SELEKSI DAN OPTIMASI BAKTERI ASAM LAKTAT
PENGHASIL SENYAWA ANTIKAPANG
Rohmatussolihat
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Seleksi dan Optimasi Bakteri Asam Laktat Penghasil Senyawa Antikapang adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Juli 2013
Rohmatussolihat
RINGKASAN
ROHMATUSSOLIHAT. Seleksi dan Optimasi Bakteri Asam Laktat Penghasil Senyawa Antikapang. Dibimbing oleh NISA RACHMANIA MUBARIK dan ENDANG SUKARA.
Silase merupakan pengawetan hijauan pakan melalui proses fermentasi anaerobik oleh bakteri asam laktat (BAL). Jika ada oksigen maka mikrob selain BAL menjadi aktif dan tumbuh berkembangbiak sehingga menyebabkan kegagalan proses fermentasi silase. Kapang merupakan mikrob yang sering menjadi kontaminan silase dan bertanggung jawab terhadap kegagalan proses pembuatan silase. Pencegahan terjadinya kontaminasi silase oleh kapang di Indonesia sangat penting dalam upaya mendukung usaha peternakan. Salah satu upaya yang dapat dilakukan dengan menggunakan inokulum BAL yang mempunyai kemampuan menghasilkan senyawa antikapang.
Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan galur BAL yang mampu menghambat pertumbuhan kapang, identifikasi BAL terseleksi, dan optimasi medium untuk produksi senyawa antikapang (asam laktat) dari BAL terseleksi dengan menggunakan Response Surface Method (RSM).
Penapisan awal dengan menggunakan plate assay method (kondisi aerobik)
yaitu BAL, Aspergillus fumigatus, A. flavus, dan Penicillium ditumbuhkan pada
media de Man Rogosa Sharpe (MRSA), dan diverifikasi dengan menggunakan deep tube technique (kondisi anerobik). Hasil penapisan menunjukan bahwa isolat
DR 1-6-2 mampu menghambat kapang A. fumigatus dan A. flavus pada kondisi
aerobik dengan persentase penghambatan masing-masing sebesar 41% and 32%. Pada kondisi anaerobik isolat DR-1-6-2 tidak hanya mampu menghambat A. fumigatus dan A. flavus tetapi juga Penicillium. Identifikasi BAL terseleksi
berdasarkan sekuen gen 16S rRNA dengan menggunakan primer 27F dan1492R. Berdasarkan analisis molekuler, isolat DR 1-6-2 adalah Lactobacillus plantarum
dengan nilai homologi sebesar 98%. Optimasi produksi senyawa antikapang dari BAL terseleksi menggunakan Response Surface Method (RSM) dan rancangan
percobaan Central Composite Design (CCD) dengan lima variabel (glukosa,
ekstrak khamir, CH3COONa, K2HPO4, dan Tween 80) dan lima taraf kombinasi.
Hasil analisis statistik menunjukkan bahwa produksi antikapang yang direpresentasikan dengan produksi total asam laktat dari BAL terseleksi secara signifikan dipengaruhi oleh glukosa, kombinasi glukosa dan K2HPO4, kombinasi
ekstrak khamir dan K2HPO4, dan Tween 80. Konsentrasi optimum dari glukosa
sebesar 2,91%, 0,58% ekstrak khamir, 0,29% K2HPO4, dan 0,19% Tween 80
dengan prediksi maksimum asam laktat sebesar 2,61%, meningkat sebesar 59%. Hasil tersebut telah dikonfirmasi menggunakan media pada kondisi optimum. Produksi asam laktat meningkat sebesar 58%.
Dalam pembuatan silase dengan menggunakan L. plantarum DR 1-6-2,
kondisi anerobik merupakan syarat yang perlu diperhatikan. Identifikasi lebih lanjut senyawa antikapang lainnya yang diproduksi oleh L. plantarum DR 1-6- 2
perlu dilakukan.
SUMMARY
ROHMATUSSOLIHAT. Selection and Optimization of Lactic Acid Bacteria having Antifungal Properties. Supervised by NISA RACHMANIA MUBARIK
and ENDANG SUKARA.
Silage is the forage preservation product through anaerobic fermentation by using lactic acid bacteria (LAB). The presence of oxygen may activate the other microbe that could be contaminate and interrupt the silage processing. Fungi is a microbe that often contaminate silage processing. In Indonesia, prevention of silage contamination by fungi is necessary in order to support livestock business. By using the inoculum that able to produce antifungal compounds, the fungi contamination could be prevented. This research was dedicated to screen LAB having antifungal properties, taxonomic study and optimization of antifungal production.
Screening of antifungal producing LAB was initiated by growing LAB on
de Man Rogosa Sharpe Agar (MRSA) against Aspergillus fumigatus, A. flavus,
and Penicillium by plate assay method (aerobic condition) and verified by deep
tube technique (anerobic condition). The results showed that strain DR 1-6-2 could inhibit A. fumigatus and A. flavus in aerobic condition with percentage of
inhibition was 41% and 32 %, respectively. In anaerobic condition, strain DR 1-6-2 could inhibit not only A. fumigatus, A. flavus, but also Penicillium.
Identification of selected LAB was carried out using 16S rRNA gene sequencing with 27F and 1492R primer. Based on molecular analysis, strain DR 1-6-2 is belong to Lactobacillus plantarum with the degree of homology of 98%.
Optimization of antifungal production by selected LAB was carried out using Response Surface Method (RSM) with Central Composite Design (CCD) on five variables (glucose, yeast extract, CH3COONa, K2HPO4, Tween 80) and five level
combinations. From statistical analysis, the production of antifungal which is represented by the total lactic acid production of selected LAB is significantly influenced by glucose, combination of glucose and K2HPO4, combination of yeast
extract and K2HPO4 and Tween 80. The optimum concentration of glucose is
2.91%, yeast extract 0.58%, K2HPO4 0.29% and Tween 80 0.19% with a
maximum predicted lactic acid yield of 2.61%, which is increased by 59%. This result is confirmed when the optimum concentration of nutritions used. The production of lactic acid increased by 58%.
Benefit of this research is utilization of indegenous LAB isolates as the silage inoculum and antifungi to prevention of contamination and to obtain a good silage quality. This LAB utilization is capable to trigger the silage production, which in turn could increase the silage utilization as animal feed, increasing the production of meat, and could support the government's efforts to achieve the national demand of meat product.
In silage fermentation using L. plantarum DR 1-6-2, anaerobic condition is
a requirement to be considered. Identification of other antifungal compounds produced by L. plantarum DR1-6-2 is need to be studied.
