A
A A
Bahasa Indonesia:
Karang Barcenilla
Mercedes Lopez
Paul D. Cotter meninggal dunia
Bahasa Indonesia:
Bahasa Indonesia:
"
Bahasa Indonesia:
Bahasa Indonesia:
, Miguel Prieto dan Enriqueta Garcia-Gutierrez c,d
Montserrat Gonz´ alez-Raurich a,e
José F. Cobo-Diaz
"
Bahasa Indonesia:
Bahasa Indonesia:
Bahasa Indonesia:
Bahasa Indonesia:
Avelino Alvarez Ord
Alba Puente Paula M.
O'Connor tgl. 11
Elena-Alexandra Alexa a,b
o'nez ˜ a,e,*
sebuah,e
Departemen Biosains Pangan, Pusat Penelitian Pangan Teagasc, Moorepark, Fermoy, Irlandia B
A
Bahasa Inggris:
C
Jurnal Internasional Mikrobiologi Pangan
Pemilihan bakteri asam laktat sebagai agen biopreservasi dan optimalisasi cara penerapannya untuk pengendalian Listeria monocytogenes pada produk daging matang siap saji
beranda jurnal:
www.elsevier.com/locate/ijfoodmicroDaftar isi tersedia di
ScienceDirectSingkatan: NC, kontrol negatif yang tidak diinokulasi; PC, kontrol positif, hanya diinokulasi dengan L. monocytogenes; LAB, sampel yang hanya diinokulasi dengan bakteri asam laktat; V, sampel yang dikemas dalam vakum; MAP, sampel yang dikemas dalam pengemasan atmosfer termodifikasi; HPP, sampel yang dikemas dalam vakum dan diolah dengan pemrosesan tekanan tinggi.
* Penulis yang bersangkutan di: Departemen Higiene dan Teknologi Pangan, Fakultas Kedokteran Hewan, Universidad de Leon, Spanyol. Leon,
"
Untuk memenuhi permintaan konsumen terhadap makanan yang lebih alami dan menemukan metode baru untuk mengendalikan penyakit bawaan makanan,
Secara keseluruhan, studi ini menunjukkan aktivitas antilisterial yang menguntungkan dari koktail LAB yang digunakan, dengan kombinasi HPP dan LAB mencapai penghambatan lengkap terhadap patogen tanpa efek merugikan dalam evaluasi fisiko-kimia atau sensorik, menyoroti kegunaan pendekatan biopreservasi yang melibatkan LAB untuk meningkatkan keamanan produk daging yang dimasak.
patogen di dalamnya, penelitian saat ini difokuskan pada pendekatan pengawetan alternatif, seperti biopreservasi dengan bakteri asam laktat (BAL).
Di sini, kumpulan isolat bakteri asam laktat (BAL) dikarakterisasi untuk mengidentifikasi agen biopreservatif yang potensial. Enam isolat (satu Lactococcus lactis, satu Lacticaseibacillus paracasei dan empat Lactiplantibacillus plantarum) dipilih berdasarkan aktivitas antimikroba mereka dalam uji in vitro. Pengurutan genom keseluruhan menunjukkan bahwa tidak satu pun dari enam isolat BAL membawa faktor virulensi yang diketahui atau memperoleh gen resistensi antimikroba, dan bahwa isolat L. lactis berpotensi menjadi penghasil nisin Z. Pertumbuhan L. monocytogenes berhasil dibatasi oleh L. lactis ULE383, L. paracasei ULE721 dan L. plantarum ULE1599 sepanjang masa simpan ham matang, daging cincang dan daging babi panggang. Isolat LAB ini juga diaplikasikan secara individual atau sebagai koktail pada konsentrasi inokulum yang berbeda (4, 6 dan 8 log10 CFU/g) dalam studi uji tantangan yang melibatkan ham yang dimasak, menunjukkan aktivitas anti-Listerial yang lebih kuat ketika koktail digunakan pada 8 log10 CFU/g. Dengan demikian, pengurangan hingga ~5,0 log10 CFU/g dalam potensi pertumbuhan L. monocytogenes dicapai dalam ham yang dimasak yang dikemas dalam vakum, pengemasan atmosfer yang dimodifikasi atau vakum diikuti oleh pemrosesan tekanan tinggi (HPP). Hanya perubahan kecil dalam warna dan tekstur yang diinduksi, meskipun ada pengasaman yang signifikan dari produk ketika kultur LAB diaplikasikan. Hebatnya, pengasaman ini tertunda ketika HPP diaplikasikan pada batch yang diinokulasi LAB. Analisis metataksonomi menunjukkan bahwa koktail LAB mampu tumbuh dalam ham yang dimasak dan mengalahkan mikrobiota asli, termasuk mikroorganisme pembusuk seperti Bro-chothrix. Selain itu, tidak ada batch yang dianggap tidak dapat diterima dalam evaluasi sensoris.
"
Alamat email: [email protected] (A. Alvarez-Ordéo)
0168-1605/© 2023 Penulis. Diterbitkan oleh Elsevier BV Ini adalah artikel akses terbuka di bawah lisensi CC BY-NC (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/ ).
"
https://doi.org/10.1016/j.ijfoodmicro.2023.110341 Diterima 27 April
2023; Diterima dalam bentuk revisi 19 Juli 2023; Disetujui 24 Juli 2023 Tersedia daring 28 Juli 2023 Kata kunci:
Budaya makanan Patogen Nisin
APC Microbiome Ireland, Cork, Irlandia
Institut Ilmu dan Teknologi Pangan, Universidad de Leon, ´ Le´ on, Spanyol
Departemen Keamanan Pangan, Pusat Penelitian Pangan Teagasc, Ashtown, Dublin, Irlandia Departemen Higiene dan Teknologi Pangan, Universidad de Leon, ´ Le´ on, Spanyol
RNA-16S Antimikroba alami Pemrosesan tekanan tinggi
INFORMASI ARTIKEL ABSTRAK
Gambar skema yang menunjukkan alur kerja lengkap ditunjukkan pada Gambar 1.
"""
Wabah penyakit bawaan makanan yang disebabkan oleh konsumsi daging dan produk daging yang terkontaminasi terjadi berulang kali, dengan dampak negatif yang signifikan bagi kesehatan masyarakat dan operator bisnis makanan (Omer et al., 2018). Bakteri yang bertanggung jawab atas lima penyakit zoonosis yang paling sering terjadi terkait dengan konsumsi makanan adalah Campylobacter jejuni/ coli, Salmonella enterica, Escherichia coli penghasil toksin Shiga , Yersinia enterocolitica, dan Listeria monocytogenes, yang umumnya terkait dengan konsumsi daging dan produk daging. Di antara patogen bawaan makanan ini, L. monocytogenes merupakan penyebab utama yang perlu diperhatikan karena memiliki tingkat kematian tertinggi (13,7% di Eropa) (EFSA dan ECDC, 2022).
Patogen ini dapat menjadi masalah keamanan hayati, karena sering diisolasi dari permukaan kontak makanan seperti meja, baki, pisau, ban berjalan, pemotong, dan permukaan industri lainnya, yang menunjukkan kemampuannya untuk menempel, berkoloni, dan bertahan hidup di lingkungan pemrosesan dalam keadaan biofilm (Alvarez- Molina et al., 2021; Bolocan et al., 2015). Selain itu, beberapa galur L. monocytogenes menunjukkan toleransi terhadap berbagai kondisi lingkungan buruk yang berlaku di sepanjang rantai makanan, seperti suhu pendinginan, disinfektan, atau asam, yang merupakan strategi pengendalian umum (Hingston et al., 2017).
Konfirmasi identitas dugaan yang mengandalkan profil protein mereka diperoleh dengan Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS, model Microflex LT, Bruker-Daltonics, AS). Singkatnya, setiap isolat diinokulasi pada pelat agar MRS dan setelah pertumbuhannya selama 24 jam pada suhu 37 ÿC satu koloni tunggal disebarkan pada sumur pelat baja MSP96 Bruker. Setelah itu, 1 ÿL matriks (mengandung asam ÿ-siano-4-hidroksisinamat, asam tri-fluoroasetat (TFA) dan asetonitril) ditambahkan ke sumur dan dibiarkan kering selama 5 menit dalam tudung aliran laminar. Untuk kalibrasi, satu sumur pelat dinodai dengan standar Bruker BTS.
Perangkat lunak MALDI Biotyper (Bruker Daltonics) digunakan untuk interpretasi spektrum dan penugasan identitas.
Penggunaan bakteri asam laktat (BAL) sebagai kultur pelindung dalam makanan telah mendapat perhatian penelitian yang luas dalam beberapa dekade terakhir, menjadi topik utama dari beberapa studi penelitian asli dan artikel tinjauan (Barcenilla et al., 2022; Martín et al., 2022; Ramaroson et al., 2018; Vieco-Saiz et al., 2019). Sebagian besar BAL secara umum diakui aman (GRAS) dan/atau berstatus Qualified Presumption of Safety (QPS) karena secara tradisional telah digunakan dalam proses fermentasi (EFSA, 2023). Ini termasuk spesies representatif dari Carnobacterium, Lactococcus, Leu-conostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus atau genus Lactobacillus sebelumnya , yang baru-baru ini direklasifikasi menjadi dua puluh lima genus baru (EFSA, 2022; Zheng et al., 2020). Beberapa LAB ini menunjukkan sifat antimikroba yang menjanjikan, karena mampu menghambat pertumbuhan mikroorganisme yang tidak diinginkan baik melalui persaingan langsung atau melalui produksi peptida antimikroba (misalnya, bakteriosin) atau zat lain dengan sifat antimikroba (Di Gioia et al., 2016). Namun, LAB jarang digunakan dalam produk daging selain dalam makanan fermentasi.
