloropsis sp SEBAGAI
SUPLEMEN MAKANAN
TAHUN KE-1 DARI RENCANA 2 TAHUN
TIM PENGUSUL
A. A. M. Dewi Anggreni, S.TP., M.Si. NIDN:0017117401 Putu Ari Sandhi W., S.TP., M.Si. NIDN: 0016047402
Dibiayai oleh
Direktorat Penelitian dan Pengabdian kepada Masyarakat Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Kementerian Pendidikan dan Kebudayaan
Sesuai Dengan Surat Perjanjian Penugasan Pelaksanaan Penelitian Nomor : 311-26/UN14.2/PNL.01.03.00/2015
UNIVERSITAS UDAYANA
OKTOBER 2015
ii
iii ABSTRAK
Beberapa jenis mikroalga telah berhasil di isolasi di Perairan Pantai Pulau Bali. Dari seleksi beberapa jenis mikroalga, diperoleh isolat Nannochloropsis sp isolat K4 yang mempunyai kecepatan tumbuh dan stabilitas tertinggi dari yang lainnya. Berkaitan dengan kondisi ini, maka dalam penelitian akan dikaji potensi mikroalga Nannochloropsis sp isolat K4. dalam menghasilkan produk berupa biomassa, lipid dan protein. Produk-produk ini diharapkan dapat diaplikasikan sebagai nutrisi pangan, ataupun obat-obatan maupun suplemen. Tujuan khusus penelitian ini adalah menentukan waktu panen yang tepat pada proses produksi biomassa pada berbagai media, menentukan jenis media yang tepat pada proses kultivasi untuk memproduksi biomassa, menentukan titik optimum konsentrasi nitrat dan posfat dalam produksi lipid dan protein, menentukan titik optimum kondisi pH dan salinitas pada proses produksi lipid dan menentukan profil penyusun komponen lipida
Penelitian ini diawali dengan penentuan pertumbuhan mikroalga Nannochloropsis sp pada 5 jenis media sehingga dapat diperoleh waktu panen yang tepat berdasarkan bobot biomassa kering mikroalga. Selanjutnya penentuan jenis media kultivasi yang tepat dengan Rancangan Acak Lengkap menggunakan 5 jenis media. Perlakuan yang menghasilkan biomassa dan kadar lemak tertinggi dipergunakan untuk penelitian selanjutnya. Setelah itu, dilakukan produksi biomassa dan lipid untuk tahap pertama. Percobaan produksi biomassa dan lipid dirancang dengan model optimasi Central Composite Design. Perlakuan yang dicobakan dalam rancangan ini adalah konsentrasi nitrat dan posfat, serta faktor lingkungan yang terdiri dari pH dan salinitas. Data yang dihasilkan dianalisis dengan menggunakan metode response surface. Proses selanjutnya adalah proses ekstraksi lipid. Lipid yang diperoleh kemudian dianalisa profil asam-asam lemaknya.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa waktu panen Nannochloropsis sp. berbeda- beda pada berbagai media. Waktu panen Nannochloropsis sp. yang dikultivasi pada media walne, media pertanian, dan media guillard berturut-turut adalah hari ke 10, 8, dan 11 inkubasi. Pada media Allen Miquel dan media Blue Green 11, waktu panen Nannochloropsis sp. adalah hari ke 12 inkubasi. Konsentrasi biomassa tertinggi (0,21 g/l) diperoleh dari mikroalga Nannochloropsis sp. yang dikultivasi pada media Walne, namun tidak berbeda jauh dari media guillard. Kadar lemak tertinggi dihasilkan oleh Nannochloropsis sp. yang dikultivasi pada media guillard sebesar 10,00 %bk dan berbeda tidak nyata dengan media blue green – 11. Media guillard selanjutnya dipilih sebagai media untuk kultivasi pada penelitian selanjutnya. Konsentrasi biomassa Nannochloropsis sp. berada pada kondisi optimum pada konsentrasi nitrat 181,55 g/l dan konsentrasi fosfat 21,24 g/l dalam media guillard dengan konsentrasi biomassa sebesar 0,7 g/l. Kadar lemak tertinggi sebesar 25,70 %bk dihasilkan dari perlakuan konsentrasi nitrat 30 g/l dan fosfat 15 g/l pada media guillard. Konsentrasi biomassa Nannochloropsis sp. berada pada kondisi optimum pada salinitas 32,62 dan pH 8,44 dengan konsentrasi biomassa sebesar 0,19 g/l. Kadar lemak Nannochloropsis sp. berada pada kondisi optimum pada salinitas 29,76 dan pH 8,5 dengan konsentrasi lemak 33,38
%bk. Asam lemak Nannochloropsis sp. terdiri atas asam kaprilat, asam kaprat, asam laurat, asam miristat, asam palmitat, asam stearat, asam palmitoleinat, asam oleat, asam linoleat dan asam linolenat. Asam lemak jenuh Nannochloropsis sp. tertinggi adalah asam palmitat sejumlah 542,44 mg asam lemak/100g dan asam lemak tidak jenuh tertinggi adalah asam linoleat sejumlah 332,34 mg asam lemak/100g
Kata Kunci : biomassa, lipid, mikroalga, Nannochloropsis sp isolat K4,.
iv
KATA PENGANTAR
Puji syukur dan terima kasih sedalam-dalamnya kami haturkan kehadapan Tuhan Yang Maha Esa, karena berkat rahmat dan karunianya laporan penelitian yang berjudul
“Produksi Biomassa, Lipid Dan Protein Sel Tunggal Mikroalga Nannochloropsis Sp Sebagai Suplemen Makanan” dapat diselesaikandengan baik.
Pada kesempatan ini kami menyampaikan ucapan terima kasih kepada Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi (DIKTI) yang telah membiayai penelitian ini melalui program Desentralisasi Hibah Bersaing 2015.
Atas segala kekurangan hasil penelitian ini, kami dengan setulus hati memohon maaf dan kritik dan saran yang bersifat membangun sangat kami harapkan sehingga laporan penelitian ini diwujudkan sesuai dengan harapan.
Bukit Jimbaran, 28 Oktober 2015
Peneliti
v
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN SAMPUL i
HALAMAN PENGESAHAN ii
ABSTRAK iii
KATA PENGANTAR iv
DAFTAR ISI v
BAB I. PENDAHULUAN
1. 1. Latar Belakang 1
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Mikroalga Nannochloropsis sp 3
2.2. Manfaat dan Nutrisi Nannochloropsis sp 3
2.3. Faktor-faktor yang Mempengaruhi Pertumbuhan Mikroalga 4
2.4. Road Map Penelitian 5
BAB III. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN
3.1. Tujuan Penelitian 7
3.2. Manfaat Penelitian 7
BAB IV. METODE PENELITIAN
4.1. Sistematika dan Fishbone Usulan Penelitian 8
4.2. Tempat dan Waktu Penelitian 9
4.3. Bahan dan Alat Penelitian 9
4.4. Tahun I/Tahap I : Produksi Lipid 10
4.4.1. Peremajaan kultur murni 10
4.4.2. Penentuan Waktu Panen 10
4.4.3 Penentuan Jenis Media 10
4.4.4. Produksi Lipid 12
4.4.5. Ekstraksi Lipid dan Profil Asam Lemak 13
4.5. Luaran/Indikator capaian Penelitian Tahun I 14
4.6. Prosedur Analisa 14
4.7. Tahun II/Tahap II : Produksi Protein 16
4.7.1. Produksi protein 16
4.7.2. Ekstraksi dan penentuan profil protein 17
4.8. Prosedur Analisa 17
4.9. Luaran/Indikator Capaian Penelitian Tahun II 18
BAB V. HASIL DAN PEMBAHASAN
5.1. Pertumbuhan Mikroalga 19
5.2. Produksi Biomassa Nannochloropsis sp 20
5.3. Kadar Lemak Nannochloropsis sp. 21
5.4. Optimasi Nitrat dan Fosfat Terhadap Konsentrasi Biomassa Nannochloropsis sp 23 5.5. Kadar Lemak Mikroalga Nannochloropsis sp. Dengan Perlakuan Konsentrasi
Nitrat dan Fosfat
26
vi
5.6. Optimasi Salinitas dan pH terhadap Konsentrasi Biomassa Nannochloropsis sp. 27 5.7. Optimasi Salinitas dan pH terhadap Kadar Lemak Nannochloropsis sp. 31
5.8. Profil asam lemak Nannochloropsis sp. 34
BAB VI. RENCANA TAHAPAN BERIKUTNYA 35
BAB VI. KESIMPULAN
36
DAFTAR PUSTAKA 38
LAMPIRAN 40
1
BAB 1. PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang
Wilayah Indonesia sebagian besar merupakan laut dan memiliki kekayaan yang beranekaragam. Saat ini, penggalian potensi biota laut terutama mikroalga untuk meningkatkan ketahanan pangan masih sangat minim. Dengan wilayah perairan yang sangat luas ini, maka Indonesia memiliki potensi yang sangat besar untuk menemukan spesies mikroalga yang cocok untuk dikembangkan sebagai sumber nutrisi. Berdasarkan hasil penelitian Arnata et al., (2010) diperairan Pantai Pulau Bali telah berhasil diisolasi beberapa jenis mikroalga seperti mikroalga dari genus Nannochloropsis sp, Nitzschia sp, Botryococcus sp, Chaetoceros sp, Ceratium sp, Closterium sp, Cyclotella sp, dan Skeletonema. Dari beberapa genus yang berhasil diisolasi, ternyata Nannochloropsis sp mempunyai kecepatan dan kestabilan pertumbuhan yang paling tinggi di bandingkan dengan genus-genus lainnya.