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2013
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan IPB
SELEKSI DAN OPTIMASI BAKTERI ASAM LAKTAT
PENGHASIL SENYAWA ANTIKAPANG
ROHMATUSSOLIHAT
Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada
Program Studi Bioteknologi
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
Judul Tesis : Seleksi dan Optimasi Bakteri Asam Laktat Penghasil Senyawa
Antikapang Nama : Rohmatussolihat NIM : P051100091
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Dr Nisa Rachmania Mubarik Ketua
Prof Dr Endang Sukara Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi Bioteknologi
Prof Dr Suharsono DEA
Dekan Sekolah Pascasarjana
Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr
Tanggal Ujian: 1 Juli 2013
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan April 2012 ini adalah teknologi pakan, dengan judul Seleksi dan Optimasi Bakteri Asam Laktat Penghasil Senyawa Antikapang.
Dengan Segala kerendahan hati, penulis menghaturkan terima kasih dan rasa hormat yang sebesar-besarnya kepada Ibu Dr Nisa Rachmania Mubarik dan Prof Dr Endang Sukara sebagai komisi pembimbing yang dengan penuh kesabaran meluangkan waktu dan memberikan motivasi, bimbingan, arahan dan masukan pada penulis, serta Ibu Dr Yantyati Widyastuti yang telah banyak memberi saran. Penulis menghaturkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Prof Dr Djumali Mangunwidjaja sebagai penguji atas masukan dan sarannya. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Kementrian Negara Riset dan Teknologi (KNRT) atas bantuan dana dan kesempatan yang diberikan kepada penulis melalui program Beasiswa KNRT 2010. Terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) yang telah memberikan tugas belajar bagi penulis.
Terima kasih kepada saudari Yulianti Hasanah dari Stat Center Dramaga yang telah membantu mengolah data serta Gytha Nafisah Sukara atas bantuannya dalam pengambilan foto hasil penelitian. Terima kasih juga kepada teman-teman di program Studi Bioteknologi IPB dan di Pusat Penelitian Bioteknologi-LIPI. Ungkapan terima kasih disampaikan kepada Bapak, Mama, Suami, adik-adik serta seluruh keluarga, atas segala doa dan kasih sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Juli 2013
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL xii
DAFTAR GAMBAR xii
DAFTAR LAMPIRAN xiii
1 PENDAHULUAN 1
Latar Belakang 1
Perumusan Masalah 3
Tujuan Penelitian 3
Manfaat Penelitian 3
2 TINJAUAN PUSTAKA 4
Bakteri Asam Laktat 4
Produk Fermentasi Bakteri Asam Laktat 5 Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Produksi Senyawa Antikapang 7 Mekanisme Penghambatan Senyawa Antikapang 8
Response Surface Method (RSM) 8
3 METODE 9
Waktu dan Tempat Penelitian 9
Bahan 9
Prosedur Analisis Data 9 Pemeliharaan dan Pertumbuhan Mikroorganisme 9 Penapisan Beberapa Galur BAL Penghasil Senyawa Antikapang 10 Identifikasi Bakteri Asam Laktat Terseleksi 10 Optimasi Produksi Senyawa Antikapang 11
4 HASIL DAN PEMBAHASAN 12
Hasil 12
Penapisan Beberapa Galur Bakteri Asam Laktat Penghasil
Senyawa Antikapang 12
Identifikasi Bakteri Asam Laktat Terseleksi 13 Optimasi Produksi Senyawa Antikapang 14
Pembahasan 20
5 SIMPULAN DAN SARAN 23
DAFTAR PUSTAKA 25
DAFTAR TABEL
1 Kombinasi lima variabel dan lima tingkat kombinasi percobaan
dengan Central Composite Design 11
2 Isolat bakteri asam laktat yang mempunyai kekerabatan yang dekat
dengan isolat DR-1--6-2 14
3 ANOVA untuk Response Surface Quadratic 15
DAFTAR GAMBAR
1 Jalur fermentasi bakteri asam laktat homofermentatif (a) dan jalur fermentasi bakteri asam laktat heterofermentatif (b)
5
2 Ringkasan dari beberapa senyawa antikapang dari BAL 7 3 Pengujian penghambatan pertumbuhan A. fumigatus, A.flavus, dan
Penicillium oleh enam galur BAL pada media MRS agar, diinkubasi
pada suhu 30 °C selama lima hari
12
4 Pengujian penghambatan A. fumigatus, A. flavus, dan Penicillium
oleh isolat BAL DR 1-6-2 menggunakan media MRSA tegak. Isolat BAL DR 1-6-2 dan kapang uji ditumbuhkan bersamaan pada MRSA dan diinkubasi pada suhu 30 °C selama lima hari
13
5 Pita gen 16S rRNA berukuran ± 1600 basa dari isolat DR-1-6-2 menggunakan gel elektroforesis
13
6 Pohon filogenetik dari isolat DR 1-6-2 14 7 Response surface plots bentuk tiga dimensi (a) dan bentuk contour
(b) yang menggambarkan pengaruh konsentrasi glukosa dan Tween 80 terhadap konsentrasi total asam laktat tertitrasi
17
8 Response surface plots bentuk tiga dimensi (a) dan bentuk contour
(b) yang menggambarkan pengaruh konsentrasi glukosa dan K2HPO4 terhadap konsentrasi total asam laktat tertitrasi
18
9 Response surface plots bentuk tiga dimensi (a) dan bentuk contour
(b) yang menggambarkan pengaruh konsentrasi ekstrak khamir dan K2HPO4 terhadap konsentrasi total asam laktat tertitrasi
19
10 Pengaruh konsentrasi glukosa terhadap konsentrasi total asam laktat tertitrasi
20
DAFTAR LAMPIRAN
1 Rumus Penghitungan indeks penghambatan dan persentase
penghambatan (Fokkema 1973) 30 2 Indeks penghambatan dan persentase penghambatan (metode
Fokkema 1973) dari hasil penapisan dengan menggunakan metode
plate assay method 30
3 Kromatogram dari gen penyandi 16S rRNA isolat DR 1-6-2 31 4 Hasil amplifikasi dari gen penyandi 16S rRNA isolat DR 1-6-2 32 5 Central Composite Design (CCD) lima variabel dengan lima level
Kombinasi 33
6 Koefisien regresi & signifikansi dari model Response Surface
1
1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kebutuhan pakan ternak di Indonesia semakin meningkat seiring dengan peningkatan jumlah peternak untuk memenuhi semakin tingginya kebutuhan daging nasional. Pakan ternak yang umumnya digunakan oleh peternak ialah hijauan, yaitu rumput, jagung, legum, jerami, dan alfalfa. Ketersediaan pakan ternak di Indonesia umumnya melimpah pada saat musim hujan namun berkurang pada musim kemarau. Untuk memenuhi ketersediaan pakan sepanjang tahun, diperlukan teknologi tertentu untuk mengawetkan cadangan pakan yang diperoleh selama musim hujan. Pengawetan pakan melalui proses fermentasi anaerob oleh bakteri asam laktat (BAL) yang kemudian dikenal dengan silase merupakan cara yang paling banyak dipraktekkan. Pada kenyataannya, pengawetan seperti ini telah digunakan di seluruh dunia karena teknologinya sederhana dan efektif untuk mengawetkan pakan ternak.