2.2. Uji in vitro untuk penilaian aktivitas antimikroba
"
Berbagai penghambat pertumbuhan bakteri, seperti asam organik (asam sorbat, laktat, dan asetat), nitrit atau sulfit, umumnya digunakan dalam produk daging olahan dengan tujuan ini (Luchansky et al., 2023; Punia Bangar et al., 2022). Meskipun aditif ini sangat efisien dan dianggap aman, beberapa di antaranya sedang dalam evaluasi ketat karena kemungkinan risiko kesehatan dalam beberapa keadaan (Flores dan Toldra, 2021). Hal ini, bersama dengan meningkatnya permintaan konsumen akan produk yang lebih alami dan diproses secara minimal, mendorong para peneliti untuk mencari alternatif baru untuk mengawetkan makanan sambil memastikan kualitas dan keamanan. Sebagian besar inisiatif penelitian tersebut saat ini difokuskan pada penemuan dan/atau karakterisasi agen yang mengendalikan pertumbuhan L. monocytogenes dan patogen bawaan makanan lainnya yang relevan (Martín et al., 2022; Serra-Castello et al., 2022).
Salah satu wabah listeriosis yang paling terkenal selama dekade terakhir, dilaporkan di Spanyol pada bulan Agustus 2019, dikaitkan dengan konsumsi produk daging matang siap saji (RTE) dan melibatkan 227 kasus yang dikonfirmasi (WHO, 2019). Produk daging RTE yang diproses secara minimal atau tidak mengalami inaktivasi termal, atau yang memiliki masa simpan panjang yang memungkinkan bakteri psikrotrofik berkembang biak pada suhu dingin, menjadi perhatian khusus. Pada produk daging, risiko kontaminasi L.
monocytogenes dipengaruhi oleh banyak faktor, seperti kontaminasi silang produk selama operasi produksi, seperti pengisian, pengirisan atau pengemasan, atau tidak adanya penghambat pertumbuhan dalam formulasi. Memang, daging deli iris eceran menghadirkan risiko yang lebih tinggi daripada daging deli iris pra-kemasan, sementara risikonya berkurang jika penghambat pertumbuhan digunakan dalam formulasi produk daging matang (EFSA, 2018a).
"
Ruiz et al., 2010), Salmonella Typhimurium, atau Staphylococcus aureus (Chakchouk- Mtibaa et al., 2017), tergantung pada spektrum antimikroba spesifiknya. Bakteriosin dapat diaplikasikan pada makanan baik melalui penambahan langsung sebagai senyawa murni atau semi-murni (Yildirim et al., 2016), atau dapat diproduksi secara in situ oleh strain produksi yang digunakan sebagai kultur makanan ( Hu et al., 2019). Meskipun demikian, hingga saat ini, satu-satunya bakteriosin murni yang diizinkan sebagai aditif di Uni Eropa adalah nisin (E234) (Parlemen Eropa, 2008). Selain itu, pediosin PA-1 dikomersialkan sebagai ekstrak kasar yang diperoleh setelah fermentasi oleh strain produksi (Back et al., 2016), dan kolisin dan salmosin telah menerima laporan regulasi yang menguntungkan oleh FDA (FDA, nd; Hahn-Lobmann et al., 2019).
2. Bahan dan Metode
Bakteriosin telah banyak diteliti sebagai biopreservatif pangan (Field et al., 2018;
Soltani et al., 2021). Senyawa peptida ini disintesis oleh bakteri di ribosom dan dapat menghambat berbagai patogen, seperti E. coli (Arief et al., 2012), L. monocytogenes (Balay et al., 2017;
1. Pendahuluan
Aktivitas antimikroba dari 164 strain LAB dinilai menggunakan uji spot-on-lawn dan wells-in-agar dengan L. monocytogenes CECT 911 (serovar 1/2c) dan E. coli CECT 515 (serotipe O1:K1(L1):H7) sebagai
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengidentifikasi LAB dengan aktivitas antimikroba yang menjanjikan dan untuk mengembangkan strategi baru untuk biopreservasi produk daging matang RTE berdasarkan kemanjurannya sebagai kultur pelindung. Untuk mencapai tujuan ini, kumpulan 479 isolat LAB dievaluasi untuk mendeteksi strain yang mampu menghambat pertumbuhan L. monocytogenes dan E. coli dalam media kultur.
Kami memilih enam strain yang selanjutnya dikarakterisasi melalui whole genome sequencing (WGS) dan diuji untuk penghambatan pertumbuhan L. monocytogenes dalam tiga produk daging matang RTE yang berbeda. Isolat yang paling menjanjikan selanjutnya dinilai, diterapkan secara individual atau sebagai strain cocktail, pada tingkat inokulasi yang berbeda, dalam studi uji tantangan lengkap dengan ham matang, di mana potensi pertumbuhan L. monocytogenes, beberapa karakteristik fisikokimia dan sensorik produk, serta profil mikrobiota, dipantau sepanjang masa simpan dalam kondisi penyimpanan dan komersialisasi yang ditentukan.
Koleksi LAB yang terdiri dari 479 isolat yang diperoleh dalam proyek penelitian sebelumnya di mana pengambilan sampel lingkungan dilakukan di >30 pabrik pengolahan di Spanyol (data tidak dipublikasikan), terutama dari sektor daging dan susu, digunakan.
Mereka telah diambil dari permukaan yang bersentuhan dengan makanan dan bukan makanan, seperti meja, peralatan, baki, saluran pembuangan, lantai, dan dinding dari berbagai area fasilitas (area pengolahan, penyimpanan dingin, pematangan, dan pengemasan) dengan menggunakan penyeka steril HydraSponge (3 M, AS). Mereka telah diperkaya pada suhu 30 ÿC selama 18–24 jam dalam 100 mL Buffered Peptone Water (BPW, Merck, Jerman) dan kemudian ditanam pada pelat agar De Man, Rogosa, dan Sharpe (MRS, Merck) yang diinkubasi pada suhu 30 ÿC selama 72 jam dalam kondisi anaerobik (Anaerocult A, Merck).
2.1. Pengumpulan bakteri asam laktat
Spektrum aktivitasnya yang terkadang sempit, distribusi yang tidak merata dalam atau pengikatan ke matriks makanan, kerentanan terhadap inaktivasi oleh enzim proteolitik, atau kemungkinan perkembangan resistensi bakteri terhadap enzim tersebut merupakan beberapa keterbatasan utama saat ini terhadap penggunaan bakteriosin sebagai agen bio-preservasi dalam industri makanan (Soltani et al., 2021).
Gambar 1. Desain penelitian. A) Konfirmasi identitas koleksi galur LAB, karakterisasi in vitro isolat yang diinginkan, dan karakterisasi WGS berikutnya dari enam galur LAB terpilih; B) Eksperimen yang dilakukan pada berbagai produk daging olahan dengan penambahan galur LAB terpilih. Kondisi yang dipilih untuk digunakan dalam eksperimen uji tantang lanjutan ditandai dengan kotak merah, sementara teks tebal menunjukkan analisis baru yang dilakukan.
2.3. Karakterisasi LAB dengan whole genome sequencing
DNA dari enam galur LAB terpilih, yaitu ULE383, ULE639, ULE721, ULE949, ULE1599, dan ULE1841, diekstraksi menggunakan DNeasy®
PowerSoil® Pro Kit (Qiagen, Belanda) mengikuti petunjuk pabrik, tetapi dengan elusi akhir dengan 25 ÿL So-lution C6 (10 mM Tris) untuk meningkatkan konsentrasi DNA. Konsentrasi DNA akhir diukur dengan fluorometer Qubit menggunakan kit uji dsDNA HS (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, AS).
Agar BHI diinokulasi dengan kultur semalam dari strain target L.
monocytogenes atau E. coli untuk mencapai konsentrasi 8 log10 CFU/mL,
dan dituangkan ke dalam cawan Petri yang dikeringkan dengan udara selama 30 menit. Sumur dibuat pada pelat agar menggunakan tabung Durham dan 50 ÿL CFS ditambahkan ke sumur yang sesuai dalam rangkap tiga. Periode 2 jam pada suhu kamar digunakan untuk terjadinya difusi yang lebih baik. Akhirnya, pelat diinkubasi pada suhu 37 ÿC selama 24 jam.
Diameter zona penghambatan pertumbuhan dinyatakan sebagai unit sembarang. Satu unit sembarang (AU) aktivitas antimikroba didefinisikan sama dengan diameter 1 mm. Dalam kedua pengujian, strain L. lactis
dengan aktivitas antagonis yang diamati sebelumnya terhadap bakteri target digunakan sebagai
Pustaka berpasangan 150 bp disiapkan dengan DNA yang diekstraksi menggunakan kit Persiapan Pustaka DNA Nextera XT (panduan referensi 15.031.942 v03) (Illumina Inc., San Diego, CA, AS) di Macrogen Inc.
Untuk pengujian spot-on-lawn, galur LAB ditumbuhkan dalam kaldu MRS dan diinkubasi pada suhu 30 ÿC selama 24 jam dalam kondisi anaerobiosis.