Berkaitan dengan hal ini, maka diperlukan adanya penelitian lebih lanjut mengenai potensi mikroalga khususnya Nannochloropsis sp isolat K4 sebagai sumber pangan.
Dewasa ini, pengembangan produk makanan, minuman ataupun suplemen yang diklaim memberikan efek kesehatan semakin banyak, hal ini erat kaitannya dengan semakin meningkatnya kesadaran masyarakat akan pentingnya kesehatan. Berbagai sumber alam telah banyak diteliti untuk memperoleh senyawa bioaktifnya untuk dijadikan suplemen makanan, diantaranya adalah mikroalga. Saat ini mikroalga tidak saja diperuntukkan bagi dunia perikanan (sebagai pakan alami rotifer) namun sangat potensial untuk dikembangkan sebagai suplemen makanan, untuk farmasi, dan kosmetik. Keunggulan dari mikroalga adalah tidak tergantung pada musim, waktu pertumbuhan cepat sehingga waktu panen tidak terlalu lama, produksi dapat dilakukan secara terus menerus, tidak berdampak buruk bagi lingkungan, produksinya dapat dilakukan sesuai dengan kebutuhan, serta aman bagi kesehatan. Mikroalga mengandung berbagai macam komponen yang sangat bermanfaat khususnya untuk nutrisi dalam bahan pangan, seperti lipid, karbohidrat, protein dan asam-asam nukleat (Brown et al.,1993., Sankar dan Ramasubramanian., 2012). Lemak yang terkandung dalam mikroalga umum terdiri atas asam lemak tidak jenuh, seperti linoleat, eicosapentaenoic acid/EPA (Rebolloso et al., 2001) dan docosahexaenoic acid/DHA (Hu dan Gao, 2006., Chisti, 2007).
Asam-asam lemat tidak jenuh telah banyak dilaporkan sangat menguntungkan bagi kesehatan terutama sebagai makanan suplemen pencegahan penyakit kardiovaskuler, arterosklerosis, dan kanker (Colquhoun, et al., 2008). Eicosapentaenoic acid atau EPA dan DHA
2
memainkan peran penting dalam perkembangan otak dan retinal bayi. Selain lemak, mikroalga juga mengandung protein dan asam-asam nukelat (Spolaore et al., 2006). Sebagai contohnya mikroalga Chlorella vulgaris mengandung protein sekitar 51 – 58% dan asam nukleat 4 – 5% (Becker, 1994). Tetraselmis chuii mengandung protein 48,42% (Brown et.al., 1997). Mikroalga juga berpotensi menghasilkan pigmen yang dapat dimanfaatkan sebagai bioaktif, seperti Dunaliella mengandung karotenoid sekitar 12,6% bk (Fretes et al., 2013), dan Nannochloropsis sp mengandung klorofil-a sekitar 0,73-2,85 µg/ml (Allsul dan Wan, 2012). Berbagai jenis pigmen yang dihasilkan dari mikroalga dapat dimanfaatkan sebagai sumber antioksidan dalam bahan pangan.
Dalam memproduksi komponen-komponen nutrisi, maka jenis media dalam kultivasi dan faktor lingkungan sangat berpengaruh terhadap pertumbuhan dan perkembangan mikroalga (Faria et al., 2012). Kondisi media dan lingkungan berhubungan langsung dengan proses fotosintesis, metabolisme, maupun reproduksi (Graham et al., 2009). Dalam media pertumbuhan unsur nitrat dan posfat merupakan dua unsur yang mutlak harus tersedia dalam media kultur mikroalga. Nitrogen dalam nitrat merupakan salah satu makronutrien yang sangat mempengaruhi pertumbuhan dan produktifitas biomassa alga karena dibutuhkan untuk pembentuk protein, lemak dan klorofil (Hu dan Gao, 2006). Lebih lanjut Renaud dan Parry (1994) menyebutkan bahwa pengaturan faktor-faktor lingkungan seperti cahaya, pH, temperatur dan salinitas juga diperlukan dan dapat berpengaruh terhadap kuantitas biomassa dan komposisi komponen nutrisi yang terkandung dalam mikroalga.
Melihat banyaknya keanekaragaman dan potensi yang dimiliki oleh mikroalga serta belum diketahuinya jenis media, beberapa faktor nutrisi, dan lingkungan yang optimal dalam pertumbuhan untuk memproduksi biomassa dan komponen-komponen nutrisi, maka perlu dilakukan penelitian mengenai potensi penggunaan mikroalga sebagai sumber pangan fungsional dengan memperlakukan faktor-faktor jenis media dan nutrisi beserta faktor-faktor lingkungan.
Berdasarkan uraian latar belakang diatas maka rumusan permasalahan secara umum adalah: 1) Berapakah waktu panen yang tepat untuk produksi biomassa ?, 2) Apa jenis media yang tepat pada proses kultivasi untuk memproduksi biomassa dan lipid ?, 3) Berapakah konsentrasi nitrat dan posfat yang tepat dalam produksi lipid ?, 4) Berapakah titik optimum kondisi pH dan salinitas pada proses produksi lipid ?, 5) Bagaimana profil asam-asam lemak lipida yang dihasilkan dari ekstrak mikroalga ?
3
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Mikroalga Nannochloropsis sp
Mikroalga Nannochloropsis sp. merupakan jenis alga hijau (Cholorphyta) yang memiliki sel berwarna hijau, tidak bermotil, dan tidak memiliki flagel. Selnya berbentuk bola berukuran sedang dengan diameter 2-8 μm, tergantung spesiesnya, dengan khloroplas berbentuk cangkir. Nannochloropsis sp. melimpah di sepanjang pantai zona fotik dengan konsentrasi 102-104 sel/cm3 (Hu dan Gao, 2006). Nannochloropsis sp. dapat tumbuh baik pada kisaran pH 7-9, tetapi tumbuh rendah pada pH 10 (Elzenga et al., 2000).
Nannochloropsis sp. adalah salah satu tanaman yang paling efisien dalam menangkap dan memanfaatkan cahaya dan karbondioksida (CO2) untuk keperluan fotosintesis. Pertumbuhan sel Nannochloropsis sp. sangat dipengaruhi oleh tiga komponen penting untuk tumbuh yaitu cahaya, karbondioksida (CO2) dan nutrien (Diharmi, 2001). Nannochloropsis sp. memiliki sejumlah kandungan pigmen dan nutrisi seperti protein (52,11%), karbohidrat (16%), lemak (27,64%), dan vitamin C (0,85%) (Isnanstyo dan Kurniastuti, 1995).
2.2. Manfaat dan Nutrisi Nannochloropsis sp.
Nannochloropsis oculata lebih dikenal dengan nama Chlorella laut, dalam pembenihan mempunyai tiga peranan yaitu digunakan sebagai pakan pada klutur rotifer, untuk pengkayaan rotifer, dan untuk menghasilkan efek “green water” pada pemeliharaan larva (Richmond and Cheng-Wu, 2001). Nannochloropsis oculata dapat digunakan sebagai pakan rotifer, karena ukuran tubuhnya sesuai dengan bukaan mulut rotifer, mempunyai kandungan vitamin B12 dan eicosa pentaenoic acid (EPA) sebesar 30,5% dan total kandungan ω3 HUFA sebesar 42,7 %. Vitamin B12 sangat penting untuk populasi rotifer dan EPA penting untuk nilai nutrisi rotifer untuk pakan larva dan juvenil ikan laut (Isnansetyo dan Kurniastuty, 1995).
Nannochloropsis sp. telah dimanfaatkan dalam produksi biomassa, produksi energi, produksi berbagai produk bermanfaat, bioakumulasi senyawa tertentu serta berbagai proses biotransformasi. Produk-produk yang dihasilkan Nannochloropsis sp. sebagian besar bersifat ekstraselular, mulai dari metabolit sederhana hingga antibiotik kompleks, toksin, pigmen serta sejumlah produk bermanfaat lainnya (Becker , 1994). Chisti (2007) menambahkan bahwa, Nannochloropsis sp. dapat digunakan sebagai bahan baku biodiesel dan biodiesel dari Nannochloropsis sp. memiliki banyak keuntungan, hal tersebut dikarenakan mikroalga
4
mudah dikultivasi dan dalam waktu 24 jam mikroalga dapat bertambah banyak menjadi dua kali lipat.