Proses ensilase didasarkan pada prinsip fermentasi asam laktat secara alami oleh mikrob yang dijumpai di hijauan, yaitu BAL di bawah kondisi anaerobik. Proses ini dapat menurunkan pH sampai pada tingkat Clostridial dan kapang
terhambat pertumbuhannya (Sparo dan Mallo 2001; Storm et al. 2008). Proses
fermentasi silase dilakukan dalam kondisi anaerob atau tidak ada oksigen. Jika ada oksigen maka mikrob selain BAL menjadi aktif dan tumbuh berkembangbiak. Kondisi ini berkaitan dengan terkonsumsinya nutrisi terutama karbohidrat oleh mikrob selain BAL untuk proses pertumbuhannya. Dengan demikian, jumlah nutrisi untuk pertumbuhan BAL berkurang drastis dan produksi asam laktat tidak sesuai dengan harapan. Jika ini terjadi, maka proses pembuatan silase terganggu bahkan berujung pada kegagalan.
Kapang merupakan salah satu mikrob yang sering mengkontaminasi silase dan bertanggung jawab terhadap kegagalan proses pembuatan silase. Kapang yang umum dijumpai mengganggu proses pembuatan silase di antaranya ialah genus
Fusarium, Penicillium, Aspergillus, Alternaria, Mucor, dan Rhizopus (Adams
2008; Storm et al. 2008). Storm et al. (2008) dan Whitlow dan Hagler (2010)
lebih jauh, melaporkan bahwa Aspergillus dapat menghasilkan toksin
(mikotoksin) yaitu aflatoksin, deoksinivalenol, zearalenon, dan T2 toksin. Sementara itu, Fusarium menghasilkan fumonisin, kapang Penicillium
menghasilkan okratoksin, asam mikofenolat dan roquefortin C. Kehadiran toksin (mikotoksin) di dalam pakan ternak sangat tidak menguntungkan. Oleh karena itu, kehadiran kapang tidak hanya menyebabkan proses pembentukan silase tidak terjadi, tetapi juga dapat mengganggu kesehatan ternak. Jika hal ini terjadi, dipastikan akan mengakibatkan kerugian ekonomi yang besar di bidang peternakan (Schnürer dan Magnuson 2005).
Senyawa toksin (mikotoksin) yang dihasilkan oleh kapang dapat mengakibatkan gangguan kesehatan berupa mikosis bagi hewan. Mikosis dapat menginfeksi paru-paru, kelenjar susu, rahim, dan usus atau hemorrhagic bowel syndrome (HBS) (Santos et al. 2002; Whitlow dan Hagler 2010). Pada hewan
2
produksi susu pada sapi perah, menurunkan ketahanan terhadap infeksi penyakit, mengurangi efektivitas vaksinasi, dan menginduksi kerusakan pada hati dan organ lainnya (Coulombe 1993; Ranjit dan Kung 2000; Adams 2008). Selain itu, juga dapat beresiko terhadap manusia melalui susu dan daging yang dikonsumsi (Storm et al. 2008).
Di alam, pertumbuhan kapang dan produksi mikotoksin biasanya berhubungan dengan kondisi cuaca yang ekstrem yang menyebabkan tanaman menjadi stres. Pertumbuhan kapang juga dapat dipicu jika terjadi proses hidrasi bahan pakan, penyimpanan pakan yang buruk, dan masalah transportasi (Whitlow dan Hagler 2010). Iklim tropis yang dimiliki Indonesia dengan curah hujan, suhu, dan kelembaban yang tinggi juga sangat mendukung pertumbuhan kapang tersebut.
Pencegahan terjadinya kontaminasi silase oleh kapang di Indonesia sangat penting dalam upaya mendukung usaha peternakan. Salah satu upaya yang dapat dilakukan adalah dengan menggunakan inokulum BAL pada proses pembuatan silase. Penambahan BAL sebagai inokulum silase juga bertujuan untuk memastikan fermentasi berlangsung dengan baik, meningkatkan produksi asam laktat, menurunkan pH, meningkatkan nilai gizi dan dapat menghambat mikroorganisme lain (Parvin et al. 2010).
Penggunaan BAL pada proses pembuatan silase akan menjadi sangat menarik karena beberapa galur BAL diketahui memiliki kemampuan menghasilkan senyawa antikapang sehingga mampu menghambat pertumbuhan kapang. Lavermicocca et al. (2000) dan Prema et al. (2010), melaporkan bahwa L. plantarum mampu menghasilkan asam laktat, asam asetat, asam 4-hidroksi
fenillaktat, dan asam fenillaktat yang ke empat-empatnya mampu menghambat pertumbuhan kapang Penicillium, Aspergillus, Eurotium, dan Fusarium. Hal ini
diperkuat oleh penelitian Peláez et al. (2012) yang menjelaskan bahwa terdapat
hubungan yang sinergis antara asam asetat dan asam laktat dalam menghambat pertumbuhan kapang A. flavus.
Sementara itu Magnuson et al. (2003) melaporkan bahwa L. plantarum
yang diisolasi dari silase mempunyai kemampuan menghasilkan dipeptida siklik yang juga bersifati senyawa antikapang. Lactobacillus plantarum MiLAB 14 telah
berhasil diisolasi dari bunga lila mempunyai kemampuan menghasilkan senyawa antikapang yaitu asam 3-(R)-hidroksidekanoat, asam 3-hidroksi-5-cis-dodekenoat,
asam 3-(R) hidroksidodekanoat dan asam 3-(R) hidroksitetradekanoat. Senyawa
tersebut dapat menghambat kapang A. fumigatus (Sjögren et al. 2003).
Senyawa antikapang yang dihasilkan oleh BAL tidak hanya penting dalam proses pembuatan silase. Senyawa ini dapat juga digunakan sebagai pengganti pengawet kimia pada berbagai produk makanan seperti keju, roti, cereal atau gandum, dan daging. Penggunaan BAL dan antikapang yang dihasilkannya kemungkinan besar dapat dimanfaatkan dalam industri pakan dan pangan. Penelitian yang dilakukan oleh Rizzello et al. (2011) mengungkapkan bahwa
gandum yang difermentasi oleh sourdough (SFWG) yang mempunyai
kemampuan menghasilkan senyawa antikapang digunakan sebagai bahan untuk membuat roti. Roti yang ditambahkan 4% SFWG, tidak menunjukkan kontaminasi kapang setelah 28 hari penyimpanan di suhu ruang. Penelitian yang dilakukan oleh Ryan et al. (2011) menjelaskan bahwa roti yang dibuat dengan
3
simpan lebih lama dibandingkan dengan menggunakan kalsium propionat. Cizeikiene et al. (2013), menjelaskan bahwa senyawa antikapang yang dihasilkan
BAL memiliki kemampuan untuk menghambat kontaminasi kapang pada gandum yang akan dipakai sebagai bahan baku pembuatan roti. Senyawa antikapang yang dihasilkan oleh L. plantarum mampu meningkatkan kualitas dan masa simpan roti
gandum (Bello et al. 2007). Penelitian yang dilakukan oleh Illaningtyas (2003)
mengungkapkan senyawa antikapang yang dihasilkan oleh BAL mampu menghambat pertumbuhan kapang yang mengkontaminasi keju.