Kemudian, 2 ÿL suspensi bakteri ditotolkan ke dalam pelat agar MRS sebanyak tiga kali. Setelah 24 jam inkubasi anaerobik pada suhu 30 ÿC, bakteri yang tumbuh dinonaktifkan melalui pemaparan pelat agar terbalik yang dibuka tutupnya ke cakram kertas saring yang dibasahi kloroform selama 20 menit. Pelat kemudian dilapisi dengan sekitar 20 mL kaldu Brain Heart Infusion (BHI, Merck) yang dilengkapi dengan 0,75% agar dan sebelumnya diinokulasi dengan 200 ÿL kultur semalam dari strain target L.
monocytogenes atau E. coli , yang tumbuh pada suhu 37 ÿC di BHI dan
Luria-Bertani (LB, Merck), untuk mencapai konsentrasi sekitar 8 log10 CFU/
mL. Setelah inkubasi aerobik pada suhu 37 ÿC selama 24 jam, pelat diperiksa untuk mengidentifikasi dan mengukur zona hambatan pertumbuhan di sekitar setiap titik
(Hoover dan Harlander, 1993; Leite et al., 2015).Untuk pengujian sumur-dalam-agar, LAB yang sebelumnya dikonfirmasi memiliki aktivitas antagonis dalam pengujian spot-on-lawn ditumbuhkan dalam kaldu MRS seperti yang dijelaskan sebelumnya. Setelah 24 jam inkubasi anaerobik, suspensi bakteri disentrifugasi selama 10 menit pada
7000 xg dan supernatan bebas sel (CFS) dikumpulkan. Sementara itu, cairan (48 ÿC) strain indikator, keduanya diperoleh dari Koleksi Kultur Tipe Spanyol (Colecci
´ on Espanola ˜ de Cultivos Tipo - CECT).
Kontrol positif dan kaldu MRS yang tidak diinokulasi juga digunakan sebagai kontrol negatif.
2.3.2. Penetapan taksonomi
Genom ditetapkan secara taksonomi oleh GTDB-Tk v1.7.0
(Chaumeil et al., 2020)dengan parameter default. Untuk melengkapi hasil, dRep v 2.6.2
(Olm et al., 2017)digunakan untuk menyusun pohon filogenetik berdasarkan jarak ANI (95%) menggunakan genom referensi dari National Center for Biotechnology Information (NCBI -
(Seoul, Korea). Pengurutan dilakukan pada platform Illumina NovaSeq6000 mengikuti protokol pengurutan standar Illumina.
2.3.1. Penyaringan dan
perakitan Penyaringan bacaan mentah dilakukan dengan TrimGalore (https://githu b.com/FelixKrueger/TrimGalore)
menggunakan parameter –
stringency 5 –length 75 –quality 20 –max_n 2 –trim-n . Perakitan genomdilakukan menggunakan SPAdes v3.15.2
(Prjibelski et al., 2020)dengan
panjang k-mer 55, 75, dan 97. Kualitas genom diperiksa dengan CheckM
v1.1.3
(https://github.com/Ecogenomics/CheckM).https://www.ncbi.nlm.nih.gov/).
Setelah itu, sumur dibuat dalam agar dan 50 ÿL LAB CFS, yang diperoleh seperti yang dijelaskan sebelumnya, ditambahkan ke setiap sumur. Akhirnya, pelat diinkubasi pada suhu 37 ÿC selama 24–48 jam dan diperiksa untuk zona penghambatan.
Penyiapan dan inokulasi sampel dengan isolat LAB dan/atau koktail galur L.
monocytogenes dilakukan sesuai dengan “Dokumen Panduan Teknis EURL Lm untuk melakukan studi masa simpan L. monocytogenes dalam makanan RTE” (ANSES, 2021).
2.5.1. Persiapan sampel Tiga
produk daging matang RTE yang berbeda digunakan untuk menguji aktivitas anti- Listerial dari enam strain LAB terpilih (ULE383, ULE639, ULE721, ULE949, ULE1599 dan ULE1841) dalam makanan, yaitu ham matang, daging cincang dan bahu babi panggang.
Ham matang yang diiris diperoleh dari supermarket lokal dan daging cincang dan bahu babi panggang dari produsen daging setelah maksimal 48 jam dari produksi. Bahan- bahan produk tersebut adalah: ham (85%), air, garam, dekstrosa, E-451i, E-407, natrium askorbat, rempah-rempah, aroma dan natrium nitrit untuk ham matang; daging babi (95%), garam, dekstrosa, E-451i, E-250, rempah-rempah, aroma dan E-306 untuk bahu babi panggang; dan daging babi (85%), lemak babi, garam, anggur, rempah-rempah, E-262i, E-320, penambah rasa dan aroma untuk daging cincang. Produk daging yang terakhir ini dipotong secara aseptik untuk mendapatkan irisan sekitar 12 g dan tebal 1 mm. Uji tantang dilakukan menggunakan campuran dua galur L. monocytogenes , untuk memperhitungkan variasi pertumbuhan antar galur. Campuran tersebut terdiri dari galur L. monocytogenes yang sebelumnya digunakan untuk uji antimikroba in vitro (CECT 911) dan galur L. monocytogenes yang diisolasi oleh Alvarez-Molina et al. (2021) dari lingkungan pemrosesan industri daging (Lm-970).
Enam isolat LAB terpilih (ULE383, ULE639, ULE721, ULE949, ULE1599, dan ULE1841) ditumbuhkan dalam kaldu MRS seperti yang dijelaskan sebelumnya dan suspensi bakteri disentrifugasi pada 16.000 ×g selama 2 menit. Kultur Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus LMG 6901 juga disiapkan dalam MRS dan diinkubasi semalam pada suhu 37 ÿC sebagai mikroorganisme target. Kemudian, 20 mL agar MRS cair diinokulasi dengan 100 ÿL kultur target semalam, dan dipadatkan dalam cawan petri.
Total volume yang ditambahkan tidak melebihi 1% dari massa sampel, agar tidak mengubah sifat fisiko-kimia awal. Empat kelompok sampel disiapkan: (i) kontrol negatif (NC) yang tidak diinokulasi; (ii) kontrol positif, hanya diinokulasi dengan L. monocytogenes (PC); (iii) hanya diinokulasi dengan LAB (LAB); dan (iv) diinokulasi dengan LAB dan L.
monocytogenes. Akhirnya, sampel dikemas vakum (25 mbar) dalam kantong poliamida 30 ÿm – polietilena 130 ÿm (permeabilitas terhadap oksigen 30 cm3 /(mm2 ÿ24 hÿbar)) (Pargon, Spanyol) dan disimpan pada suhu 7 ÿC selama 7 hari, diikuti oleh 3 hari pada suhu 12 ÿC. Percobaan dilakukan dalam rangkap tiga.
2.5.2. Analisis mikrobiologi dan fisika-kimia Analisis mikrobiologi
dan fisika-kimia (pH dan aw) ham matang, meatloaf, dan daging babi panggang dilakukan pada hari ke-0, ke-5, dan ke-10 penyimpanan. Untuk analisis mikrobiologi, seluruh sampel (12 g) dicampur dengan 108 mL 0,1% BPW dalam kantong filter steril (15–23 cm, Whirl-pack, AS) dan dihomogenkan dalam stomacher (IUL Instruments, Spanyol) dengan kecepatan penuh selama 4 menit. Suspensi diencerkan secara desimal dalam BPW dan jumlah L. monocytogenes dan LAB.
Eluen IPA dihilangkan menggunakan penguapan putar dan sampel pekat diaplikasikan ke kolom Strata–
E C18 SPE 12 mL, 2 g (Phenomenex, Inggris) yang telah diseimbangkan sebelumnya dengan metanol (Merck, Irlandia) dan air suling. Kolom dicuci dengan 12 mL etanol 25% dan aktivitas antimikroba dielusi dengan 12 mL IPA. Semua eluen diuji dalam pelat indikator L. bulgaricus LMG 6901 seperti yang dijelaskan sebelumnya. IPA dihilangkan dari eluen C18 SPE dengan penguapan putar dan sampel yang dihasilkan diaplikasikan ke kolom Jupiter Proteo C12 RP-HPLC analitis (250 × 4,6 mm, 4 ÿm, 90 Å) yang menjalankan 25–45% asetonitril,
Sampel daging RTE (~12 g) diinokulasi dengan LAB dan target koktail L.
monocytogenes pada permukaan dengan menyebarkan kultur yang telah disiapkan secara homogen untuk memperoleh konsentrasi sekitar 8 dan 2 log10 CFU/g untuk LAB dan L. monocytogenes, masing-masing.
Secara singkat, galur LAB ditumbuhkan secara individual dalam kaldu MRS pada suhu 30 ÿC selama 48 jam dalam anaerobiosis. Galur L. monocytogenes ditumbuhkan secara individual dalam kaldu BHI pada suhu 37 ÿC selama 15–18 jam untuk mencapai fase stasioner awal dan kemudian kultur segar disiapkan dengan menambahkan 0,1 mL subkultur sebelumnya ke 9 mL BHI dan diinkubasi pada suhu 7 ÿC selama 7 hari untuk mengadaptasi sel dengan kondisi suhu penyimpanan makanan. Untuk menyiapkan koktail dengan dua galur L. monocytogenes , volume yang sama dari masing-masing kultur dicampur. Galur LAB dan koktail L. monocytogenes disentrifugasi pada 3000 xg selama 10 menit pada suhu 20 ÿC dan pelet disuspensikan kembali dalam air garam steril (0,95%
NaCl).
