Metode sterilisasi alat yang digunakan pada saat praktikum terdiri dari dua metode yaitu Sterilisasi Uap menggunakan autoklaf dan Sterilisasi Panas Kering menggunakan Oven. Alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah Batang Pengaduk, Gelas Beaker, Botol Aquades, Botol Spray, Cawan Petri, Erlenmeyer, Gelas Ukur, Inkubator Suhu 35 ± 2°C dan 25 ± 2°C, Jamm Ose, Kompor Gas, Batter Tester , Lampu bunsen, lemari es yang dilengkapi freezer, mikropipet, autoklaf, oven, bagian logam/kaca, pinset, rak tabung reaksi, tabung Durham, tabung reaksi, timbangan digital. Alat dan bahan yang harus selalu dibawa dalam setiap percobaan adalah alumunium foil, gunting, hektor, kain kasa steril, kapas, kertas label, kertas roti, korek api, pipet karet merah, pulpen, sabun/cairan antiseptik, selotip, serbet. /tisu tangan, spuit, tali (bola benang), tisu gulung, tisu lensa (percobaan pewarnaan gram dan pemeriksaan jamur), tisu basah (disinfektan) dan sejenisnya.
Alat yang disterilkan antara lain batang pengaduk, gelas kimia, botol aquades, botol spray, cawan petri, erlenmeyer, gelas ukur, jarum tabung, labu takar, mikropipet, stock logam/kaca, pinset, pipet penetes, tabung durham, tabung reaksi. Cara sterilisasi dan pembuatan media mikrobiologi diambil dari prosedur literatur atau pada label kemasan media yang digunakan, karena setiap pabrik yang memproduksi media mikrobiologi mempunyai formula tersendiri yang harus dipatuhi oleh setiap peneliti atau pengguna media mikrobiologi. Proses sterilisasi uap menggunakan autoklaf untuk media mikrobiologi dan pengencer, kecuali ditentukan lain, biasanya memakan waktu 15 menit pada suhu 121°C.
Alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah Batang Pengaduk, Gelas Beaker, Botol Aquades, Botol Spray, Erlenmeyer, Gelas Ukur, Kompor Gas, Lampu Bunsen, Kulkas yang dilengkapi Freezer, Autoklaf, Rak Tabung Reaksi, Tabung Reaksi, Timbangan Digital. Bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah aquades steril, etanol 70%, semua media yang digunakan pada saat praktikum, spiritus KOH.
Pemindahan dengan dengan pipet
Ruangan tempat penanaman bakteri harus bersih dan kondisinya harus steril, sehingga tidak terjadi kesalahan dalam pengamatan atau percobaan di laboratorium produksi serum vaksin, dll.
Pemindahan dengan kawat inokulasi
Metode tebar
Metode tusuk
Inkubasi sampel tidak boleh terbalik karena jamur/ragi akan tumbuh dan mempunyai spora yang terus berkembang dan berkembang biak. Jika posisi cawan dibalik maka spora jamur akan menyebar dan tumbuh di seluruh media agar, sehingga jumlah koloni jamur yang tumbuh akan lebih banyak dari total koloni sebenarnya, hal ini dapat menyebabkan kesalahan dalam penghitungan koloni jamur/ragi. . Jumlah organisme yang ada dalam sampel asli ditentukan dengan mengalikan jumlah koloni yang terbentuk dengan faktor pengenceran pada cawan yang sesuai. Pertumbuhan koloni bakteri dan jamur aerobik mesofilik setelah inokulasi sampel pada kultur agar plate dengan cara penuangan dan inkubasi pada suhu yang sesuai.