Beberapa galur BAL yang dimiliki oleh Biotechnology Culture Collection
(BTCC) Pusat Penelitian Bioteknologi-LIPI telah digunakan sebagai inokulum untuk pembuatan silase. Penambahan inokulum mikrob tersebut mampu menghasilkan silase dengan kualitas yang baik dan tidak terjadi kontaminasi oleh kapang (Ratnakomala et al. 2006; Ridwan et al. 2005). Namun demikian
penelitian tentang kemampuan BAL koleksi BTCC sebagai penghasil senyawa antikapang belum dilakukan. Oleh karena itu, penelitian yang lebih mendalam terhadap beberapa galur BAL koleksi BTCC terutama optimasi produksi senyawa antikapang menggunakan metode respon permukaan (RSM) penting dilakukan. Penggunaan RSM bertujuan untuk mengoptimalkan respon dalam percobaan atau untuk membuat suatu model empirik untuk mengoptimasi kondisi produksi.
Perumusan Masalah
Silase sering terkontaminasi kapang sehingga proses pembentukan silase tidak terjadi. Silase yang terkontaminasi jika dikonsumsi ternak akan mengganggu kesehatan ternak. Beberapa galur BAL diketahui memiliki kemampuan menghasilkan senyawa antikapang sehingga aplikasi senyawa antikapang dan atau galur BAL ini mampu menghambat pertumbuhan kapang pada proses pembuatan silase dan memberikan jaminan keberhasilan produksi silase lebih tinggi.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan galur BAL yang mampu menghambat pertumbuhan kapang, identifikasi BAL terseleksi, dan optimasi medium untuk produksi senyawa antikapang (asam laktat) dari BAL terseleksi dengan menggunakan Response Surface Method (RSM).
Manfaat Penelitian
4
2 TINJAUAN PUSTAKA
Bakteri Asam Laktat
Taksonomi
Bakteri asam laktat merupakan grup bakteri Gram positif, tidak berspora, berbentuk bulat atau batang, dan menghasilkan asam laktat sebagai produk akhir selama fermentasi karbohidrat. Bakteri asam laktat berkaitan erat dengan bakteri yang terlibat dalam fermentasi makanan dan pakan, termasuk bakteri yang berhubungan dengan permukaan mukosal pada manusia dan hewan.
Bakteri asam laktat dikelompokan menjadi 21 genus yaitu Lactobacillus, Carnobacterium, Leuconostoc, Oenococcus, Weissella, Pediococcus, Aerococcus, Tetragenoecuccus, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Vagococcus, Alloiococcus, Dolosigranulum, Globicatella, Lactosphaera, Dossilococcus, Eremococcus, Facklamia, Helcococcus,dan Ignavigranum (Axelsson 2004).
Pengelompokan BAL secara klasik yaitu berdasarkan morfologi, fermentasi glukosa, pertumbuhan pada suhu yang berbeda, konfigurasi asam laktat yang dihasilkan, kemampuan tumbuh pada konsentrasi garam yang tinggi, dan tahan terhadap asam dan basa. Pendekatan baru berdasarkan kemotaksonomi seperti komposisi asam lemak, motilitas, sekuens rRNA, dan homologi DNA-DNA (Axelsson 2004).
Metabolisme Bakteri Asam Laktat
Berdasarkan hasil metabolisme glukosa, BAL terbagi menjadi dua golongan, yaitu homofermentatif dan heterofermentatif (Axelsson 2004). Bakteri asam laktat yang hanya memproduksi asam laktat melalui jalur glikolisis disebut homofermentatif, sedangkan yang memproduksi zat-zat lain di samping asam laktat (asam laktat terbanyak) melalui fosfoketolase disebut heterofermentatif (Gambar 1). Bakteri asam laktat yangtermasuk dalam kelompok homofermentatif yaitu Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus, Pediococcus, and grup I Lactobacilli. Leuconostoc, Oenococci, Weissela dan beberapa Lactobacilli
termasuk kelompok bakteri heterofermentatif (Axelsson 2004). Bakteri asam laktat homoferementatif mengubah satu mol glukosa menjadi dua mol piruvat yang selanjutnya diubah menjadi laktat melalui jalur Embden-Meyerhof-Parnas.
Proses tersebut menghasilkan 2 ATP dari satu mol glukosa yang dikonsumsi tetapi tidak menghasilkan CO2.
Metabolisme glukosa dari BAL heterofermentatif menggunakan jalur 6-fosfoglukonat/fosfoketolase. Selain menghasilkan asam laktat, BAL heterofermentatif juga menghasilkan etanol, CO2, asam asetat, dan manitol serta
5
Gambar 1 Jalur fermentasi bakteri asam laktat homofermentatif (a), jalur fermentasi bakteri asam laktat heterofermentatif (b) (Axelsson 2004).
Produk Fermentasi Bakteri Asam Laktat
Asam organik
Asam organik merupakan produk akhir dari metabolisme karbohidrat yang dihasilkan oleh BAL. Asam laktat dan asetat adalah produk utama dari fermentasi karbohidrat BAL (Magnuson 2003; Prema et al. 2010; Pelaez et al. 2012).
Bakteri asam laktat heterofermentatif menghasilkan asam asetat dalam jumlah yang relatif tinggi dengan adanya akseptor elektron eksternal, sedangkan asam propionat hanya diproduksi dalam jumlah yang sedikit dan memiliki nilai pKa lebih tinggi dari asam laktat. Hampir sama dengan asam laktat, asam asetat dan propionat berinteraksi dengan membran sel untuk menetralkan gradien proton elektrokimia, tetapi pengaruh dari asam asetat dan propionat sering tergantung pada penurunan pH yang disebabkan oleh asam laktat. Asam propionat secara negatif mempengaruhi pertumbuhan jamur, terutama pada pH rendah, dan mempengaruhi membran kapang pada nilai pH di bawah 4,5. Asam propionat dan asetat juga mampu menghambat penyerapan asam amino. Beberapa garam dari asam propionat, seperti natrium propionat dan amonium propionat menunjukkan efek yang sama terhadap khamir dan kapang pada pH rendah (Magnuson 2003; Ouwehand dan Vesterlund 2004).