2.4.1. Konfirmasi produksi nisin Z Untuk
mengonfirmasi bahwa L. lactis ULE383 menghasilkan nisin Z, satu koloni strain dari pelat GM17 (Oxoid, Irlandia) diinokulasi ke dalam 5 mL kaldu GM17. Setelah inkubasi semalam pada suhu 30 ÿC, kultur ini digunakan untuk menginokulasi 250 mL kaldu Ragi Tryptone (TY) (Merck, Irlandia) yang diinkubasi lagi semalam pada suhu 30 ÿC. Kultur yang tumbuh sempurna disentrifugasi pada 8000 ×g selama 20 menit pada suhu 10 ÿC dan CFS dilewatkan melalui kolom Econo (BioRad, Inggris) yang berisi 10 g manik interaksi hidrofobik Amberlite XAD16N (Phenomenex, Inggris). Kolom dicuci dengan 100 mL etanol 30% dan aktivitas antimikroba dielusi dalam 100 mL 70% propan-2-ol yang mengandung 0,1% TFA (IPA).
Gradien TFA 0,1% di mana fase gerak A adalah TFA 0,1% dan fase gerak B adalah asetonitril 100% TFA 0,1%. Fraksi dikumpulkan pada interval 1 menit dan dinilai untuk aktivitas antimikroba. Fraksi aktif dinilai untuk keberadaan massa nisin Z (3330 Da) dengan spektrometri MALDI-TOF MS (Bruker Ultraflex, Bremen, Jerman) dalam mode reflektor ion positif.
Deteksi plasmid dicapai melalui dua alat dari CGE: PlasmidFinder v2.0.1 (Camacho et al., 2009; Carattoli et al., 2014), dengan ID 70% dan panjang cakupan 60%, dan MobileElementFinder v1.0.3 (Johansson et al., 2021). Urutan penyisipan atau transposon juga dianalisis dengan MobileElementFinder.
Kehadiran gen yang mengkode faktor virulensi yang diketahui dinilai dengan menggunakan VirulenceFinder v2.0.3 (Camacho et al., 2009; Joensen et al., 2014;
Tetzschner et al., 2020) dari CGE dengan batas 85% ID dan 60% panjang cakupan.
2.5. Evaluasi potensi biopreservatif enam isolat LAB dalam produk daging matang RTE
2.4. Penilaian potensi bakteriosinogenik strain 2.3.4. Prediksi produksi bakteriosin Potensi
masing-masing galur untuk menghasilkan bakteriosin atau peptida yang disintesis secara ribosomal dan dimodifikasi secara pascatranslasi (RiPPS) juga ditentukan. Untuk tujuan tersebut, berkas fasta genom dari masing-masing dari enam galur yang diurutkan diunggah ke server web BAGEL4 (Van Heel et al., 2018). Perbandingan nisin Z yang diprediksi dengan nisin Z yang dijelaskan sebelumnya dilakukan pada tingkat asam amino menggunakan BLASTP (Mulders et al., 1991).
2.3.3. Deteksi resistensi antimikroba, gen virulensi, plasmid, dan elemen genetik bergerak lainnya Dua basis data berbeda
digunakan untuk mendeteksi gen resistensi antimikroba (ARG) yang diketahui. Server web ResFinder v4.1 (Bortolaia et al., 2020; Camacho et al., 2009; Zankari et al., 2017) dari Centre for Genomic Epidemiology (CGE) pertama kali digunakan dengan batas 70%
persentase identitas (ID) dan 60% panjang cakupan. Kedua, sekuens genom diselaraskan dengan sekuens protein dari ARG yang disertakan dalam Resistance Gene Identifier (RGI) v6.0.1 menggunakan parameter default dan kriteria Perfect, Strict, dan Loose hits dari Comprehensive Antibiotic Resistance Database (CARD) v3.2.6 (Alcock et al., 2023).
Hanya hits dengan >70% ID yang disimpan untuk analisis.
2.7.2. Analisis mikrobiologi dan fisika-kimia Analisis mikrobiologi
dan fisika-kimia (pH dan aw) dilakukan dalam rangkap tiga, seperti yang dijelaskan sebelumnya, pada hari ke-1, ke-11, ke-20 dan ke-29 penyimpanan. MRS, ALOA dan Plate Count Agar (PCA, Merck) digunakan untuk penghitungan LAB, L. monocytogenes dan total bakteri psikotropik. Inkubasi pelat MRS dan ALOA dilakukan seperti yang dijelaskan di atas, sementara pelat PCA diinkubasi selama 10 hari pada suhu 7 ÿC.
c(275,250). Chimera dihilangkan dan tabel Amplicon Sequence Variant (ASV) diperoleh dengan membandingkan urutan bersih dengan versi database RDP referensi 18 (Ribosomal Database Project) dengan menggunakan perintah assignTaxonomy di DADA2 (Cole et al., 2014).
2.7.4. Analisis sensorik 2.6. Penilaian potensi biopreservatif dari tiga strain LAB terpilih pada konsentrasi
berbeda dalam daging ham yang dimasak
Untuk analisis bioinformatika dan pemrosesan data, pembacaan mentah diproses menggunakan DADA2 v1.8.0 (Callahan et al., 2016) mengikuti tutorial penulis. Pertama, cutadapt (Martin, 2011) digunakan untuk menghilangkan urutan primer, dan basa ambigu dilepaskan menggunakan truncLen =
Analisis sensori dilakukan dalam satu sesi dengan 52 panelis.
2.7.1. Persiapan sampel Di sini,
tujuannya adalah untuk mengevaluasi efek inokulasi dengan koktail tiga strain LAB pada konsentrasi 8 log10 CFU/g pada mikrobiota, pH, aw, warna, tekstur dan karakteristik sensorik ham yang dimasak dalam tiga kondisi pengemasan yang berbeda. Ham yang dimasak disiapkan seperti yang dijelaskan sebelumnya, tetapi hanya koktail LAB pada 8 log10 CFU/g yang disertakan dalam rancangan. Kondisi pengemasan adalah: pengemasan vakum (25 mbar), pengemasan atmosfer termodifikasi (MAP)
2.7. Evaluasi terperinci melalui pengujian tantangan terhadap potensi biopreservatif dari koktail tiga strain LAB yang diinokulasi pada konsentrasi 8 log10 CFU/ g dalam ham
matang yang dikemas dalam kondisi berbeda
Keempat batch yang sama seperti yang dijelaskan sebelumnya digunakan.
2.6.1. Persiapan sampel Untuk
melakukan uji coba ini, ham segar yang dimasak (< 2 hari setelah produksi) dibeli dari tempat pemotongan hewan lokal dan diiris dalam kondisi aseptik di laboratorium untuk mendapatkan irisan seberat 20 g. Bahan-bahannya adalah daging babi, air, garam, dekstrosa, E-451, susu skim bubuk, E-331iii, E-621, aroma, E-301, E-250, E-120 dan protein kedelai. Setiap irisan diinokulasi secara superfisial seperti yang dijelaskan sebelumnya secara individual dengan tiga galur LAB yang menunjukkan hasil paling menjanjikan dalam percobaan sebelumnya, atau dengan koktail dari tiga galur tersebut.
Koktail dua galur L. monocytogenes juga diinokulasi secara superfisial seperti yang dijelaskan di atas. Uji tantang dilakukan dalam tiga konsentrasi LAB yang berbeda, 4, 6 dan 8 log10 CFU/g. Sampel dikemas vakum dan diinkubasi selama 13 hari pada suhu 7 ÿC, diikuti oleh 7 hari pada suhu 12 ÿC.
Indeks keragaman alfa dihitung menggunakan perintah specnumber dan di-versity dari vegan sedangkan analisis keragaman beta dilakukan menggunakan jarak ketidakmiripan Bray Curtis dengan perintah cmdscale . Plot dibuat menggunakan ggplot2. Semua analisis dan plot dilakukan di RStudio versi 4.0.2.
2.7.3. Evaluasi warna dan tekstur
2.6.2. Analisis mikrobiologi dan pH Analisis
mikrobiologi dan pH dilakukan pada hari ke-1, ke-11, dan ke-20 penyimpanan. Untuk analisis mikrobiologi, sampel terlebih dahulu diencerkan dan dihomogenkan dengan 180 mL 0,1% BPW mengikuti prosedur yang dijelaskan sebelumnya. Pengenceran desimal serial dilakukan dan ditaburkan pada agar MRS dan ALOA untuk penghitungan LAB dan L.
monocytogenes, masing-masing. Inkubasi pelat MRS dan ALOA, serta penentuan pH dilakukan seperti yang dijelaskan di bagian sebelumnya. Semua pengukuran dilakukan dalam rangkap tiga.
"
Enam jenis sampel disertakan dalam analisis ini: ham matang NC yang dikemas dalam vakum, MAP atau HPP, dan ham matang yang diinokulasi LAB yang dikemas dalam vakum, MAP atau HPP. Sampel dipindahkan ke piring plastik transparan dengan tutup setelah 14 hari penyimpanan pada 7 ÿC, diberi pengenal tiga digit dan disajikan secara acak. Uji peringkat dengan enam sampel dilakukan untuk mengevaluasi secara independen:
penampilan visual sebagai gelap/terang, intensitas bau terkait asam, intensitas rasa asam dan kesenangan global. Bersamaan dengan itu, uji penerimaan konsumen dilakukan.
Sampel-sampel yang diberi peringkat dengan nilai terendah (1) adalah yang paling terang (warna), paling tidak asam (bau dan rasa) atau paling tidak dapat diterima (global) dan yang dengan nilai tertinggi (6) adalah yang paling gelap (warna), paling asam (bau dan rasa) atau paling dapat diterima (global). Penerimaan konsumen dinyatakan sebagai frekuensi, mengacu pada persentase panelis yang menetapkan bau setiap sampel ke kategori menyenangkan, tidak menyenangkan, atau tidak dinilai.
ditentukan setelah pelapisan sebar pada pelat Agar Listeria Ottavani dan Agosti (ALOA, VWR) dan pelat agar MRS, masing-masing. Pelat agar MRS diinkubasi pada suhu 30 ÿC selama 48 jam dalam anaerobiosis, sedangkan pelat agar ALOA diinkubasi pada suhu 37 ÿC selama 48 jam. Potensi pertumbuhan L. monocytogenes ditentukan dengan menghitung perbedaan antara jumlah (log10 CFU/g) pada hari ke-5 atau ke-10 dan jumlah pada hari ke-0. pH ditentukan menggunakan pH-meter (VioLab, XS Instruments,
Italia) setelah menghomogenkan sampel dengan air suling dalam campuran 50:50 b/b.