2.3. Faktor-faktor yang Mempengaruhi Pertumbuhan Mikroalga
Kultivasi mikroalga dipengaruhi oleh beberapa faktor umum seperti faktor eksternal (lingkungan) dan nutrien. Faktor-faktor lingkungan dan nutrien tersebut berpengaruh terhadap laju pertumbuhan dan metabolisme mikroalga. Faktor-faktor tersebut adalah :
(a) Derajat Keasaman (pH). Derajat keasaman atau pH digambarkan sebagai keberadaan ion hidrogen. Variasi pH dalam media kultur dapat mempengaruhi metabolisme dan pertumbuhan kultur mikroalga antara lain mengubah keseimbangan karbon anorganik, mengubah ketersediaan nutrien dan mempengaruhi fisiologi sel. Kisaran pH untuk kultur alga biasanya antara 7-9, kisaran optimum untuk alga laut berkisar antara 7,8-8,5. Secara umum kisaran pH yang optimum untuk kultur mikroalga adalah antara 7–9 (Slamet, 2008).
(b) Salinitas. Kisaran salinitas yang berubah-ubah dapat mempengaruhi pertumbuhan mikroalga. Beberapa mikroalga dapat tumbuh dalam kisaran salinitas yang tinggi tetapi ada juga yang dapat tumbuh dalam kisaran salinitas yang rendah. Namun, hampir semua jenis mikroalga dapat tumbuh optimal pada salinitas sedikit dibawah habitat asal. Pengaturan salinitas pada media yang diperkaya dapat dilakukan dengan pengenceran dengan menggunakan air tawar. Kisaran salinitas yang paling optimum untuk pertumbuhan mikroalga adalah 25-35‰ (Sylvester et al., 2002).
(c) Suhu. Suhu merupakan salah satu faktor penting yang mempengaruhi pertumbuhan mikroalga. Perubahan suhu berpengaruh terhadap proses kimia, biologi dan fisika, peningkatan suhu dapat menurunkan suatu kelarutan bahan dan dapat menyebabkan peningkatan kecepatan metabolisme dan respirasi mikroalga di perairan. Secara umum suhu optimal dalam kultur mikroalga berkisar antara 20-24 oC. Suhu dalam kultur diatur sedemikian rupa bergantung pada media yang digunakan. Suhu di bawah 16 oC dapat menyebabkan kecepatan pertumbuhan turun, sedangkan suhu diatas 36 oC dapat menyebabkan kematian (Taw, 1990).
(d) Cahaya. Cahaya merupakan sumber energi dalam proses fotosintesis yang berguna untuk pembentukan senyawa karbon organik. Intensitas cahaya sangat menentukan pertumbuhan mikroalga yaitu dilihat dari lama penyinaran dan panjang gelombang yang digunakan untuk fotosintesis. Cahaya berperan penting dalam pertumbuhan mikroalga, tetapi kebutuhannya bervariasi yang disesuaikan dengan kedalaman kultur dan kepadatannya.
5
(e) Karbondioksida. Karbondioksida diperlukan oleh mikroalga untuk memenbantu proses fotosintesis. Karbondioksida dengan kadar 1-2% biasanya sudah cukup digunakan dalam kultur mikroalga dengan intensitas cahaya yang rendah. Kadar karbondioksida yang berlebih dapat menyebabkan pH kurang dari batas optimum sehingga akan berpengaruh terhadap pertumbuhan mikroalga (Taw, 1990).
(f) Nutrien. Mikroalga memperoleh nutrien dari air laut yang sudah mengandung nutrien yang cukup lengkap. Namun pertumbuhan mikroalga dalam kultur dapat mencapai optimum dengan mencampurkan air laut dengan nutrien yang tidak terkandung dalam air laut tersebut.
Nutrien tersebut dibagi menjadi makro nutrien dan mikro nutrien. Unsur makro nutrien terdiri atas N (meliputi nitrat), P (Posfat), K (Kalium), C (Karbon), Si (silikat), S (Sulfat) dan Ca (Kalsium). Unsur mikro nutrien terdiri atas Fe (Besi), Zn (Seng), Cu (Tembaga), Mg (Magnesium), Mo (Molybdate), Co (Kobalt), B (Boron), dan lainnya (Sylvester et al., 2002;
Edhy et al., 2003; Cahyaningsih, 2009).
(g) Aerasi. Aerasi dalam kultivasi mikroalga digunakan dalam proses pengadukan media kultur. Pengadukan sangat penting dilakukan bertujuan untuk mencegah terjadinya pengendapan sel, nutrien tersebar dengan baik sehingga mikroalga dalam kultur mendapatkan nutrien yang sama, mencegah sratifikasi suhu, dan meningkatkan pertukaran gas dari udara ke media (Taw, 1990).
2.4. Road Map dan Fish Bone Penelitian
Road map penelitian ini disajikan pada Gambar 1
6
Pengambilan Sampel Mikroalga di perairan pantai
Pulau Bali) Penelitian dan pengembangan produk berbasis mikroalga
Indikator capain (produk)
2011-1013 2014 2015
Kultivasi mikroalga pada media standar Isolasi dan Pemurnian
mikroalga Penyimpanan dan pemeliharaan strain
mikroalga Peremajaan dan perbanyakan sel isolat Analis produksi biomassa
dan lipid
Pemilihan beberapa isolat yang berpotensi
Isolat Mikroalga potensial
Isolat Mikroalga potensial Peremajaan kultur murni Penentuan jenis media yang tepat Penentuan Waktu panen Yang tepat
Produksi lipid
Optimasi faktor nutrisi dan faktor lingkungan Utk menghasilkan biomassa
dan lipid optimal
Time course pertumbuhan mikroalga sesuai dengan jenis media, Waktu panen terpilih, faktor nutrisi dan faktor
lingkungan yang optimal
2015- dst
Produksi dan pemanenan
biomasa Penelitian aplikasi
dibidang farmasi dan kosmetik Penelitian dibidang
Nutrisi dan food suplement
Food suplement, kosmetik dan obat-
obatan dll
Penentuan profil asam-asam lemak penyusun lipid
1. Jenis media dan waktu yang tepat untuk memproduksi biomassa dan lipid 2. Titik optimum nutrisi (nitrat dan posfat) dan lingkungan (pH dan salinitas) dalam memproduksi
biomassa dan lipid
3. Asam-asam lemak penyusun lipid yang potensial untuk dikembangkan sebagai sumber
pangan
Isolat Mikroalga potensial Peremajaan kultur murni
Produksi protein
Optimasi faktor nutrisi dan faktor lingkungan untuk menghasilkan
biomassa dan protein optimal Time course pertumbuhan mikroalga
sesuai dengan jenis media, Waktu panen terpilih, faktor nutrisi dan faktor
lingkungan yang optimal Penentuan profil asam-asam amino
penyusun protein
1. Titik optimum nutrisi (nitrat dan posfat) dan lingkungan (pH dan salinitas) dalam memproduksi
protein
2. Asam-asam amino penyusun protein yang potensial untuk dikembangkan sebagai sumber
pangan
Penelitian isolasi Pigmen (klorofil, karotenoid dll)
Gambar 1. Roadmap penelitian
43
BAB III. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN
3.1. Tujuan Penelitian
Tujuan yang ingin dicapai dari penelitian ini adalah sebagai berikut :
1. Menentukan waktu panen yang tepat pada proses produksi biomassa Nannochloropsis sp isolat K4.
2. Menentukan jenis media yang tepat pada proses kultivasi untuk memproduksi biomassa dan lemak Nannochloropsis sp isolat K4.
3. Menentukan konsentrasi nitrat dan posfat yang tepat dalam produksi lipid.
4. Menentukan titik optimum kondisi pH dan salinitas pada proses produksi lipid.
5. Menentukan profil asam-asam lemak lipida yang dihasilkan dari ekstrak mikroalga Nannochloropsis sp isolat K4.
3.2. Manfaat Penelitian
Manfaat penelitian ini adalah dapat diperoleh waktu panen yang tepat pada proses produksi biomassa Nannochloropsis sp isolat K4, diperoleh jenis media yang tepat pada proses kultivasi untuk memproduksi biomassa Nannochloropsis sp isolat K4, diperoleh konsentrasi penambahan nitrat dan posfat dalam produksi biomassa dan lipid, diperoleh titik optimum kondisi pH dan salinitas pada proses produksi biomassa dan lipid, serta diperoleh profil asam-asam lemak yang dihasilkan dari ekstrak mikroalga Nannochloropsis sp isolat K4.