Hidrogen Peroksida
Sebagian besar BAL memiliki flavoprotein oksidase dan NADH peroksidase, dengan adanya oksigen memungkinkan BAL untuk menghasilkan hidrogen peroksida (H2O2). Hidrogen peroksida terakumulasi di lingkungan
karena BAL tidak menghasilkan katalase (Condon 1987). Pengaruh antimikrob dari hidrogen peroksida dihubungkan dengan pengaruh oksidasi yang kuat pada sel bakteri, serta penghancuran struktur molekul dasar seluler protein. Pengaruh antimikrob dari hidrogen peroksida diperkuat oleh adanya laktoperoksidase dan tiosianat dalam lingkungan alami seperti susu dan air liur (Condon 1987; Ouwehand dan Vesterlund 2004). Reaksi hidrogen peroksida dan tiosianat dikatalisis oleh laktoperoksidase. Produk perantara seperti hipothiosianat bertindak sebagai penghambat mikroorganisme lainnya (Magnuson 2003; Ouwehand dan Vesterlund 2004).
6
Diasetil
Diasetil (2,3-butanadion) merupakan molekul yang bertanggung jawab atas karakteristik aroma mentega. Senyawa tersebut dihasilkan oleh galur dari semua genera BAL selama fermentasi sitrat. Pengaruh antimikrob dari diasetil terutama pada pH di bawah 7,0, diperlukan jumlah diasetil yang tinggi (± 200 mM) untuk aktivitas antimikrob, tetapi dapat mengubah rasa dan aroma produk (Ouwehand dan Vesterlund 2004).
Senyawa Proteinaceous
Banyak sekali hasil penelitian mengenai bakteriosin yang sudah dikarakterisasi yang dihasilkan oleh BAL. Sebaliknya hanya beberapa laporan mengenai produksi peptida antikapang yang diproduksi oleh BAL. Beberapa penulis telah melaporkan bahwa aktivitas antikapang dari BAL hilang setelah perlakuan dengan enzim proteolitik. Roy et al. (1996) telah mengisolasi Lactococcus lactis subsp. lactis dengan aktivitas antagonis terhadap beberapa
kapang. Setelah perlakuan secara enzimatik dengan kimotripsin, tripsin dan pronase E, aktivitas antikapang menghilang. Hal tersebut menunjukkan bahwa senyawa antikapang ialah protein. Beberapa galur BAL seperti L. lactis subsp. lactis, L. casei subsp. Pseudoplantarum dan P. pentosaceous menghasilkan
metabolit antikapang yang sensitif terhadap enzim proteolitik.
Magnuson dan Schnürer (2001) menemukan senyawa proteinaceous dihasilkan oleh L. coryniformis subsp. coryniformis strain Si3 yang mempunyai
pengaruh antikapang terhadap beberapa kapang dan khamir Debaromyces hansenii dan Kluyveromyces marxianus. Peptida tersebut mempunyai ukuran yang
kecil (kira-kira 3 kDa), tahan terhadap panas, aktif pada kisaran pH 3-6 dan akan menjadi tidak aktif oleh proteinase K atau tripsin. Jika kultur L. coryniformis galur
Si3 ditambahkan etanol, asam format atau asetat maka jumlah peptida antikapang meningkat (Magnuson 2003).
Senyawa dengan Berat Molekul (BM) Rendah
Beberapa penulis telah melaporkan senyawa antikapang yang memiliki BM rendah seperti reuterin dan asam lemak, tetapi hanya sedikit yang melakukan pemurnian dan karakterisasi senyawa tersebut.
Reuterin
Reuterin (3–hidroksipropionaldehid) merupakan salah satu contoh senyawa dengan BM rendah. Reuterin merupakan produk dari fermentasi gliserol yang dihasilkan oleh L. coryniformis (Magnusson et al. 2003), L. reuteri, L. brevis, L. buchneri, L. collinoides dalam kondisi anaerobik (Dalie et al. 2010). Senyawa ini
7
Asam Lemak
Beberapa BAL dapat menghasilkan asam lemak. Asam kaproat diisolasi dari L. sanfrancisco CB1 adalah antikapang yang ampuh. Senyawa ini bersinergi
dengan asam lainnya seperti propionat, asam butirat dan asam valerat. Sjögren et al. (2003) menemukan senyawa asam lemak yaitu asam 3-hidroksidekanoat
(mirmikasin, 3-HDA), asam 3-hidroksidodekanoat, asam 3-hidroksitetradekanoat dan asam 3-hidroksi-5-cis-dodekanoat yang diisolasi dari supernatan BAL.
Dipeptida Siklik dan Senyawa Penghambat dengan BM Rendah Lainnya
Beberapa penelitian mengungkapkan bahwa BAL menghasilkan senyawa dipeptida siklik dan senyawa penghambat dengan BM rendah. Lactobacillus plantarum VTT E-78076 menghasilkan senyawa antimikrob yaitu asam benzoat,
5-metil-2-4-imidazolidinedion (metilhidantoin), siklo (glisil-L-leusil) dan tetrahidro-4-hidroksi-4-metil-2H-pyran-2-one (mevalonolakton) dan 3-(2-methylpropyl)-2,5-piperazindion (Niku-Paavola et al. 1999). Sedangkan
penelitian Ström et al. (2002) melaporkan L. plantarum MiLAB 393
memproduksi 2 siklik siklo dipeptida yaitu Phe-Pro dan Phe-OH-Pro. Lavermicocca et al. (2000) mengungkapkan bahwa L. plantarum 21b
menghasilkan asam fenillaktik dan asam 4-hidroksifenillaktik yang mempunyai aktivitas antikapang.
Gambar 2 Ringkasan dari beberapa senyawa antikapang dari bakteria asam laktat (Magnuson 2003).
Faktor-Faktor Yang Mempengaruhi Produksi Senyawa Antikapang
Media Pertumbuhan
Beberapa informasi yang diketahui tentang dampak dari medium pertumbuhan pada produksi metabolit antikapang oleh BAL. Media Elliker broth
merupakan media terbaik untuk produksi senyawa antikapang yang dihasilkan oleh L. lactis subsp. lactis terhadap A. flavus dibandingkan dengan media M17
dan MRS. Selain itu, dalam kultur media susu, L. lactis subsp. diacetylactis
8
Nutrisi
Beberapa penelitian menunjukkan bahwa ekstrak khamir, glukosa, NaCl dan CaCl2 memodulasi produksi antikapang. Penambahan sampai dengan 1% dan 2%
glukosa menyebabkan bertambahnya produksi metabolit antikapang oleh P. acidilactic dan L. rhamnosus (Dalie et al. 2010).
Suhu dan Waktu Inkubasi
Suhu dan masa inkubasi merupakan faktor penting yang memodulasi pertumbuhan BAL dan secara signifikan mempengaruhi jumlah metabolit antikapang yang dihasilkan.
pH
Kondisi pH sangat memodulasi produksi metabolit antikapang. L. lactis
subsp. diacetylactis mampu menghasilkan antikapang dalam rentang pH (5,5-7),
meskipun produksi maksimal terjadi pada pH 6,8. Efek pH terbukti terkait dengan banyak faktor seperti substrat, periode inkubasi, suhu, galur kapang, dan terjadinya persaingan mikroflora (Dalie et al. 2010).