Elektroda pH dikalibrasi menggunakan larutan penyangga dengan pH 4,0 dan pH 7,0 dan dibilas dengan air deionisasi. Aktivitas air (aw) diukur menggunakan higrometer Decagon CX-2 (Decagon Devices Inc., AS). Semua pengukuran dilakukan rangkap tiga.
(20% CO2–80% N2), dan pengemasan vakum (25 mbar) diikuti oleh Pemrosesan Tekanan Tinggi (HPP) pada 500 MPa selama 3 menit pada suhu 15 ÿC (Hiperbaric, Burgos, Spanyol). Sampel disimpan pada suhu 7 ÿC selama 19 hari, diikuti oleh 10 hari pada suhu 12 ÿC.
Penganalisis Tekstur TA-XT2i (Stable Micro Systems, Inggris) digunakan untuk Analisis Profil Tekstur (TPA). Sampel (1 × 1 × 1 cm) dibiarkan mencapai suhu ruangan dan dikompresi secara aksial dalam kompresi dua siklus dengan probe datar melingkar 40 mm hingga 60% dari tinggi sampel pada kecepatan silang 5 mm/s. Parameter tekstur meliputi kekerasan, kekompakan, ketahanan, elastisitas, kekentalan, dan kekenyalan.
Sembilan kali ulangan pada setiap titik pengambilan sampel dilakukan untuk penentuan warna dan tekstur.
Platform Illumina Miseq digunakan untuk mengurutkan amplikon gen 16S rRNA dengan pengurutan pasangan ujung sepanjang 300 bp. Primer yang digunakan adalah SD- Bact-0341-bS-17 (5ÿ-CCTACGGGNGGCWGCAG-3ÿ) dan SD-Bact-0785- aA-21 (5ÿ- GACTACHVGGGTATCTAATCC-3ÿ) (Carrasco et al., 2020), yang mengamplifikasi daerah hipervariabel V3-V4. Amplifikasi PCR, persiapan pustaka Miseq, dan pengurutan dilakukan di platform pengurutan Centro de Investigacion Biom´edica de La Rioja (CIBIR), Spanyol.
2.7.5. Profil mikrobiota melalui pengurutan amplikon gen 16S rRNA Total DNA diekstraksi dari sampel pada hari ke-1, ke-15, dan ke-28 penyimpanan. Dari setiap sampel, 10 g dihomogenkan dengan 90 mL Phosphate Buffer Saline (PBS, Sigma-Aldrich) dalam stomacher (IUL Instruments) pada kecepatan maksimum selama 2 menit. Sampel yang dihomogenkan disentrifugasi pada 5000 xg selama 15 menit pada suhu ruangan. DNA diisolasi dari pelet sel dengan DNeasy® PowerSoil® Pro Kit (Qiagen) mengikuti spesifikasi pabrik. ZymoBIO-MICS Microbial Community Standard (Zymo Research, AS) digunakan sebagai kontrol positif.
Warna permukaan daging ham yang dimasak diukur dengan alat CM-5/CR-5 Konica Minolta (Illuminant D65, aperture 8 mm dan pengamat standar 10ÿ) pada hari ke-1, ke-14 dan ke-27 masa simpan. Nilai kecerahan (L*), kroma (C*) dan rona (h*) CIE dicatat. Total perbedaan warna (TCD) dihitung sebagai ÿE = [(ÿL)2 + (ÿa)2 + (ÿb)2 ] 1/2.
Semua isolat LAB yang dipilih selanjutnya dikenakan uji aktivitas antimikroba menggunakan dua patogen bawaan makanan, yaitu L. monocytogenes dan E. coli, sebagai mikroorganisme target (berkas tambahan 1).
Dengan mempertimbangkan hasil yang diperoleh, 6 isolat LAB (yakni, ULE383, ULE639, ULE721, ULE949, ULE1599, dan ULE1841) yang menunjukkan aktivitas antimikroba paling kuat (yakni, strain yang menunjukkan zona hambatan pada kedua uji spot-on-lawn dan wells-in-agar terhadap kedua mikroorganisme target, atau yang menunjukkan AU > 12 untuk salah satu wells-in-agar dan AU > 20 untuk salah satu uji spot-on-lawn) dipilih untuk lebih jauh mengeksplorasi aplikasinya sebagai agen biopreservasi dalam produk daging.
' bahasa Inggris
Menariknya, meskipun aktivitas antimikroba serupa terhadap L. monocytogenes CECT 911 dan E. coli CECT 515 ditemukan pada uji spot-on-lawn, pada uji wells-in-agar E. coli secara umum lebih rentan daripada L. monocytogenes, dengan berbagai isolat LAB menunjukkan aktivitas hanya terhadap bakteri Gram-negatif ini. Temuan ini tidak Perbedaan signifikan dalam analisis beta-diversitas ditentukan melalui uji analisis perbedaan (ADONIS), menggunakan perintah adonis dari vegan.
Namun, 3 galur (satu diidentifikasi sebagai L. lactis dan dua sebagai L. garvieae) menghasilkan identifikasi dengan keyakinan rendah (skor antara 1,70 dan 1,99), dan 3 galur lainnya tidak dapat diidentifikasi melalui MADI-TOF MS, baik karena tidak ada puncak yang terdeteksi atau karena tidak ada identifikasi organisme yang dapat diandalkan, yang dapat disebabkan oleh spesies yang hilang dalam pustaka. Meskipun demikian, isolat ini disertakan untuk analisis lebih lanjut.
3. Hasil dan Pembahasan
Analisis WGS dan bioinformatika yang disesuaikan menunjukkan fitur genomik dari 6 galur yang dipilih (Tabel 1). Jumlah gen yang diprediksi dalam setiap genom berkisar antara 3253 hingga 3442 untuk isolat dari genus Lactobacillus sebelumnya , sedangkan genom L. lactis mengandung 2376 gen yang diprediksi, serupa dengan hasil yang dijelaskan oleh penulis lain (Goel et al., 2020; Mataragas, 2020; Wels et al., 2019).
Pengujian antagonis menunjukkan bahwa total 73 dan 71 galur LAB menghambat pertumbuhan L. monocytogenes dan E. coli hingga taraf tertentu dalam pengujian spot- on-lawn , sedangkan dalam pengujian sumur dalam agar, hanya 17 dan 44 galur LAB, masing-masing, yang menghasilkan lingkaran penghambatan (File tambahan 2).
3.3. Karakterisasi melalui sekuensing genom utuh Pembacaan mentah dari WGS dari enam isolat dan sekuensing amplikon gen 16S rRNA
dari daging ham yang dimasak telah disimpan di Pusat Informasi Bioteknologi Nasional di bawah ID Bioproyek PRJNA941229.
2.9. Nomor aksesi
"
setuju dengan hasil penelitian lain yang menunjukkan bahwa bakteri Gram-positif dilaporkan lebih sensitif terhadap antimikroba yang diproduksi oleh LAB daripada bakteri Gram-negatif, yang memiliki membran sel luar yang melindungi sel terhadap agen antimikroba dan senyawa lain seperti antibiotik (Gupta, 2011; Kim et al., 2022; Sewify et al., 2017). Penjelasan yang mungkin untuk peningkatan kerentanan E. coli adalah bahwa keberadaan asam organik yang diproduksi oleh strain LAB, seperti asam laktat, dan penurunan pH, dapat mengganggu kestabilan dan permeabilisasi membran luar, sehingga mendukung terjadinya aktivitas antimikroba (Alakomi et al., 2000; Chen et al., 2022).
Selain itu, beberapa penulis juga melaporkan bahwa beberapa bakteriosin dapat memiliki spektrum antimikroba yang luas, juga aktif melawan bakteri Gram-negatif karena pengikatannya yang spesifik terhadap protein membran yang dapat bertindak sebagai reseptor spesifik bakteriosin (Acuna et al., 2012).
Sebanyak 479 isolat LAB dugaan, yang telah diisolasi dari lingkungan pengolahan makanan industri daging (66% sampel), susu (32% sampel) dan madu (2% sampel), dikarakterisasi melalui MALDI-TOF MS untuk konfirmasi identitas. Secara total, 34,2%
isolat diidentifikasi sebagai LAB yang dimaksud berdasarkan cakupan penelitian ini, yang meliputi isolat dari Lactococcus (n = 109), genus Lactobacillus sebelumnya (n = 48), Leuconostoc (n = 5) dan Pediococcus (n = 2)
3.2. Skrining aktivitas antimikroba 3.1. Karakterisasi koleksi kultur LAB 2.8. Analisis statistik
Untuk mengonfirmasi penetapan taksonomi untuk setiap genom bakteri, basis data GTDB-Tk digunakan. Kecocokan terbaik yang diperoleh untuk setiap isolat, dengan skor Average Nucleotide Identity (ANI) yang sesuai, adalah: L. lactis untuk ULE383 (97,26%
ANI), L. paracasei untuk ULE721 (98,2% ANI), dan L. plantarum untuk ULE639, ULE949, ULE1599 dan ULE1841 (ANI berkisar dari 98,76% hingga 98,85%). Penetapan ini sesuai dengan hasil yang diperoleh melalui MALDI-TOF MS, kecuali untuk ULE1599, strain yang tidak terdeteksi puncaknya dalam analisis MALDI-TOF MS. Selain itu, pohon filogenetik berdasarkan sekuens genom utuh dihasilkan (Gbr. 2), yang menguatkan hasil yang diperoleh dalam GTDB-Tk.