44
BAB IV. METODE PENELITIAN
4.1.Sistematika dan Fishbone Penelitian
Sistematika penelitian yang akan dilakukan pada penelitian ini disajikan pada Tabel 1, sedangkan bagan fishbone disajikan pada Gambar 2.
Tabel 1. Sistematika Penelitian
Tahap Kegiatan Indikator capaian
Tahun 1
Produksi Biomassa dan Lipid
Pesiapan alat dan bahan
Peremajaan kultur murni
Penentuan jenis media yang sesuai berdasarkan konsentrasi lipid tertinggi yang digunakan untuk penelitian selanjutnya
waktu panen berdasarkan konsentrasi biomassa pada kurva pertumbuhan
Optimasi factor nutrisi media dalam produksi lipid yang dipergunakan untuk penelitian selanjutnya.
Optimasi factor lingkungan (pH dan Salinitas) dalam produksi lipid yang dipergunakan untuk penelitian selanjutnya.
Scale up pertumbuhan mikroalga sesuai dengan jenis media, waktu panen, faktor nutrisi dan faktor lingkungan yang optimal
Penentuan profil asam-asam lemak penyusun lipid mikroalga
a. Diperoleh waktu panen yang tepat dengan konsentrasi biomassa tertinggi
b. Diperoleh jenis media yang tepat dalam memproduksi lipid
c. Diperoleh kondisi optimum konsentrasi nitrat dan posfat dalam memproduksi lipida d. Diperoleh kondisi optimum
kondisi pH dan Salinitas dalam memproduksi lipida e. Diperoleh profil asam-asam
lemak penyusun lipid
f. Diperoleh biomassa dan lipid potensial utk dikembangkan sebagai suplemen makanan
g. Makalah untuk publikasi di jurnal nasional terakreditasi bertopik “optimasi produksi lipid dari mikroalga Nannochloropsis sp”.
Tahun 2
Produksi Protein Indikator capaian
Pesiapan alat dan bahan
Peremajaan kultur murni
Optimasi faktor nutrisi media dalam produksi protein yang dipergunakan untuk penelitian selanjutnya.
Optimasi faktor lingkungan (pH dan Salinitas) dalam produksi protein yang dipergunakan untuk penelitian selanjutnya.
Scale up pertumbuhan mikroalga sesuai dengan jenis media, waktu panen, faktor nutrisi dan faktor lingkungan yang optimal dalam memproduksi protein.
Penentuan profil asam-asam amino penyusun protein mikroalga
a. Diperoleh kondisi optimum konsentrasi nitrat dan posfat dalam memproduksi protein yang tinggi
b. Diperoleh kondisi optimum kondisi pH dan Salinitas dalam memproduksi protein yang tinggi
c. Diperoleh profil asam-asam amino penyusun protein.
d. Diperoleh protein sel tungggal potensial utk dikembangkan sebagai suplemen makanan.
e. Makalah untuk publikasi di
45
jurnal nasional terakreditasi bertopik “optimasi produksi lipid dari mikroalga Nannochloropsis sp”.
Produksi biomassa, lipid dan protein sebagai sumber pangan Mikroalga potensial (Nannochloropsis sp)
Peremajaan kultur Penentuan jenis media
Optimasi produksi lipid
Mikroalga potensial (Nannochloropsis sp) pH dan salinitas
Nitrat dan Posfat Penentuan waktu panen
Penentuan profil asam-asam lemak lipid
Peremajaan kultur Optimasi produksi protein
pH dan salinitas Nitrat dan Posfat Penentuan profil asam-asam amino protein
Gambar 2. Diagram fishbone penelitian produksi lipid dan protein
4.2. Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Bioindustri, Laboratorium Analisis Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian Universitas Udayana. Waktu pelaksanaan penelitian tahun 2015.
4.3.Bahan dan Alat Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah : sampel mikroalga yang diisolasi dari air laut di sepanjang pantai Kedonganan-Jimbaran, Badung, Bali. Bahan-bahan untuk media tumbuh mikroalga meliputi : medium Guillard, medium pertanian, medium BG-11, medium Allen-Miquel, dan medium standar walne. Bahan yang digunakan dalam proses analisis nutrisi adalah H2SO4 pekat, aquades, indikator PP, antibuih, NaOH, HCl, dan pelarut heksan. Alat yang dipergunakan adalah timbangan analitik, botol sampel, toples/galon, water pump, aerator, lampu tabung, saringan berseri, sentrifuge, autoclave, oven, freezer, laminar flow, lampu bunsen, pH meter, termometer, pipet mikro, jarum ose (loop), mikroskop, dan alat-alat gelas.
46 4.4.Tahun I/ Tahap I : Produksi Lipid
4.4.1. Peremajaan kultur murni
Peremajaan kultur dilakukan melalui beberapa tahapan, yaitu menumbuhkan koloni secara aseptik pada cawan petri berisi medium standar yang telah dipadatkan melalui penambahan agar sebanyak 1-1.5% melalui metode for way streak. Koloni yang tumbuh dipindahkan secara aseptik pada agar petri dish untuk mendapatkan kultur murni. Setelah beberapa hari koloni dipindahkan pada test tube yang berisi medium cair sebagai stok baru.
Stok kultur kemudian dipergunakan untuk proses selanjutnya dengan melakukan propagasi secara bertahap kevolume yang lebih besar.
4.4.2. Penentuan Waktu Panen
Waktu panen ditentukan dengan membuat kurva pertumbuhan mikroalga dengan jenis media terpilih sesuai dengan penelitian sebelumnya. Pada tahap ini preparasi inokulum dilakukan dalam keadaan aseptik. Sel mikroalga sebanyak 30 % v/v diinokulasikan pada flask 2 L yang mengandung medium sesuai perlakuan. Kultivasi dilakukan dalam erlenmeyer 2 L dengan pH media 6, suhu 28±2 oC, intensitas cahaya 1,2 ±0,5 klux dengan siklus perbandingan terang dengan gelap 12:12 jam, salinitas 27 %, dan dilakukan aerasi dengan mengalirkan udara ke dalam media. Proses kultivasi dilaksanakan selama 2 minggu atau 14 hari. Perubahan biomasa kultur diamati setiap 24 jam secara aseptis. Setiap perlakuan dilakukan tiga kali ulangan. Data yang diperoleh kemudian dibuatkan kurva pertumbuhannya.
Waktu panen ditentukan berdasarkan waktu akhir fase log atau waktu awal fase stasioner yang memberikan konsentrasi biomassa tertinggi. Biomassa yang diukur berdasarkan jumlah bobot kering biomassa g/l.
4.4.3. Penentuan Jenis Media a. Rancangan percobaan
Penelitian pada tahap ini bertujuan untuk menentukan jenis media yang sesuai untuk proses kultivasi mikroalga yang diperoleh pada tahap isolasi. Perlakuan dirancang dengan Rancangan Acak Lengkap dengan lima perlakuan jenis media yaitu (1) medium pertanian , (2) medium Allen-Miquel, (3) medium guillard, (4) medium Blue Green 11 (BG 11) dan (5) medium standar walne. Masing-masing perlakuan diulang 6 kali sehingga diperoleh 30 unit percobaan. Apabila perlakuan berpengaruh nyata, maka dilanjutkan dengan uji Duncan.
b. Pelaksanaan penelitian dan parameter yang diamati
Pada tahap ini preparasi inokulum dilakukan dalam keadaan aseptik, dan isolat yang diperoleh pada tahap isolasi dikultivasi dengan menggunakan medium sesuai dengan perlakuan. Sel mikroalga sebanyak 30 % v/v diinokulasikan pada flask 2 L yang mengandung medium sesuai perlakuan. Kultivasi dilakukan dalam erlenmeyer 2 L dengan pH
47
media 6, suhu 28±2 oC, intensitas cahaya 1300 lux, salinitas 31 %, dan dilakukan aerasi dengan mengalirkan udara ke dalam media. Proses kultivasi dilaksanakan sampai akhir fase log, dianalisis konsentrasi biomassa dan lipidanya. Penentuan jenis media terbaik didasarkan pada media yang menghasilkan konsentrasi biomassa dan lipida tertinggi. Media-media yang dipergunakan dalam penelitian ini adalah:
1) Medium Pertanian mengandung : ZA 160 g/L, Urea 240 g/L, TSP 80 g/L, FeCl 120 g/L, NaEDTA 120 g/L
2) Medium Allen-Miquel mengandung : Larutan A dan Larutan B. Larutan A mengandung : KNO3 20,2 g, aquadest 100 ml, Larutan B mengandung : Na2HPO4.12H2O 4 g, CaCl2.6H2O 4 g, FeCl3 2 g, HCl 2 ml, aquadest 80 ml
3) Komposisi medium standar walne adalah Solution A (1 ml/L kultur): Ferric chloride (FeCl3) 0,8 gram, Manganous Chloride (MnCl2,5H2O) 0,4 gram, Boric acid (H3BO3) 33,6 gram, EDTA, di-sodium salt 45,0 gram, Sodium di-hydrogen orthopHospHate (NaH2PO4,2H2O) 20,0 gram, Sodium nitrate (NaNO3) 100,0 gram, Solution B 1,0 ml (dilarutkan sampai 1 L dengan air laut). Solution B : Zinc chloride (ZnCl2) 2,1 gram, Cobaltous chloride (CoCl2,6H2O) 2,0 gram, Ammonium molybdate ((NH4)6Mo7O24, 4H2O) 0,9 gram, Cupric sulpHate (CuSO4,5H2O) 2,0 gram, Concentrated HCl 10,0 ml (dilarutkan sampai 100 ml dengan air laut). Solution C (0,1 ml/L kultur) : Vitamin B1
0,2 gram, Solution E 25,0 ml (dilarutkan sampai 200 ml dengan air laut). Solution E:
vitamin B12 0,1 g (dilarutkan sampai 250 ml dengan air laut).