Mekanisme Penghambatan Senyawa Antikapang
Menurut Magnusson et al. (2003), terdapat tiga mekanisme yang
menjelaskan efisiensi antimikrob dari BAL yaitu asam organik yang dihasilkan, kompetisi nutrisi, dan produksi senyawa antagonis. Senyawa yang dapat menghambat pertumbuhan kapang sangat penting untuk mengontrol patogen pada manusia dan hewan serta pencegahan terhadap pertumbuhan kapang pada makanan dan pakan (silase).
Antimikrob (antikapang) didefinisikan sebagai senyawa yang diproduksi oleh mikroorganisme yang dapat membunuh atau menghambat pertumbuhan mikroorganisme lain pada konsentrasi rendah. Beberapa senyawa antikapang mempunyai situs khusus dalam aksi penghambatannya terhadap kapang. Target penghambatan senyawa antikapang yaitu dinding sel, sel membran, sintesis protein dan pembelahan sel. Senyawa antikapang menghambat sintesis β-glukan dan kitin sintetase dari dinding sel, mengikat sterol atau menghambat biosintesis sterol pada membran sel, menghambat sintesis protein melalui pengikatan ribosom dan penghambatan terhadap pembelahan sel dengan mengganggu pembentukan mikrotubuli (Ström 2005).
Response Surface Method (RSM)
Response Surface Method merupakan gabungan dari teknik matematika dan
statistik untuk melihat hubungan antara satu atau lebih variabel pelakuan berbentuk kuantitatif dengan variabel respon. Penggunaan RSM ini bertujuan untuk mengoptimalkan respon tersebut dalam percobaan atau untuk membuat suatu model empirik untuk mengoptimasi kondisi produksi beberapa hasil industri, seperti bahan kimia dan enzim. Tujuan dari optimasi dengan menggunakan Response surface method ialah untuk memilih atau mencari
9
respon atau untuk mengoptimasi media fermentasi dalam memproduksi senyawa biokimia (Mu et al. 2009).
Kelebihan optimasi dengan statistik di samping proses penapisan yang cepat, juga menggambarkan peran setiap komponen. Response surface method
membantu memahami interaksi antara parameter pada berbagai tingkat dan perhitungan tingkat optimal dari setiap parameter. Aplikasi dari teknik desain eksperimental secara statistik dalam pengembangan proses fermentasi yaitu dapat meningkatkan hasil produk, mengurangi proses variabilitas, serta mengurangi waktu dan biaya. Response surface method secara luas digunakan untuk
mempelajari pengaruh dari beberapa variabel untuk mencari kondisi optimal. Keberhasilan penerapan Response surface method untuk meningkatkan
produk fermentasi dengan mengoptimalkan media kultur telah banyak dilaporkan (Nawani dan Kapadnis 2004; Khurana et al. 2007; Yuan et al. 2008). Response surface method juga telah berhasil diaplikasikan dalam mengoptimasi senyawa
antikapang asam fenillaktik dari Lactobacillus sp. SK007 (Mu et al. 2009),
optimasi produksi asam laktat dari L. rhamnosus CGMCC (Yu et al. 2008).
3 METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi Industri, Pusat Penelitian Bioteknologi-LIPI. Waktu Penelitian mulai dari bulan April 2012-Januari 2013.
Bahan
Mikroorganisme yang digunakan adalah BAL dan kapang. Galur BAL yang digunakan ialah 1BL-2, DSK-3, DP 1-4-2, TSD-10, 1A-2, dan DR 1-6-2. Kapang uji yang digunakan ialah Aspergillus fumigatus IPBCC-88.03, A. flavus, dan Penicillium sp. SR-3. Isolat BAL dan Penicillium sp. SR-3 merupakan koleksi Biotechnology Culture Collection (BTCC), sedangkan kapang uji A. fumigatus
dan A. flavus merupakan koleksi IPB Culture Collection.
Prosedur Analisis Data selesai sterilisasi, tabung reaksi diposisikan tegak. Inokulasi dilakukan dengan menggunakan metode deep agar, yaitu inokulasi dilakukan dengan menusukkan
ose yang sudah ada mikrobnya ke media agar-agar MRS tegak (Lee et al. 2006).
10
Media yang digunakan untuk pertumbuhan kapang uji ialah agar-agar Malt Extract (MEA). Sebanyak 1,7 g MEA dilarutkan dalam 100 ml air, kemudian dipanaskan. Sebanyak 5 ml media tersebut diisikan ke tabung reaksi. Selanjutnya disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121 °C selama 15 menit. Setelah dimiringkan, kapang uji diinokulasi pada media tersebut, selanjutnya diinkubasi pada suhu 30 °C selama 5 hari. Setelah isolat bakteri asam laktat dan kapang tumbuh, isolat disimpan pada suhu 4 °C dan digunakan sebagai working culture. Stock culture disimpan pada larutan 20 % gliserol pada suhu -80 °C.
Penapisan Beberapa Galur BAL Penghasil Senyawa Antikapang
Bakteri asam laktat ditumbuhkan di media MRSA. Selanjutnya 20 µl suspensi kapang uji diinokulasi pada kertas cakram yang sudah diletakkan di atas media. Biakan diinkubasi pada suhu 30 °C selama lima hari. Persentase penghambatan dihitung dengan menggunakan metode Fokkema (1973) (Lampiran 1). Kontrol negatif yang digunakan ialah media MRS tanpa diinokulasi dengan bakteri asam laktat. Metode ini selanjutnya disebut plate assay method. Tahap
selanjutnya yaitu mencampurkan kapang uji (1x 104 spora/ml) dan 5% (1 x 108 CFU/ml) BAL terseleksi pada media MRSA tegak. Biakan diinkubasi pada suhu 30 °C selama lima hari (Schillinger dan Villarreal 2010). Penghambatan terhadap pertumbuhan kapang diamati.
Identifikasi Bakteri Asam Laktat Terseleksi
Bakteri asam laktat terseleksi diidentifikasi menggunakan metode koloni PCR berdasarkan sekuen gen 16S rRNA (Sheu et al. 2000). Satu koloni BAL
terseleksi dimasukkan ke dalam tabung PCR, selanjutnya dimasukkan ke dalam microwave selama 1 menit dengan kondisi suhu level tinggi (± 80-100 °C). Kemudian ditambahkan 50 µl campuran reaksi PCR yang berisi 25 µl taq RM
(KAPA), 0,4 µl 100 pmol primer 27F (5’-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3’), 0,4 µl 100 pmol primer 1492R (5’- GGTTACCTTGTTACGACTT-3’) dan 24,2 µl H2O. Kondisi PCR yang digunakan adalah sebagai berikut: pre heat 96 °C selama
5 menit, denaturasi 96 °C selama 30 detik, annealing 55 °C selama 30 detik,
elongasi 72 °C selama1 menit, ekstensi 72 °C selama 7 menit sebanyak 25 kali putaran.