Umumnya, anggota Lactococcus dan genus Lactobacillus sebelumnya dianggap tidak patogen dan digunakan secara luas sebagai kultur starter dalam proses fermentasi atau sebagai probiotik. Memang, berbagai spesies dari taksa ini memiliki status QPS atau GRAS. Tidak ada gen virulensi yang terdeteksi untuk keenam isolat LAB. Namun, isolat LAB dapat membawa gen resistensi antimikroba (Campedelli et al., 2019). Di Uni Eropa, setiap galur yang dimaksudkan untuk digunakan untuk konsumsi manusia atau hewan harus bebas dari determinan resistensi antimikroba (EFSA, 2018b). Analisis genom dengan basis data Res-Finder hanya menghasilkan gen terkait resistensi, yang mengkode protein CIpL, yang terlibat dalam resistensi terhadap panas (ID 98%), yang Data dari uji peringkat mikrobiologi, fisika-kimia, warna, tekstur dan sensori dianalisis
secara statistik menggunakan ANOVA satu arah dengan regresi model linier menggunakan fungsi lm di RStudio versi 4.0.2. Data dari hasil frekuensi analisis sensori dianalisis dengan tabel statistik untuk memperkirakan signifikansi dalam uji preferensi berpasangan (Roessler et al., 1978). Dalam analisis metataksonomi, perbedaan signifikan dalam indeks keragaman alfa ditentukan menggunakan uji Wilcoxon dengan menggunakan perintah compare means dari ggpubr.
Hampir semua identifikasi memiliki tingkat keyakinan tinggi, mengingat nilai skor (berkisar dari 2 hingga 3) yang diperoleh dengan MALDI Biotyper.
(File tambahan 1), genus yang sebelumnya dikaitkan dalam literatur dengan produksi bakteriosin (da Costa et al., 2019; Skariyachan dan Govindarajan, 2019) atau dengan aktivitas yang menjanjikan sebagai agen biopreservatif (Mayo dan Florez, 2020). LAB lainnya dikecualikan dari analisis selanjutnya (yaitu, Enterococcus dan Weisella) karena tidak termasuk dalam daftar QPS (EFSA, 2022). Di antara LAB terpilih yang diminati, pada tingkat spesies, identifikasi yang paling sering adalah L. lactis (52,7%), diikuti oleh L. plantarum (17,4%) dan Lactococcus garvieae (12,6%). Perlu diperhatikan bahwa langkah pengayaan non-selektif dapat mendukung deteksi beberapa LAB asidurik tertentu dibandingkan yang lain.
Lingkaran hambatan pertumbuhan yang diperoleh bervariasi dalam ukuran dan bentuk. Sebagian besar zona hambatan menunjukkan tepi yang kabur, sementara yang lain menunjukkan tepi yang jelas dan tajam. Ukuran lingkaran hambatan minimum adalah 5 AU dalam pengujian spot-on-lawn dan 6 AU dalam pengujian wells-in-agar. Area hambatan terbesar, hingga 30 AU, dicapai untuk beberapa galur L. plantarum dalam pengujian spot-on-lawn terhadap kedua patogen. Lingkaran hambatan yang diperoleh dalam pengujian wells-in-agar lebih kecil, hingga 12 AU dalam kasus galur L. plantarum terhadap E. coli dan 17 AU untuk galur L. lactis terhadap L. monocytogenes. Diameter rata-rata zona penghambatan adalah 12,6 ± 4,2 dan 16,4 ± 5,7 AU dalam uji spot-on- lawn dan 11,1 ± 2,5 dan 10,0 ± 0,8 AU dalam uji wells-in-agar untuk L. monocytogenes dan E. coli . Semua hasil yang diperoleh dalam kedua uji untuk setiap galur LAB dan mikroorganisme target ditunjukkan dalam berkas Tambahan 1.
Gambar 2. Pohon filogenetik yang dilakukan secara berpasangan menggunakan dRep v.2.6.2 yang menunjukkan pengelompokan Mash. Enam isolat LAB yang dipilih disorot dalam kotak merah.
Tabel 1
Data yang diperoleh dari analisis pengurutan genom keseluruhan dari enam isolat LAB terpilih dengan aktivitas antimikroba yang paling menjanjikan.
Garis putus-putus membatasi 95% Mash Average Nucleotide Identity (ANI).
plasmid yang membawa gen dengan kemampuan teknologi dan metabolisme seperti produksi bakteriosin atau resistensi fag (Stefanovic dan McAuliffe, 2018). Genom dari lima galur yang dimasukkan ke dalam genus Lactobacillus sebelumnya ditemukan mengandung setidaknya satu kontig yang menunjukkan homologi dengan plasmid yang dijelaskan sebelumnya, sedangkan genom L. lactis ULE383 tidak mengandung apa pun (Tabel 1).
"
Telah dilaporkan sebelumnya bahwa beberapa strain LAB umumnya mengandung terdeteksi pada empat galur L. plantarum , yaitu ULE639, ULE949, ULE1599 dan ULE1841. Okoye et al. (2022) juga menemukan gen ketahanan panas yang sama pada galur L. plantarum lainnya . Di sisi lain, analisis CARD memperkirakan dengan identitas 99,85% dan cakupan panjang 100% bahwa ULE383 membawa gen ketahanan antibiotik lincosamide (lmrD). Gen ini sebelumnya telah dilaporkan pada galur L. lactis lainnya (Bel´en Florez et al., 2006; Lubelski et al., 2006, 2004). Namun, lmrD perlu membentuk heterodimer dengan subunit lmrC agar memiliki aktivitas sebagai pompa pengeluaran antibiotik pengikat ATP (Lubelski et al., 2004), dan lmrC tidak ada dalam genom L. lactis ULE383.
Mengenai hasil yang diperoleh dengan BAGEL4, satu-satunya strain bakteriosinogenik yang diprediksi adalah L. lactis ULE383, dengan urutan peptida yang diprediksi konsisten dengan nisin Z (File tambahan 3). Nisin Z adalah varian nisin A yang sangat erat hubungannya, dengan hanya satu perbedaan asam amino (Mulders et al., 1991). File tambahan 3 menunjukkan genetika
Antibiotika GC (%)
gen
pR18 (92,17 % ID), LBPp6 (100 % ID), pLBUC03 (83,75 % ID), LBPp1 (99,43 % ID)
Tidak ada
CIpL (ID 98%) Lacticaseibacillus
paracasei 3.135.190 46.27 3.253
LSEI_A15 (ID 92,1%)
Kelompok gen bakteriosin
Tidak ada
ULE639
lmrD (longgar, ID 99,85%)
pLBUC03 (88,48 % ID), pCIS4 (97,16 % ID), LBPp6 (100
% ID), LBPp1 (90,53 % ID)
perlawanan Panjang genom (bp)
ULE1841
Tidak ada
Faktor Virulensi
Tidak ada
Lactiplantibacillus plantarum 3.398.951 44,34 3413
Tidak ada Tidak ada
Tidak ada
KARTU susu
Urutan penyisipan dan transposon (MGE)
Tidak ada
Lactiplantibacillus plantarum 3.428.239 44,25 3442
Tidak ada
ULE1599
Tidak ada
Plasmid (PlasmidFinder dan MGE)
Tidak ada
Identifikasi taksonomi
CIpL (ID 98%)
Tidak ada
ISP1 (99,86 % ID), ISLhe30 (94,81 % ID), ISLpl1 (94,64 % ID), ISS1N (98,64 % ID)
Tidak ada Penemu Resolusi Tidak Ada
Laktokokus
Tidak ada
ISP1 (99,86 % ID), ISLhe30 (94,81 % ID), ISLpl1 (94,64 % ID), ISSN1 (98,64 % ID)
CIpL (ID 98%) Lactiplantibacillus
plantarum 3.400.408 44,34 3420
Tidak ada
Tidak ada
ULE949
Jumlah gen yang diprediksi
(Pencari virulensi)
pLBUC03 (88,48 % ID), pCIS4 (97,16 % ID), LBPp6 (100
% ID), LBPp1 (90,53 % ID)
Tidak ada
2.392.345 34.92 2.376 ULE383
Tidak ada
Nisin Z
ISP2 (98,66 % ID), ISLhe30 (94,72 % ID), ISLpl3 (99,53 % ID)
pLBUC03 (88,48 % ID), pCIS4 (97,16 % ID), LBPp6 (100
% ID), LBPp1 (90,53 % ID)
Tidak ada
Lactiplantibacillus plantarum
3.398.196 44,34 3405
(BAGEL4)
tidak ada CIpL (ID 98%)
ULE721
ISP1 (99,86 % ID), ISLhe30 (94,81 % ID), ISLpl1 (94,64 % ID), ISS1N (98,64 % ID)
Ketahanan aus pada sampel daging yang dimasak RTE (File tambahan 4A) Untuk menilai potensi bakteriosinogenik dari enam galur LAB, L. bulgaricus
LMG 6901 digunakan sebagai mikroorganisme indikator. L. lactis ULE383 adalah satu-satunya galur yang menunjukkan lingkaran cahaya penghambatan setelah 24 dan 48 jam inkubasi, dengan aktivitas masing-masing 19 AU dan 20 AU (Gbr. 3A).