4) Media guillard : NaH2PO4. 2H2O 5 g, NaNO3 42,1 g, Na2EDTA 5 g, Na2SiO3 25 g, MnCl2. H2O 0,18 g, FeCl3 1,45 g, Aquades 500 ml, trace elemen 0,5 ml. Trace elemen : CoCl2. 6H2O 1 g, (NH4)8Mo7O24. 4H2O 0,63 g, CUSO4. 7H2O 0,98 g, FeCl3. 6H2O 1,6 g, Aquades 100 ml (Jati et al., 2012). Komposisi vitamin terdiri dari Sol A : vitamin B1 0,2g/200 ml aquades hangat ditambah dengan 25 ml sol B. Sol B : vitamin B12 0,1 g/250 ml aquades hangat (BBPPBL Gondol, 2013).
5) Media blue green 11 terdiri dari : Na2EDTA10 g/100ml aquades; NaNO3 10g/100ml aquades, Na2CO3 10 g/100ml aquades; CaCl2.2H2O 10 g/100ml aquades; MgSO4.7H2O 10 g/100ml aquades; K2HPO4 10 g/100ml aquades; Fe(OH)3 10 g/100ml aquades; asam sitrat 10 g/100ml aquades. Trace element solution : H3BO3 2,86 g, MnCl2. 4H2O 1,81 g, ZnSO4. 7H2O 0,22 g, Na2MoO4. 2H2O 0,39 g, CuSO4. 5H2O 0,08 g, Co(NO3)2. 6H2O 0,05 g, di tambahkan aquades sampai menjadi 1000 ml (Kawaroe et al., 2010).
48 4.4.4. Produksi Lipid
a. Rancangan percobaan pengaruh nitrat dan posfat
Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap, yang terdiri atas 7 perlakuan yaitu :
K1 = konsentrasi nitrat 30 (g/l) dan konsentrasi fosfat 15 g/l K2 = konsentrasi nitrat 50 (g/l) dan konsentrasi fosfat 5 g/l K3 = konsentrasi nitrat 50 (g/l) dan konsentrasi fosfat 25 g/l K4 = konsentrasi nitrat 100 (g/l) dan konsentrasi fosfat 15 g/l K5 = konsentrasi nitrat 100 (g/l) dan konsentrasi fosfat 30 g/l K6 = konsentrasi nitrat 150 (g/l) dan konsentrasi fosfat 5 g/l K7 = konsentrasi nitrat 150 (g/l) dan konsentrasi fosfat 25 g/l
Percobaan diulang sebanyak dua kali sehingga diperoleh 14 unit percobaan. Data yang diperoleh dianalisis dengan sidik ragam, dan bila perlakuan berpengaruh nyata terhadap variabel yang diamati dilanjutkan dengan uji duncant.
b. Pelaksanaan penelitian pengaruh konsentrasi nitrat dan posfat dan parameter yang diamati
Penentuan faktor nutrisi dilaksanakan pada jenis medium dan waktu panen terpilih dengan memodifikasi senyawa nitrat (NO3) dan fosfat (PO4) dengan konsentrasi sesuai perlakuan. Kultivasi dilakukan dalam stoples plastik dengan volume 20 L dengan pH media 8,1, suhu 28±2 oC, intensitas cahaya 1,2 ±0,5 klux, salinitas 31 ppt, dan dilakukan aerasi dengan mengalirkan udara ke dalam media. Pengamatan terhadap parameter penelitian dilakukan pada akhir masa kultivasi (11 hari) terhadap konsentrasi lipid (metode soxhlet) dan berat kering biomassa sel. Hasil optimum produksi lipid pada konsentrasi nitrat dan posfat ini selanjutnya dipergunakan sebagai faktor tetap pada proses optimasi faktor lingkungan (pH dan salinitas) terhadap produksi lipid.
c. Rancangan percobaan pengaruh pH dan salinitas
Rancangan percobaan yang digunakan adalah Central Composite Design (CCD). Data yang dihasilkan dari rancangan percobaan tersebut akan dianalisis dengan menggunakan metode response surface. Metode response surface digunakan untuk melihat pengaruh perlakuan konsentrasi nitrat dan fosfat terhadap produksi lipid mikroalga. Data yang
49
diperoleh dianalisis dengan menggunakan program statistica 10. Bentuk dan kode perlakuan serta rancangan percobaan dengan sistem pengkodean dapat dilihat pada Tabel 4 dan Tabel 5.
d. Pelaksanaan penelitian optimasi pengaruh pH dan salinitas dan parameter yang diamati
Optimasi faktor lingkungan pH dan salinitas dilaksanakan pada jenis medium dengan konsentrasi nitrat dan posfat sesuai dengan hasil titik optimum sebelumnya. Kultivasi dilakukan dalam erlenmeyer 20 L dengan pH dan salinitas sesuai dengan perlakuan pada rancangan percobaan, suhu 28±2 oC, intensitas cahaya 1,2 ±0,5 klux dengan perbandingan terang dengan gelap 12:12 jam, dan dilakukan aerasi dengan mengalirkan udara ke dalam media. Pengamatan terhadap parameter penelitian dilakukan pada akhir masa kultivasi terhadap konsentrasi lipid (metode Bligh and dryer) dan berat kering biomassa sel. Hasil optimum produksi lipid pada pH dan salinitas ini ini selanjutnya dipergunakan sebagai untuk proses produksi dalam skala yang lebih besar.
Tabel 4. Perlakuan dan kode perlakuan
Perlakuan Kode perlakuan
-1,414 -1 0 1 1,414
Ph 4,59 5 6 7 7,41
Salinitas (ppt) 22,93 25 30 35 37,07
Tabel 5. Rancangan percobaan dengan sistem pengkodean
No Kode pH Kode salinitas pH Salinitas (ppt)
1 -1 -1 5 25
2 1 -1 7 25
3 -1 1 5 35
4 1 1 7 35
5 -1.414 0 4,59 30
6 1.414 0 7 30
7 0 -1.414 6 22,93
8 0 1.414 6 37,07
9 0 0 6 30
10 0 0 6 30
11 0 0 6 30
12 0 0 6 30
4.4.5. Ekstraksi Lipid dan Profil Asam Lemak
Mikroalga dikultivasi sesuai dengan jenis media, kondisi nutrisi dan lingkungan optimal serta waktu panen yang tepat. Biomassa yang dihasilkan dari proses kultivasi pada kondisi optimal, dipanen dan dikeringkan dengan menggunakan oven pada suhu 80oC.
setelah kering, biomassa diukur kadar airnya. Ekstrak asam lemak dilakukan dengan
50
mengambil 20 gr bubuk mikroalga diekstrak dengan 150 ml pelarut N-heksan dalam dengan metode soklet selama 7 jam (Kawaroe et al., 2012). Lemak yang dihasilkan dari proses ekstraksi ini kemudian di analisa profil asam-asam lemaknya dengan menggunakan GC dan GC-MS.
4.5. Luaran/Indikator capaian Penelitian Tahun I
Luaran penelitian tahun ke-1 adalah (1) diperoleh waktu panen yang tepat dengan konsentrasi biomassa tertinggi. (2) diperoleh jenis media yang tepat dalam memproduksi lipid tertinggi. (3) diperoleh kondisi optimum konsentrasi nitrat dan posfat dalam memproduksi lipid tertinggi. (4) diperoleh kondisi optimum kondisi pH dan salinitas dalam memproduksi lipid tertinggi. (5) diperoleh profil asam-asam lemak penyusun lipid. (6) diperoleh biomassa dan lipid potensial utk dikembangkan sebagai suplemen makanan. (7) pengajuan makalah untuk publikasi di jurnal nasional terakreditasi bertopik “optimasi produksi lipid dari mikroalga Nannochloropsis sp”.