Produk PCR dipisahkan pada alat elektroforesis menggunakan 1% agarose dan larutan bufer 1x TAE (Tris asetat-EDTA). Elektroforesis dilakukan pada kondisi 100 V selama 30 menit. Hasil elektroforesis diamati dengan menggunakan gel iluminator di bawah sinar UV. Produk PCR selanjutnya disekuen secara parsial dengan menggunakan 2 primer yang sama pada saat PCR. Hasil sekuen tersebut selanjutnya dibandingkan dengan data di GenBank menggunakan BLAST. Sekuen DNA isolat terseleksi disejajarkan dengan sekuen DNA type strain BAL dari database ribosom menggunakan program CLUSTAL X. Escherchia coli digunakan sebagai mikrob outgroup. Topologi pohon filogenetik
dari sekuen DNA BAL terseleksi dievaluasi menggunakan analisis bootstrap
11
Optimasi Produksi Senyawa Antikapang
Optimasi produksi senyawa antikapang (asam laktat) dari BAL terseleksi dilakukan dengan menggunakan Response surface method (RSM) dengan
rancangan percobaan Central Composite Design (CCD). Analisis dilakukan
menggunakan Software Statistic Design-ExpertR 7 (Stat-Ease Inc., USA, 2009).
Parameter yang dibuat ialah lima variabel, yaitu glukosa (X1), ekstrak khamir
(X2), CH3COONa (X3),K2HPO4 (X4), dan Tween 80 (X5) dengan kombinasi lima
tingkat dosis (Tabel 1). Model yang digunakan ialah response surface mengikuti
persamaan:
+
Y adalah total senyawa antikapang/asam laktat tertitrasi yang diproduksi, sedangkan Xi…, Xj merupakan variabel yang diuji dan β0 adalah intercept serta
βi....,,βij. adalah koefisien regresi.
Isolat BAL terseleksi diinokulasikan ke dalam 25 ml media MRS cair, kemudian diinkubasi secara statik pada suhu 30 °C selama 48 jam dan selanjutnya dipakai sebagai inokulum. Sebanyak 5 % inokulum berisi ± 1 x 108 CFU/ml diinokulasi ke 50 ml media produksi, diinkubasi secara statik pada suhu 30 °C selama 48 jam. Kultur disentrifugasi pada kecepatan 7840 g pada suhu 4 °C selama 15 menit. Verifikasi atau validasi terhadap kondisi optimum dilakukan dengan menginokulasikan 5 % inokulum isolat BAL terseleksi ke dalam 50 ml
Analisis asam laktat dilakukan dengan menggunakan metode titrimetri (Apriyantoro et al. 1989). Sebanyak 10 ml supernatan dititrasi dengan 0,1 N
NaOH yang sebelumnya sudah distandarisasi oleh 0,1 N asam oksalat. Indikator yang digunakan yaitu fenolftalin. Hasilnya dinyatakan sebagai persen asam laktat (Apriyantono et al. 1989). Penghitungan persen asam laktat menggunakan rumus:
12
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Penapisan Beberapa Galur BAL Penghasil Senyawa Antikapang
Penapisan dilakukan terhadap enam galur BAL yaitu isolat DSK3 yang berasal dari dadih Sulawesi Selatan, isolat DR1-6-2 dan DP1-4-2 berasal dari dadih Riau, isolat 1A-2 berasal dari tapai, isolat TSD-10 berasal dari kotoran sapi, dan isolat 1BL-2 berasal dari buah strawberi. Sedangkan kapang uji yang digunakan yaitu A. fumigatus IPBCC-88.03, A. flavus, dan Penicillium sp. SR-3.
Hasil penapisan menunjukkan isolat BAL DR 1-6-2 dapat menghambat pertumbuhan A. fumigatus IPBCC-88.03 dan A. flavus (Gambar 3) masing-masing
dengan persentase penghambatan sebesar 41% dan 32%. Hal ini terlihat dengan tidak tumbuhnya A. fumigatus IPBCC-88.03 dan A. flavus di sekitar koloni BAL
DR 1-6-2. Isolat BAL TSD-10 dan DP 1-4-2 dapat menghambat pertumbuhan A. flavus (Gambar 1) dengan persentase penghambatan masing-masing sebesar 32%.
Dari keenam isolat BAL yang ditapis, tidak ada yang mampu menghambat
Penicillium sp.SR-3.
Gambar 3 Pengujian penghambatan pertumbuhan A. fumigatus, A.flavus, dan Penicillium oleh enam galur BAL pada media MRS agar, diinkubasi
pada suhu 30 °C selama lima hari.
Pengujian BAL dengan metode agar tegak dengan cara menginokulasi BAL dan kapang uji bersamaan (Gambar 4). Pada pengujian ini, isolat DR 1-6-2 tidak hanya mampu menghambat A. fumigatus, A. flavus, tetapi juga Penicillium. Hal
tersebut ditunjukkan dengan tidak adanya pertumbuhan ketiga kapang uji tersebut. Pada kontrol negatif yang tidak diinokulasi dengan BAL dan hanya ditambahkan kapang uji, kapang tampak tumbuh merata dipermukaan medium.
Galur bakteri asam laktat Kapang
yang diujikan Kontrol - DR 1-6-2 1A-2 DSK-3 TSD-10 DP 1-4-2 1BL-2
Aspergillus fumigatus
A. flavus
13
Gambar 4 Pengujian penghambatan A. fumigatus, A. flavus, dan Penicillium oleh
isolat BAL DR 1-6-2 menggunakan media MRSA tegak. Isolat BAL DR 1-6-2 dan kapang uji ditumbuhkan bersamaan pada MRSA dan diinkubasi pada suhu 30 °C selama lima hari.
Identifikasi Bakteri Asam Laktat Terseleksi
Isolat BAL terseleksi yaitu DR 1-6-2 diidentifikasi dengan menggunakan pendekatan molekuler sekuen gen 16S rRNA. Pita gen 16S rRNA dari isolat DR-16-2 menggunakan gel elektroforesis yang mempunyai ukuran ±1600 basa nukleotida (Gambar 5).
Produk PCR selanjutnya dianalisis sekuen DNA. Sekuen nukleotida yang diperoleh selanjutnya dianalisis BLAST dan pohon filogenetik (Gambar 6). Berdasarkan hasil BLAST dan pohon filogenetik, isolat DR 1-6-2 dengan L. plantarum memiliki nilai homologi sebesar 98% dari total 1454 nukleotida.
Kekerabatan yang dekat antara isolat DR 1-6-2 dengan beberapa isolat L. plantarum mempunyai homologi 98% (Tabel 2).