3.4. Potensi bakteriosinogenik dari strain
Selain itu, aktivitas penghambatan ini dipertahankan ketika L. lactis ULE383 tumbuh pada suhu antara 25 dan 37 ÿC selama 24 hingga 72 jam.
Keenam strain LAB mampu beradaptasi dengan setiap matriks makanan, mencapai jumlah ~1,3 log10 CFU/g lebih tinggi daripada yang diamati pada hari ke-0 (~7,6 log10 CFU/g) (Gbr. 4A). Pada daging ham yang dimasak, strain LAB menunjukkan pertumbuhan progresif selama penyimpanan, sementara pada daging cincang dan bahu babi panggang tidak ada pertumbuhan LAB tambahan yang diamati dari hari ke-5 hingga hari ke-10 penyimpanan, bahkan ketika ditemukan sedikit penurunan jumlah, kecuali untuk satu isolat pada bahu babi.
Perbedaan ini mungkin disebabkan oleh komposisi spesifik setiap produk.
Misalnya, daging cincang dan bahu babi panggang lebih kaya lemak, dengan demikian, fraksi hidrofobik dapat mengganggu pertumbuhan LAB (Macieira et al., 2018). Dalam hal ini, penelitian sedang dilakukan oleh berbagai kelompok investigasi untuk memastikan viabilitas LAB dan/atau metabolitnya dalam berbagai matriks atau polimer makanan untuk menjalankan tindakan antimikroba yang diinginkan (Castellano et al., 2017; Ghabraie et al., 2016; Xie et al., 2018).
Pada daging ham yang dimasak, penurunan pH lebih cepat terjadi dengan adanya LAB dibandingkan dengan yang diamati pada sampel tanpa penambahan strain LAB (Gbr. 4B). Selain itu, terjadi pengasaman yang lebih tajam pada produk ini dibandingkan pada daging babi panggang dan daging cincang. Tren penurunan pH dipertahankan pada daging ham yang dimasak hingga hari ke-10 penyimpanan, saat nilai pH terendah 4,7 diamati, sedangkan pada daging babi panggang, nilai pH tetap stabil pada 5,6–5,9 dari hari ke-5 hingga hari ke-10. Daging cincang menunjukkan nilai pH yang cukup stabil, antara 6,1 dan 6,5, sepanjang seluruh periode penyimpanan.
Produk, sampel daging ham, daging cincang, dan daging babi panggang yang diberi tambahan bumbu buatan dikemas dalam vakum dan disimpan. Analisis mikrobiologi dan pengukuran pH dan aw dilakukan pada hari ke-0, ke-5, dan ke-10 selama penyimpanan sampel.
organisasi gugus gen nisin Z, yang terdiri dari gen yang mengkode peptida inti, beberapa enzim modifikasi, imunitas, protein transpor dan pengatur.
Tidak ada halo penghambatan yang diamati pada galur LAB lainnya terhadap L.
bulgaricus LMG 6901 dalam skenario yang diuji. Oleh karena itu, L. lactis ULE383 adalah satu-satunya galur yang dipilih untuk penilaian terperinci potensi bakteriosinogeniknya.
Metabolit antimikroba dimurnikan dari CFS menggunakan Ekstraksi Fase Padat C18 dan HPLC fase terbalik (Gbr. 3Bi). Analisis MALDI TOF MS dari fraksi HPLC paling aktif yang sesuai dengan puncak yang keluar pada menit ke-21, tempat nisin Z biasanya keluar (Gbr. 3Bii), menunjukkan massa nisin Z yang diprediksi (yaitu, 3330 Da) (Gbr. 3Biii), yang menunjukkan bahwa L. lactis ULE383 adalah galur bakteriosinogenik yang menghasilkan nisin Z.
Untuk mengevaluasi potensi strain LAB terpilih sebagai agen biopreservasi yang menargetkan L. monocytogenes dalam daging olahan RTE
3.5. Potensi biopreservatif dari enam strain LAB terpilih dalam produk daging matang RTE
Gbr. 3. Penilaian potensi bakteriosinogenik dari enam galur LAB yang dipilih. A) Hasil uji sumur dalam agar untuk enam galur LAB, yang menunjukkan zona
penghambatan pertumbuhan L. lactis ULE383 terhadap galur indikator L. bulgaricus LMG 6901; B) Pemurnian nisin Z dari L. lactis ULE383: Bi) Kromatogram RP-HPLC, Bii) zona penghambatan sebagian kecil fraksi yang sesuai dengan puncak yang keluar pada menit ke-21 dan Biii) Spektrum massa fraksi aktif, yang menunjukkan puncak dengan massa 3330 Da, yang sesuai dengan nisin Z.
Gbr. 4. Hitungan mikrobiologis LAB (A), evolusi pH (B) dan potensi pertumbuhan L. monocytogenes (C) dengan adanya enam galur LAB terpilih (ULE383, ULE639, ULE721, ULE949, ULE1599 dan ULE1841) dalam daging ham matang, daging cincang dan daging babi panggang. Potensi pertumbuhan (C) menunjukkan perbedaan jumlah (log10 CFU/g) L. monocytogenes pada hari ke-5 atau ke-10 penyimpanan dibandingkan dengan hari ke-0. NC (kontrol negatif) adalah sampel tanpa penambahan L. monocytogenes atau LAB, dan PC (kontrol positif) adalah sampel yang diinokulasi dengan L. monocytogenes dan tanpa penambahan LAB. Sampel NC juga ditanam pada ALOA, dan L.
monocytogenes tidak terdeteksi. Hasil disajikan dengan nilai rata-rata ± simpangan baku.
Oleh karena itu, ada beberapa parameter yang dapat menentukan aktivitas pengawetan dan harus dipertimbangkan, seperti jenis daging dan bahan yang digunakan, konsentrasi strain LAB dan mikroorganisme target, atau pengaruh mikrobiota alami, kondisi pengemasan dan suhu penyimpanan, antara lain (Barcenilla et al., 2022).
Bila membandingkan aktivitas antimikroba strain LAB dalam produk daging dengan hasil penghambatan pertumbuhan yang diperoleh pada media agar, strain dengan hasil penghambatan lebih baik dalam pengujian spot-on-lawn dan/atau wells- in-agar tidak selalu menunjukkan penurunan tertinggi pada potensi pertumbuhan L.
monocytogenes dalam produk daging.
yang sebelumnya dilaporkan oleh penulis lain dalam produk daging serupa menggunakan LAB sebagai biopreservatif. Namun, analisis komparatif harus dilakukan dengan hati-hati karena temuan dalam literatur terkadang merujuk pada matriks makanan lain atau bahkan kondisi pengemasan yang berbeda, dan, sebagai hasilnya, hasil yang tampaknya tidak konsisten sering dilaporkan. Misalnya, Macieira et al. (2018) dan Zanette et al. (2015) menguji L. plantarum dalam sosis fermentasi dan memperoleh aktivitas antimikroba yang sangat berbeda terhadap L.
monocytogenes. Memang, sementara Zanette et al. (2015) melaporkan pengurangan populasi L. monocytogenes sebesar 1,7 log10 CFU/g, Macieira et al. (2018) tidak mengamati penghambatan tambahan setelah penambahan L. plantarum jika dibandingkan dengan sampel kontrol.
berkisar antara 0,969 hingga 0,995. Secara umum, aw sampel daging cincang dan daging babi panggang yang diinokulasi secara artifisial dengan LAB cenderung lebih rendah selama periode penyimpanan dibandingkan sampel yang tidak diinokulasi.
Secara keseluruhan, kondisi pH dan aw yang berlaku pada ketiga produk tersebut menguntungkan untuk mendukung pertumbuhan L. monocytogenes, yang sebelumnya telah dijelaskan tumbuh hingga pH 4,1 dan aw 0,90 (ÿ Incili et al., 2020).
Potensi pertumbuhan L. monocytogenes (perbedaan antara log10 CFU/g pada hari ke-5 atau hari ke-10, dan log10 CFU/g pada hari ke-0) ditunjukkan pada Gambar 4C. Pada sampel kontrol positif (diinokulasi dengan 2 log10 CFU/g L. monocytogenes tetapi tidak dengan LAB), potensi pertumbuhan L. monocytogenes dalam daging cincang dan ham matang sekitar 2 log10 CFU/g, baik pada hari ke-5 dan ke-10 penyimpanan, sementara itu sekitar ~1 log10 CFU/g pada daging babi panggang, yang membuktikan bahwa ketiga produk daging tersebut mendukung pertumbuhan patogen. Dalam sebagian besar kasus, inokulasi produk daging dengan galur LAB membantu mengendalikan pertumbuhan patogen sampai batas tertentu. Namun, penurunan potensi pertumbuhan L. monocytogenes berbeda di antara sampel dan/
atau galur yang diuji, dengan efek biopreservasi terbesar secara konsisten diamati pada daging ham yang dimasak dan yang terlemah pada bahu babi panggang.
Penurunan tertinggi dalam potensi pertumbuhan L. monocytogenes (yaitu, penurunan 1,9 log10 CFU/g) dicapai pada hari ke-10 pada daging ham yang dimasak dengan ULE721 dan pada daging cincang dengan ULE1841. Di sisi lain, pada bahu babi panggang, penurunan maksimum dalam potensi pertumbuhan adalah 0,6 log10 CFU/g untuk ULE721 pada hari ke-10.