4.6. Prosedur Analisa
Analisis yang meliputi konsentrasi biomasa, kadar air, kadar lemak, protein, profil lipid, dan protein adalah sebagai berikut
a. Analisa konsentrasi biomasa dengan metode Costa et al.,(2002). Biomassa diambil sebanyak 5 ml, dimasukkan ke dalam tabung falkon. Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 5 menit. Endapan biomassa yang dihasilkan dicuci dengan aquades, lalu disentrifugasi untuk memisahkan biomassa dan aquadesnya. Pencucian dilakukan sampai salinitas airnya 0 ppt. Endapan biomassa yang diperoleh selanjutnya dikeringkan dengan oven pada suhu 80 oC selama 24 jam. Setelah kering biomassa ditimbang.
b. Kadar air. Penetapan kadar air dilakukan dengan menggunakan metode oven (AOAC, 1998). Sampel ditimbang 0,5 g, dimasukkan ke dalam cawan oven, selanjutnya dikeringkan dalam oven pada suhu 105oC hingga berat konstan.
Kadar air (%) = (kehilangan berat sampel/ berat sampel) x 100
c. Kadar lemak. Penetapan kadar lemak Nannochloropsis sp. dengan perlakuan jenis media dan perlakuan kombinasi nitrat dan fosfat dilakukan dengan menggunakan metode ekstraksi soxhlet (Sudarmadji et al., 1984). Sebelum digunakan labu lemak dioven dan ditimbang terlebih dahulu. Sampel bubuk ditimbang 1 g. Sampel dibungkus dengan kertas
51
saring, dan diekstraksi soxhlet menggunakan pelarut heksan selama ± 6 jam. Labu lemak hasil ekstraksi dioven dan ditimbang sampai tercapai berat konstan.
Lemak (%) = (berat lemak/ berat sampel) x 100
d. Kadar lemak. Penetapan kadar lemak Nannochloropsis sp. pada perlakuan optimasi salinitas dan pH dilakukan dengan menggunakan metode Bligh Dyer (Pratomyot et al.,2005). Sampel sebanyak 0,2 g dilarutkan dengan 3,8 ml campuran kloroform : methanol dengan perbandingan 1:2, lalu divortex selama 10 menit. Ditambahkan kloroform sebanyak 1,3 ml dan divortex kembali selama 1 menit. Selanjutnya ditambahkan 1,3 ml aquades lalu divortex 1 menit, sehingga akan terbentuk 2 fase. Fase bagian bawah diambil dengan hati-hati dan letakkan pada botol timbang yang telah diketahui beratnya. Fase bagian atas (sisanya) ditambahkan 1,9 ml kloroform dan divortex selama 2 menit. Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 3500 rpm selama 5 menit sehingga akan terbentuk 2 fase lagi. Fase bawah mengandung pelet dan fase atas.
Fase bawah diambil dengan hati-hati supaya pellet tidak terambil, dimasukkan ke botol timbang sebelumnya. Uapkan pelarut dengan oven pada suhu 50 oC selama 2 jam. Lemak yang dihasilkan lalu ditimbang.
Total lipid = (W1-W0)/bks x 100%
W0 = berat akhir lemak (g); W1 = berat awal lemak+ pelarut (g); bks = berat kering sampel (g)
e. Penentuan profil asam lemak
Ekstrasi lipid. Total lipid yang diekstrasi dari 1 g sampel basah menurut metode Bligh dan Dyer (Pratomyot et al.,2005). Sampel dilarutkan dengan kloroform (mengandung BHT 0.1 ppm): methanol (mengandung BHT 0,1 ppm) dengan perbandingan 2:1, dicampur dan dikeringkan dengan gas nitrogen. Ester metil asam lemak yang dipreparasi dengan katalis asam transmetilasi total lipid (10 ml asam sulfur 2% dalam methanol yang dioven pada 800 C selama 4 jam). Penambahan 5 ml sodium klorida 5%, 5 ml heksan pada potasium bikarbonat 2% dan selanjutnya difiltrasi melalui sodium sulfat anhydrous dan dikeringkan dengan gas nitrogen (Cristies, 1982).
Analisis asam lemak (Pratomyot et al.,2005). Pemisahan dan identifikasi asam lemak menggunakan gas kromatografi dengan kolom kapiler (30 m x 0,25mm, ketebalan 0,25 µmol). Gas pembawa menggunakan helium pada 1,3 ml/menit. Sampel yang diijeksikan sebanyak 1 ml pada kondisi yang telah ditentukan. Kolom temperatur 120оC selama 0,5 menit, gradien panas 195о C pada kelajuan 18о C/menit, 195 sampai dengan 205оC pada
52
kelajuan 3 0C/menit, perbaikan 7 menit, 205 hingga 220 оC pada kelajuan 8 оC/menit.
Ester metil asam lemak yang diidentifikasi dengan membandingkan campuran standard dan kuantitatif adalah persentase luas total asam lemak.
4.7. Tahun II/Tahap II : Produksi Protein 4.7.1. Produksi Protein
Tahapan tahapan pada produksi protein secara umum sama dengan tahapan pada produksi lipid yaitu diawali dengan peremajaan kultur, propagasi sel mikroalga, optimasi faktor nutrisi dan lingkungan dan penentuan profil asam-asam amino. Perbedaan yang ada hanya pada respon parameter yang diamati.
a. Rancangan percobaan pengaruh nitrat dan posfat terhadap kadar protein
Rancangan percobaan yang digunakan adalah Central Composite Design (CCD). Data yang dihasilkan dari rancangan percobaan tersebut akan dianalisis dengan menggunakan metode response surface. Metode response surface digunakan untuk melihat pengaruh perlakuan konsentrasi nitrat dan fosfat terhadap produksi lipid mikroalga. Data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan program statistica 10. Bentuk dan kode perlakuan serta rancangan percobaan dengan sistem pengkodean sama halnya dengan perlakuan pada produksi lipid, hanya saja respon yang diamati adalah kadar protein. Perlakuan dapat dilihat pada Tabel 2 dan Tabel 3.
b. Pelaksanaan penelitian optimasi pengaruh nitrat dan posfat dan parameter yang diamati
Optimasi faktor nutrisi dilaksanakan pada jenis medium dan waktu panen terpilih dengan memodifikasi senyawa nitrat (NO3) dan fosfat (PO4) dengan konsentrasi sesuai perlakuan. Kultivasi dilakukan dalam erlenmeyer 2 L dengan pH media 6, suhu 28±2 oC, intensitas cahaya 1,2 ±0,5 klux dengan perbandingan terang dengan gelap 12:12 jam, salinitas 30 ppt, dan dilakukan aerasi dengan mengalirkan udara ke dalam media. Pengamatan terhadap parameter penelitian dilakukan pada akhir masa kultivasi terhadap konsentrasi protein dan berat kering biomassa sel. Hasil optimum produksi protein pada konsentrasi nitrat dan posfat ini selanjutnya dipergunakan sebagai faktor tetap pada proses optimasi faktor lingkungan (pH dan salinitas) terhadap produksi protein.
c. Rancangan percobaan pengaruh pH dan salinitas terhadap kadar protein
Rancangan percobaan yang digunakan adalah Central Composite Design (CCD). Data yang dihasilkan dari rancangan percobaan tersebut akan dianalisis dengan menggunakan metode response surface. Metode response surface digunakan untuk melihat pengaruh perlakuan konsentrasi nitrat dan fosfat terhadap produksi protein mikroalga. Data yang
53
diperoleh dianalisis dengan menggunakan program statistica 10. Bentuk dan kode perlakuan serta rancangan percobaan dengan sistem pengkodean dapat dilihat pada Tabel 4 dan Tabel 5.
d. Pelaksanaan penelitian optimasi pengaruh pH dan salinitas dan parameter yang diamati
Optimasi faktor lingkungan pH dan salinitas dilaksanakan pada jenis medium dengan konsentrasi nitrat dan posfat sesuai dengan hasil titik optimum sebelumnya. Kultivasi dilakukan dalam erlenmeyer 2 L dengan pH dan salinitas sesuai dengan perlakuan pada rancangan percobaan, suhu 28±2 oC, intensitas cahaya 1,2 ±0,5 klux dengan perbandingan terang dengan gelap 12:12 jam, dan dilakukan aerasi dengan mengalirkan udara ke dalam media. Pengamatan terhadap parameter penelitian dilakukan pada akhir masa kultivasi terhadap konsentrasi protein dan berat kering biomassa sel. Hasil optimum produksi lipid pada pH dan salinitas ini ini selanjutnya dipergunakan sebagai untuk proses produksi dalam skala yang lebih besar.