Jika terdapat cawan dari dua tingkat pengenceran berturut-turut yang menunjukkan jumlah koloni 30 – 300, hitung jumlah koloni dari setiap tingkat pengenceran lalu kalikan dengan faktor pengenceran. Apabila hasil perhitungan tingkat yang lebih tinggi menunjukkan rata-rata jumlah koloni lebih besar dari dua kali rata-rata jumlah koloni dari pengenceran di bawahnya, maka jumlah pelat total dipilih dari tingkat pengenceran yang lebih rendah (misalnya pada pengenceran 10 -2 the rata-rata jumlah koloni 140, pada pengenceran 10-3 rata-rata jumlah koloni adalah 32, sehingga dipilih jumlah koloni 140 x 102). Apabila hasil perhitungan pada tingkat pengenceran lebih tinggi menunjukkan rata-rata jumlah koloni kurang dari dua kali rata-rata jumlah koloni pada pengenceran lebih rendah, maka jumlah pelat total dihitung berdasarkan rata-rata jumlah koloni pada kedua tingkat pengenceran.
Apabila pada seluruh cawan menunjukkan jumlah koloni lebih dari 300, cawan dengan tingkat pengenceran tertinggi dipilih kemudian dibagi menjadi beberapa sektor (2,4 atau 8) dan dihitung jumlah koloni dari satu sektor, maka jumlah cawan keseluruhan adalah jumlah koloni dikalikan jumlah sektor, kemudian dihitung rata-rata kedua cawan tersebut dan dikalikan dengan faktor pengenceran. Jika jumlah rata-rata koloni pada ¼ cawan lebih besar dari 200, maka dilaporkan jumlah cawan total lebih besar dari 200 x 8 dikalikan dengan faktor pengenceran. Uji konfirmasi e.coli dilanjutkan dengan media ECB (E.Coli Broth) dan diinkubasi pada suhu optimal yaitu 44°C.
Homogenkan dengan menggunakan bellyer selama 30 detik, kemudian dipipet 10 ml ke dalam LB 90 ml, inkubasi pada suhu 35-37°C selama 18-24 jam. Dengan menggunakan metode aseptik, masing-masing kultur pra-pengayaan sebanyak 10 ml dipipet ke dalam 100 ml media TBGB dan 100 ml SCB. Seluruh tabung inokulasi dikocok hingga homogen, kemudian diinkubasi pada suhu 35-37 0c selama 48 jam dan diamati pertumbuhan bakteri pada setiap tabung.
Dalam 2 tabung FTM, inokulasi 0,1 ml suspensi spora Bacillus Substylis ATCC hidup per ml), di 2 tabung FTM lainnya 0,1 ml suspensi Clostridium Sporagenes NIHJ (1000 sel hidup per ml). Pengujian ini dilakukan bersamaan dengan uji sterilitas sampel tabung berisi FTM, diinkubasi pada suhu 35 0-370 c dan suhu yang sama 20-250 c selama minimal 7 hari. TSB menginokulasi 1 ml sampel ke semua tabung. Dalam 2 tabung FTM masing-masing diinokulasi 0,1 ml suspensi spora hidup Bascillus Susbtilis ATCC per ml), di 2 tabung FTM lainnya 0,1 ml suspensi Clostridium Sporagenes NIHJ (1000 sel hidup per ml) dalam 2 tabung TSB, masing-masing diinokulasi 0,1 ml Suspensi Candida Albicans NIHJ (1000 sel hidup per ml).
Uji Sterilitas Media: 2 tabung berisi masing-masing media FTM 15 ml dan media pool 15 ml. Peralatan gelas disterilkan dalam oven bersuhu 170ºC selama 1-2 jam dan jenis kaca lainnya disterilkan dalam autoclave bersuhu 121ºC selama 15 menit, jarum gelas dibakar dengan lampu spiritus. Pada media padat, stock ring dari logam/kaca atau kertas diunggulkan (merendam kertas selama 30 menit pada setiap konsentrasi uji), kemudian masing-masing larutan obat ditambahkan pada masing-masing stock sebagai konsentrasi dan larutan blanko (DMSO atau etanol). kemudian diinkubasi pada suhu 36-37ºC selama 18-24 jam untuk bakteri dan 22-25ºC selama 36-48 jam untuk jamur.
Beberapa koloni E.coli dan S.aureus diambil dari kultur agar yang diinkubasi selama 24 jam.