Pengurangan potensi pertumbuhan yang dicapai sebanding dengan
Perbedaan ini dapat dikaitkan dengan matriks pangan yang merupakan ekosistem kompleks di mana populasi mikroba dan faktor eksternal berinteraksi sehingga mempengaruhi struktur komunitas, tidak seperti pengujian in vitro, yang
Potensi pertumbuhan L. monocytogenes dalam sampel tanpa penambahan LAB sudah mencapai 5 log10 CFU/g setelah 11 hari penyimpanan. Aktivitas anti-Listerial terkuat diamati ketika ketiga strain LAB diinokulasi sebagai campuran koktail pada konsentrasi tertinggi (8 log10 CFU /g), dengan penurunan yang luar biasa dalam potensi pertumbuhan patogen sebesar 4,6 dan 4,3 log10 CFU/g setelah 11 dan 20 hari inkubasi, masing-masing (Gbr. 5C). Sebaliknya, penurunan yang lebih rendah dalam pertumbuhan
3.6.1. Jumlah mikrobiologi dan pH daging ham yang dimasak dalam kemasan vakum dengan penambahan tiga strain bakteri asam laktat (dari L. lactis, L. paracasei, L. plantarum), dan campuran ketiganya, pada tiga konsentrasi yang berbeda.
3.6. Evaluasi terperinci melalui uji tantangan terhadap potensi biopreservatif dari tiga strain LAB terpilih dalam daging ham yang dimasak
Pertama, tiga strain yang dipilih diaplikasikan secara individual atau sebagai campuran pada permukaan ham yang diiris dan dimasak pada tiga konsentrasi berbeda dalam serangkaian uji tantangan di mana sampel yang diinokulasi disimpan dalam vakum selama 13 hari pada suhu 7 ÿC diikuti oleh 7 hari pada suhu 12 ÿC (Gbr. 5). Pada tiga konsentrasi yang diuji, LAB yang diinokulasi, keduanya
secara individu atau sebagai campuran, mampu tumbuh secara progresif selama seluruh periode penyimpanan hingga mencapai konsentrasi akhir sekitar 8–9 log10 CFU/g (Gbr. 5A). Hal ini menegaskan kemampuan galur LAB untuk beradaptasi dan tumbuh di lingkungan matriks pangan. Hebatnya, jumlah LAB untuk sampel kontrol negatif sekitar 2 log10 CFU/g pada hari ke-1, tetapi meningkat secara progresif hingga mencapai sekitar 8 log10 CFU/g pada hari ke-20 penyimpanan, mencapai tingkat yang sama dengan yang diamati untuk sampel ham matang yang diinokulasi secara artifisial.
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5B, pH daging ham yang dimasak menurun lebih cepat, sehingga mencapai nilai pH akhir yang lebih rendah, seiring dengan meningkatnya konsentrasi inokulum LAB, terutama ketika strain ditambahkan sebagai campuran, sehingga mencapai nilai pH 4,6 pada hari ke-20 penyimpanan. Aspek ini dapat merugikan dari segi palatabilitas.
Dengan mempertimbangkan hasil yang diperoleh untuk enam strain LAB dalam uji penghambatan in vitro dan aktivitas anti-Listerial yang ditunjukkannya dalam berbagai produk daging yang diteliti, L. lactis ULE383, L. paracasei ULE721 dan L. plantarum ULE1599 dipilih untuk melakukan uji biopreservasi terperinci pada daging ham yang dimasak.
kurang kompleks. Selain itu, semua parameter berbeda yang disebutkan di atas dapat mengganggu aktivitas LAB dan/atau metabolitnya dalam produk daging.
Gbr. 5. Evaluasi aplikasi tiga galur LAB terpilih (ULE383, ULE721, ULE1599), dan campuran ketiganya, pada konsentrasi berbeda (4, 6, dan 8 log10 CFU/g) pada ham matang. (A) Jumlah LAB; (B) evolusi pH pada hari ke-1, ke-11, dan ke-20 penyimpanan; dan (C) potensi pertumbuhan L. monocytogenes , yang menunjukkan perbedaan jumlah (log10 CFU/g) L. monocytogenes pada hari ke-11 dan ke-20 penyimpanan dibandingkan dengan hari ke-0. NC mengacu pada ham matang tanpa LAB atau inokulasi L. monocytogenes dan PC mengacu pada ham matang dengan inokulasi L. monocytogenes . Sampel NC juga ditanam pada ALOA, dan L.
monocytogenes tidak terdeteksi. Hasil disajikan dengan nilai rata-rata ± simpangan baku.
3.6.2. Ham yang dimasak dengan penambahan koktail LAB (8 log10 CFU/ g) dalam kondisi pengemasan yang berbeda: jumlah mikrobiologi, pH dan aw
Selama penyimpanan, LAB tumbuh secara progresif baik di bawah MAP maupun vakum hingga mencapai konsentrasi akhir 9 log10 CFU/g pada hari terakhir penyimpanan (Gbr. 6A). Ketika ham yang dimasak diperlakukan dengan HPP, LAB yang diinokulasi, atau LAB asli lainnya yang ada, menunjukkan keterlambatan pertumbuhan selama penyimpanan akibat efek tekanan. Efek serupa diamati dalam penelitian sebelumnya dengan ham yang dimasak dengan tekanan 400 dan 600 MPa (Han et al., 2011). Namun, pada hari ke-29, jumlah LAB tidak berbeda secara signifikan dari yang diamati untuk sampel yang disimpan di bawah
Mengingat aktivitas anti-Listerial yang kuat yang dicapai dengan tiga galur LAB yang diinokulasi pada 8 log10 CFU/g, uji coba baru dilakukan untuk mengevaluasi efek bioprotektif dalam kondisi pengemasan yang berbeda dalam studi yang lebih rinci. Dalam kasus ini, sampel dikemas dalam kondisi (i) vakum, (ii) pengemasan atmosfer termodifikasi (MAP), (iii) atau vakum yang diikuti oleh pemrosesan tekanan tinggi (HPP), dengan periode penyimpanan 19 hari pada suhu 7 ÿC diikuti oleh 10 hari pada suhu 12 ÿC.
Jumlah total psikrotrofik dalam sampel yang dikemas dalam vakum atau MAP tetap sekitar 8 log10 CFU/g selama semua periode penyimpanan, sementara jumlahnya secara signifikan lebih rendah ketika sampel diperlakukan dengan HPP setelah pengemasan (Gbr. 6B). Selain itu, jumlah bakteri psikrotrofik dalam sampel kontrol negatif tetap secara signifikan lebih rendah daripada yang ada pada sampel dengan LAB yang diinokulasi hingga hari ke-11. Sejak hari ke-20 dan seterusnya, sampel kontrol negatif yang dikemas dalam vakum atau MAP memiliki jumlah yang sama dengan yang ada pada sampel dengan tambahan LAB. Di sisi lain, total psikrotrof tetap secara signifikan lebih rendah dalam sampel kontrol negatif bertekanan daripada di sisa sampel hingga akhir periode penyimpanan.
pH sampel yang diinokulasi LAB menurun secara signifikan sejak hari ke-1 pada sampel yang disimpan dalam vakum atau MAP, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 6C. Namun, pada sampel bertekanan yang diinokulasi LAB, pH tetap stabil pada nilai di atas pH 5,9 hingga hari ke-20 penyimpanan, meskipun pada akhir periode penyimpanan pH menurun menjadi 4,6, serupa dengan sampel yang diinokulasi LAB lainnya. Penundaan penurunan pH ini dapat dikaitkan dengan efek merugikan dari tekanan terhadap pertumbuhan LAB. Demikian pula, Pavli et al.
(2019) memperoleh nilai pH yang jauh lebih tinggi pada ham yang dimasak yang diolah dengan HPP dibandingkan pada sampel yang tidak diolah.
vakum atau MAP. Sampel kontrol yang tidak diinokulasi menunjukkan jumlah LAB yang lebih rendah pada awal periode penyimpanan dibandingkan dengan sampel yang diinokulasi dengan campuran LAB, sementara jumlah LAB yang serupa diperoleh untuk semua kategori sampel pada akhir periode penyimpanan.
Potensi L. monocytogenes diperoleh ketika konsentrasi LAB yang digunakan lebih rendah (6 log10 CFU/g dan khususnya 4 log10 CFU/g). Selain itu, pada konsentrasi LAB tertinggi yang diuji, perbedaan diamati di antara galur yang digunakan secara individual, dengan ULE721 menjadi galur dengan aktivitas anti-Listerial tertinggi (pengurangan potensi pertumbuhan ~4 vs ~3 dan 0,4–1,7 log10 CFU /g untuk ULE383 dan ULE1599, masing-masing).
Potensi pertumbuhan L. monocytogenes pada media yang tidak diinokulasi
Gbr. 6. Aplikasi koktail strain LAB ULE383, ULE721 dan ULE1599 pada konsentrasi 8 log10 CFU/g pada ham matang dalam tiga kondisi pengemasan: vakum, pengemasan atmosfer termodifikasi (MAP), dan vakum serta Pemrosesan Tekanan Tinggi (HPP). A) Jumlah LAB, B) Jumlah total bakteri psikrotrofik, C) pH dan D) Potensi pertumbuhan L. monocytogenes , ditentukan dengan menghitung selisih antara jumlah (log10 CFU/g) L. monocytogenes pada hari ke-11, 20 dan 29 dan jumlah pada hari ke-0. NC mengacu pada ham matang tanpa LAB atau inokulasi L. monocytogenes dan PC LM mengacu pada ham matang dengan inokulasi L. monocytogenes . Sampel NC juga ditanam pada ALOA, dan L. monocytogenes tidak terdeteksi. Hasil disajikan dengan nilai rata-rata ± simpangan baku.