4.7.2. Ekstraksi dan penentuan profil protein
Mikroalga dikultivasi sesuai dengan jenis media, kondisi nutrisi dan lingkungan optimal serta waktu panen yang tepat. Biomassa yang dihasilkan dari proses kultivasi pada kondisi optimal, dipanen dan dikeringkan dengan menggunakan oven pada suhu 80oC.
setelah kering, biomassa diukur kadar airnya. Sampel biomassa sel mikroalga kemudian dihomogenisasi dengan buffer (50Mm Tris-HCL, PH 7.8, 0.25M sucrose, 25 Mm KCl, 10Mm MgCl2, 1Mm pHenylmethylsulfonylfluoride, 0.1Mm EDTA, 0.1Mm b- mercaptoethanol dan 0.5% (v/v) Triton-100 dan protein diendapkan dengan ditambahkan 20% (v/v) trichloroacetic acid (TCA). Selanjutnya disentrifugasi untuk memperoleh protein, dilakukan pencucian dengan etanol 90% dalam 20 Mm Tris (pH 7.4). Protein yang dihasilkan dari proses ekstraksi ini kemudian di analisa profil asam-asam lemaknya SDS- PAGE ((Boolag dan Edelstein, 1991)
4.8. Prosedur Analisa
Analisis yang meliputi konsentrasi biomasa, kadar air, kadar lemak, protein, profil lipid, dan protein adalah sebagai berikut
a. Analisa konsentrasi biomasa dengan metode Costa et al.,(2002). Kurva standart konsentrasi biomasa mikroalga (g/l) dibuat dengan menghitung kepadatan sel dengan menggunakan hemacytometer dan diplotkan terhadap berat kering mikroalga (g/l). Kurva standart yang diperoleh digunakan untuk menghitung konsentrasi biomasa sample.
Jumlah kepadatan sel = rata-rata jumlah sel X 25.104
54
b. Kadar air. Penetapan kadar air dilakukan dengan menggunakan metode oven (AOAC, 1998). Sampel ditimbang 0,5 g, dimasukkan ke dalam cawan oven, selanjutnya dikeringkan dalam oven pada suhu 105oC hingga berat konstan.
Kadar air (%) = (kehilangan berat sampel/ berat sampel) x 100
c. Analisis konsentrasi protein (Boolag dan Edelstein, 1991). Sebanyak 10 µL sample larutan protein diencerkan dengan menggunakan buffer fosfat 0,2 M, pH 7,0 hingga volume 100 µL kemudian ditambah dengan reagen Bradford. Larutan dihomogenkan dan diistirahatkan selama 5 menit. Pengukuran dilakukan dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm. Kurva standar dibuat dengan memipet sebanyak 5, 10, 15, 20, dan 25 µL larutan BSA (bovine serum albumin). Blanko yang digunakan adalah air destilata.
d. Penentuan profil protein dengan SDS-PAGE (Boolag dan Edelstein, 1991). Gel yang digunakan untuk elektroforesis terdiri dari gel penahan (stacking gel) dengan konsentrasi 4% dan gel pemisah (separation gel) dengan konsentrasi 12,5%. Sebelum elektroforesis, sample didenaturasi dengan menggunakan SDS dan merkaptoetano disertai dengan pemanasan. Pembebanan sample dilakukan pada konsentrasi protein yang sama untuk setiap fraksi protein. Jumlah volume maksimum sample protein untuk pembebanan adalah 25 µL. elektroforesis dilakukan pada tegangan 100 volt dan arus listrik 80 mA selama 2,5 jam. Setelah selesai, gel diwarnai dengan menggunakan pewarnaan perak (AgNO3)
4.9. Luaran/Indikator capaian Penelitian Tahun II
Luaran penelitian tahun ke-2 adalah (1) diperoleh kondisi optimum konsentrasi nitrat dan posfat dalam memproduksi protein yang tinggi. (2) diperoleh kondisi optimum kondisi pH dan Salinitas dalam memproduksi protein yang tinggi. (3) diperoleh profil asam-asam amino penyusun protein. (4) diperoleh protein sel tungggal potensial untuk dikembangkan sebagai suplemen makanan. (5) pengajuan makalah untuk publikasi di jurnal nasional terakreditasi ( Jurnal Patpi) bertopik “optimasi produksi protein dari mikroalga Nannochloropsis sp”.
55
BAB V. HASIL DAN PEMBAHASAN
5.1. PERTUMBUHAN MIKROALGA Nannochloropsis sp.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa pertumbuhan mikroalga Nannochloropsis sp.
berbeda-beda pada jenis media yang berbeda. Kurva pertumbuhan mikroalga Nannochloropsis sp.disajikan pada Gambar 3.
Gambar 3. Kurva pertumbuhan Nannochloropsis sp.pada berbagai jenis media Gambar 3 menunjukkan bahwa konsentrasi biomassa kering bervariasi pada setiap jenis media. Pada hari ke nol (0) sampai 5 hari inkubasi, sel Nannochloropsis sp yang dikultivasi pada jenis media yang berbeda masih mengalami fase adaptasi. Jenis media yang sesuai dengan media tumbuh akan dapat mempercepat proses adaptasi sehingga mikroalga dapat tumbuh dengan cepat (Andersen, 2005). Setelah hari ke – 5 inkubasi, sel mengalami fase eksponensial. Perbedaan jenis media mengakibatkan akhir fase eksponensial dicapai pada hari yang berbeda. Pada media walne, akhir fase eksponensial tercapai setelah waktu inkubasi 10 hari. Pada media Pertanian, akhir fase eksponensial tercapai setelah waktu inkubasi 8 hari. Akhir fase eksponensial tercapai
0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 0,1
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Walne Pertanian Allen-Miquel BG-11 Guillard
Waktu Inkubasi (hari) B
i o m a s s a (g)
56
pada hari ke 11 inkubasi jika sel Nannochloropsis sp. dikultivasi pada media guillard.
Pada media Blue Green 11 (BG 11) dan pada media Allen- Miquel (MQ), akhir fase eksponensial tercapai setelah waktu inkubasi 12 hari. Hal ini sedikit berbeda dengan penelitian Widyaningsih et al., (2011) yang menyatakan bahwa pada media walne puncak pertumbuhan Nannochloropsis sp. terjadi pada hari ke – 9 inkubasi. Namun penelitian ini sejalan dengan Sukmawan (2012) yang menyatakan bahwa pertumbuhan optimum Nannochloropsis sp. dicapai pada hari ke – 10 inkubasi.
Menurut Isnanstyo dan Kurniastuty (1995) dan Kawaroe et al., (2010), akhir fase eksponensial merupakan waktu terbaik untuk pemanenan sel mikroalga karena pada fase eksponensial struktur sel masih berada pada kondisi normal dan secara nutrisi terjadi keseimbangan antara nutrien dalam media dan nutrisi dalam sel. Selain itu, pada fase eksponensial kandungan nutrisi dalam sel sangat tinggi, sehingga mikroalga berada pada kondisi yang paling optimum.
5.2. Produksi Biomassa Nannochloropsis sp.
Produksi biomassa Nannochloropsis sp dilakukan dengan mengkultivasi Nannochloropsis sp pada 5 jenis media (sesuai perlakuan) dengan volume kultur 15 L.
Sel Nannochloropsis sp selanjutnya dipanen pada akhir fase log. Penentuan waktu panen (akhir fase log) berdasarkan pada Gambar 3. Waktu panen Nannochloropsis sp. yang dikultivasi pada media walne, media pertanian, dan media guillard berturut-turut adalah hari ke 10, 8, dan 11 inkubasi. Pada media Allen Miquel dan media Blue Green 11, waktu panen Nannochloropsis sp. adalah hari ke 12 inkubasi. Data biomassa Nannochloropsis sp disajikan pada Tabel 6.
Tabel 6. Biomassa Nannochloropsis sp. pada berbagai media
Jenis Media Waktu Panen (Hari) Konsentrasi Biomassa (g/L)
Walne 10 0,27a
Pertanian 8 0,19b
Allen - Miquel 12 0,17c
Blue Green - 11 12 0,19b
Guillard 11 0,26a
Keterangan : Huruf yang berbeda dibelakang nilai rata-rata menunjukkan perbedaan yang nyata (P<0,05).
57
Tabel 6 menunjukkan bahwa mikroalga Nannochloropsis sp. yang dikultivasi pada media walne memiliki konsentrasi biomassa 0,27 g/l dan tidak berbeda nyata dengan konsentrasi biomassa mikroalga Nannochloropsis sp. yang dikultivasi pada media guillard (0,26 g/l). Konsentrasi biomassa mikroalga erat kaitannya dengan kandungan nutrien yang ada di dalam media. Media Walne diketahui memiliki kandungan N dan P yang lebih tinggi dibandingkan dengan media yang lain sehingga konsentrasi biomassanya menjadi tinggi.
Pada media Walne unsur-unsur Fe, Mn, Cl, dan Zn lebih banyak tersedia dari pada media yang lainnya. Unsur-unsur tersebut digunakan untuk proses fotosintesis, dimana hasilnya digunakan untuk pertumbuhan (Fogg, 1965). Peranan unsur hara mikronutrien dalam laju pertumbuhan sangat besar, yaitu bersama-sama makro nutrien melakukan proses respirasi dan metabolisme (Chilmawati dan Suminto, 2010).
5.3. Kadar lemak Nannochloropsis sp.
Hasil analisis ragam menunjukan bahwa perlakuan jenis media berpengaruh sangat nyata (P<0,01) terhadap kadar lemak mikroalga Nannochloropsis sp. Hasil analisis kadar lemak mikroalga Nannochloropsis sp. dengan perlakuan jenis media dapat dilihat pada Tabel 7.
Tabel 7. Kadar Lemak (% bk) Nannochloropsis sp. yang Dikultur pada Berbagai Jenis Media.
Jenis Media Waktu Panen (Hari) Kadar lemak (%bk
Walne 10 4,56b
Pertanian 8 7,16d
Allen - Miquel 12 4,90c
Blue Green - 11 12 9,83a
Guillard 11 10,00a
Keterangan : Huruf yang berbeda dibelakang nilai rata-rata menunjukkan perbedaan yang nyata (P<0,05).
58
Tabel 8 menunjukkan bahwa kadar lemak mikroalga Nannochloropsis sp. berkisar antara 4,56 %bk sampai 10,00 %bk. Kadar lemak mikroalga Nannochloropsis sp. yang dikultur pada media Guillard sebesar 10,03 %bk, tidak berbeda nyata dengan kadar lemak Nannochlorpsis sp. yang dikultur pada media Blue Green (BG-11) sebesar 9,83%
(bk), namun berbeda nyata dengan perlakuan lainnya. Hal ini sejalan dengan penelitian Jati et al., (2012) yang menyatakan bahwa Chaetoceros gracilis yang dikultivasi pada media Guillard memiliki kandungan asam lemak omega 3 EPA lebih tinggi (8,16%) dibandingkan pada media Walne (6,59%). Penelitian ini tidak sama dengan penelitian Sari et al., (2012), yang menyatakan bahwa Nannochloropsis oculata yang dikultivasi pada media Allen-Miquel memiliki kandungan lemak yang lebih tinggi (45%) dibandingkan dengan Nannochloropsis oculata yang dikultivasi pada media Guillard (31%). Wijoseno (2011) melaporkan bahwa Chlorella vulgaris diketahui memiliki kadar lemak tertinggi jika dikultivasi pada media Walne yaitu sebesar 42,58%, pada media Blue Green (BG-11) yaitu 40,58%, dan media Beneck yaitu 37%. Menurut Hu dan Gao (2006) bahwa semakin rendah konsentrasi nitrat dalam bentuk NaNO3 dan fosfat dari NaH2PO4 maka kandungan lemak total pada Nannochloropsis sp. semakin besar dan dapat mencapai ± 2,8%. Pada media Guillard yang digunakan dalam penelitian ini ketersediaan unsur nitrat dan fosfat dalam bentuk NaNO3 dan NaH2PO4 lebih sedikit daripada ketersediaan unsur nitrat dan fosfat pada media yang lain sehingga kadar lemak Nannochloropsis sp. yang dikultur dengan menggunakan media Guillard menjadi tinggi.
Griffiths dan Harrison (2009) mengatakan bahwa pada kondisi media dengan nutrien N tercukupi, Nannochloropsis sp. memiliki kandungan lemak total berkisar 27-31% dan sebaliknya pada kondisi keterbatasan nutrien N, Nannochloropsis sp. menghasilkan kandungan lemak total sebesar 35-46%. Pada media Blue Green (BG-11) memiliki kandungan Mg dalam bentuk MgSO4.7H2O yang berperan dalam pembentukan lemak, sehingga kandungan lemak pada media Blue Green (BG-11) menjadi tinggi (Wijoseno,
59
2011). Tingginya kadar lipid diduga disebabkan oleh kondisi kultur yang stress akibat surplus Mg2+. Kadar lipid yang tinggi pada mikroalga biasanya diperoleh pada kondisi stress yang terjadi bersamaan dengan penurunan laju perkembangbiakan sel Perez-Pazos (2011).
Media walne menghasilkan kadar lemak paling sedikit dibandingkan dengan media lainnya, karena konsentrasi nitrogen dan fosfat pada media walne yang digunakan dalam penelitian ini lebih banyak daripada media Guillard, Allen-Miquel, dan Pertanian.
Peningkatan NaNO3 dan KH2PO4 pada media kultur akan meningkatkan kandungan protein dan polyunsaturated fatty acids (PUFAs) Nannochloropsis, tetapi akan menurunkan kandungan karbohidrat, lemak total dan Total Fatty Acids (Hu dan Gao, 2006).
5.4. Optimasi Nitrat dan Fosfat terhadap Konsentrasi Biomassa Nannochloropsis sp.
Optimasi dilakukan untuk menentukan titik optimum nitrat dan fosfat dalam menghasilkan konsentrasi biomassa mikroalga Nannochloropsis sp. tertinggi.
Konsentrasi biomassa mikroalga Nannochloropsis sp dengan perlakuan nitrat dan fosfat disajikan pada Tabel 8.
Tabel 8. Konsentrasi biomassa mikroalga Nannochloropsis sp dengan perlakuan nitrat dan fosfat
Unit Nitrat (g/l) Fosfat (g/l) Konsentrasi
biomassa (g/l)
1 50 5 0,419
2 150 5 0,689
3 50 25 0,226
4 150 25 0,595
5 29,3 15 0,186
6 170,7 15 0,723
7 100 0,86 0,477
8 100 29,14 0,588
9 100 15 0,566
10 100 15 0,540
11 100 15 0,569
12 100 15 0,587
60
Berdasarkan hasil analisis diperoleh model persamaan regresi sebagai berikut : Z = - 0,377 + 0,074X -0,0002 X2 - 0,008Y -0,002 Y2 + 0,0005 XY + 0, dengan koefisien determinasi (r2) = 0,91 yang artinya bahwa konsentrasi nitrat dan fosfat pada media guillard memiliki pengaruh sebesar 91 % terhadap konsentrasi biomassa mikroalga Nannochloropsis sp. Sisanya sebanyak 9 % dipengaruhi oleh faktor lainnya antara lain intensitas cahaya dan suhu.
Hasil analisis juga menunjukkan bahwa perlakuan nitrat dan fosfat pada media guillard terhadap konsentrasi biomassa Nannochloropsis sp. berada pada kondisi optimum pada konsentrasi nitrat 181,55 g/l dan konsentrasi fosfat 21,24 g/l dengan konsentrasi biomassa sebesar 0,7 g/l. Pertumbuhan mikroalga dipengaruhi oleh berbagai faktor. Salah satu faktor tersebut adalah salinitas. Salinitas mempengaruhi metabolisme di dalam sel. Salinitas berpengaruh terhadap tekanan osmosis dan mekanisme osmoregulasi yang secara langsung dapat mempengaruhi respirasi sel, metabolisme dan pembiakan sel vegetatif yang tentunya akan mempengaruhi kepadatan sel mikroalga (Vasques-Duhalt et al., 1991). Tingginya salinitas dapat menyebabkan keluarnya air dari dalam sel sehingga menghambat reaksi fotosintesis, yang merupakan metabolisme penting bagi mikroalga. Terhambatnya fotosintesis menyebabkan glukosa yang tebentuk juga sedikit, padahal glukosa dibutuhkan untuk metabolisme sel termasuk untuk sintesis klorofil dan perkembangbiakan sel. Terhambatnya sintesis klorofil dan perkembangbiakan sel menyebabkan konsentrasi sel menurun.
Faktor lain yang juga mempengaruhi pertumbuhan mikroalga adalah derajat keasamaan (pH). Derajat keasamaan (pH) akan mempengaruhi tingkat fotosintesis mikroalga (Supramaniam et al., 2012), dan kerja enzim dalam proses metabolisme sel (Isnadina et al., 2013). Pada pH tinggi kerja enzim akan tidak optimal sehingga reaksi metabolisme sl tidak berlangsung dengan baik, yang mengakibatkan pertumbuhannya terganggu, sehingga konsentrasi sel akan menurun.
61
Gambar respon permukaan dan counter plot dari konsentrasi biomassa Nonnochloropsis sp. disajikan pada Gambar 3 dan 4. Perubahan warna pada grafik dan counter plot menunjukkan adanya perbedaan kadar lemak dengan perlakuan kombinasi nitrat dan fosfat yang berbeda. Warna merah tua pada grafik dan counter plot menunjukkan kadar lemak lebih tinggi dari 0,7 g/l, sedangkan warna hijau tua menunjukkan kadar lemak kurang dari -0,05 g/l.
Gambar 3. Grafik respon permukaan konsentrasi biomassa Nannochloropsis sp.
perlakuan optimasi konsentrasi nitrat dan fosfat
Gambar 4. Counter plot konsentrasi biomassa Nannochloropsis sp. Pada perlakuan optimasi konsentrasi nitrat dan fosfat