Kontrol - DR 1-6-2 Kontrol - DR 1-6-2 Kontrol - DR 1-6-2 A. fumigatus A. flavus Penicillium
Gambar 5 Pita gen 16S berukuran ± 1600 basa rRNA dari isolat DR-16-2 menggunakan gel elektroforesis
10000
3000 1500 1000 750 500 250
14
Tabel 2 Isolat bakteri asam laktat yang mempunyai kekerabatan yang dekat dengan isolat BAL DR-16-2
No. Nama spesies Homologi (%) Nomor akses
1. L. plantarum galur KCC-10 98 KC422325.1
2. L. plantarum galur KCC-9 98 KC422324.1
3. L. plantarum galur KCC-8 98 KC422323.1
4. L. plantarum galur KCC-6 98 KC422321.1
5. L. plantarum galur KCC-3 98 KC422318.1
6. L. plantarum galur KCC-1 98 KC422316.1
7. L. plantarum galur PON10014 98 KC416990.1
8. L. plantarum galur qz-572-1 98 HF562939.1
9. L. plantarum galur CTBRBL22 98 JX426117.1
10. L. plantarum galur G8 98 JX183220.1
Berdasarkan analisis pohon filogenetik, isolat DR-1-6-2 termasuk famili bakteri asam laktat dan genus Lactobacillus yang ditandai dengan terpisahnya
cabang dan masuk ke dalam klaster L. plantarum.
Optimasi Produksi Senyawa Antikapang
Media yang digunakan untuk optimasi adalah MRS cair dengan beberapa variabel dan level konsentrasi. Variabel yang dipilih untuk produksi senyawa
15
antikapang/asam laktat dari BAL DR 1-6-2 yaitu glukosa, ekstrak khamir, sodium asetat dan Tween 80. Pengaruh variabel-variabel tersebut dianalisis menggunakan
response surface method (RSM). Analisis regresi menggunakan software Design-Expert 7. Rancangan percobaan optimasi asam laktat dari isolat DR 1-6-2
menggunakan CCD (Lampiran 4).
Hasil optimasi produksi senyawa antikapang (asam laktat) dianalisis dengan analisis varian. Glukosa, Tween 80, interaksi glukosa dan ekstrak khamir, interaksi ekstrak khamir dan K2HPO4 secara signifikan mempengaruhi produksi
asam laktat oleh L. plantarum DR 1-6-2 (Tabel 3). Berdasarkan hasil ANOVA,
Tabel 3 ANOVA untuk Response Surface Quadratic
Sumber Sum of
16
Hasil grafik dari percobaan divisualisasikan dalam bentuk tiga dimensi dan plot contour dari response surface yang menunjukkan hubungan antara dua faktor
yang saling berinteraksi terhadap total asam laktat tertitrasi (Yu et al. 2010).
Konsentrasi glukosa dan Tween 80 dan interaksinya berpengaruh signifikan terhadap konsentrasi asam laktat yang dihasilkan (Gambar 7). Demikian pula konsentrasi glukosa dan K2HPO4 dan interaksinya (Gambar 8) serta konsentrasi
ekstrak khamir dan K2HPO4 dan interaksinya (Gambar 9) berpengaruh signifikan
terhadap konsentrasi asam laktat yang dihasilkan. Pengaruh konsentrasi glukosa terhadap konsentrasi total asam laktat tertitrasi (Gambar 10).
Hasil analisis data optimasi menggunakan software statistik Design-ExpertR 7 (Stat-Ease, Inc., USA, 2009) menunjukkan bahwa kondisi optimal untuk
produksi asam laktat ialah 2,91% glukosa, 0,58% ekstrak khamir, 0,29% K2HPO4
17
Gambar 7 Response surface plots bentuk tiga dimensi (a) dan bentuk contour (b)
yang menggambarkan pengaruh konsentrasi glukosa dan Tween 80 terhadap konsentrasi total asam laktat tertitrasi.
Twe
en
8
0
(%
)
Glukosa (%)
(b) (a)
TAT
18
Gambar 8 Response surface plots bentuk tiga dimensi (a) dan bentuk contour (b)
yang menggambarkan pengaruh konsentrasi glukosa dan K2HPO4
terhadap konsentrasi total asam laktat tertitrasi. (a)
K2HPO4 (%) Glukosa (%)
TA
T
(%
)
(b)
K2
HPO
4
(%
)
19
Gambar 9 Response surface plots (a) bentuk tiga dimensi dan (b) bentuk contour
yang menggambarkan pengaruh konsentrasi ekstrak khamir dan K2HPO4 terhadap konsentrasi total asam laktat tertitrasi.
(a)
K2HPO4 (%) Ekstrak khamir (%)
TAT
(%
)
(b)
K2
HPO
4
(%
)
20
Gambar 10 Pengaruh konsentrasi glukosa terhadap konsentrasi total asam laktat tertitrasi.
Pembahasan
Penapisan BAL penghasil senyawa antikapang/asam laktat telah dilakukan untuk mengetahui BAL yang mempunyai kemampuan menghambat pertumbuhan kapang Aspergillus fumigatus, A. flavus, dan Penicillium yang sering
mengkontaminasi silase (Boudra dan Morgavi 2005; Richard et al. 2007; Storm et al. 2008). Silase yang terkontaminasi A. fumigatus, A. flavus, dan Penicillium jika
dikonsumsi oleh hewan ternak akan mengakibatkan mikosis bagi hewan juga dapat beresiko terhadap manusia melalui susu dan daging yang dikonsumsi (Santos et al. 2002; Storm et al. 2008, Whitlow dan Hagler 2010).
Penapisan BAL penghasil senyawa antikapang telah dilakukan dengan menggunakan plate assay method pada media MRS. Pertumbuhan BAL pada
media MRS menunjukkan pertumbuhan yang sangat baik. Media MRS mengandung nutrisi yang sangat kaya yang sangat dibutuhkan oleh BAL untuk pertumbuhan dan produksi asam laktat (Ström et al. 2002; Sjögren et al. 2003;
Mu et al. 2009; Schillinger & Villarreal 2010; Zalán et al. 2010; Moon et al.
2012). Kombinasi asam laktat yang dihasilkan selama pertumbuhan BAL dan natrium asetat pada media MRS sebagai media pertumbuhan standar untuk BAL, memiliki hubungan sinergis terhadap pengaruh antikapang (Stiles et al. 2002).
Metode penapisan yang telah dilakukan tersebut berbeda dengan Magnuson
et al. (2003) yang melakukan penapisan BAL dengan menggunakan metode dual culture overlay. Metode tersebut dilakukan dengan cara menumbuhkan BAL pada
media agar-agar MRS dengan cara digores, kemudian media agar-agar ME yang mengandung 1x104 spora/ml dituangkan ke media yang sudah ditumbuhi BAL. Pada penelitian ini, metode tersebut telah dilakukan terhadap enam isolat BAL, tetapi tidak berhasil. Hasil yang diperoleh yaitu koloni sel BAL tersebar setelah dituangi media agar-agar ME dipermukaan media sehingga menyulitkan pengamatan.
Plate assay method merupakan penapisan awal pada kondisi aerobik. Pada
penapisan menggunakan metode plate assay (kondisi aerobik), Penicillium tidak
mampu dihambat oleh BAL. Pengamatan secara visual menunjukkan bahwa pertumbuhan Penicillium tidak terganggu oleh BAL dan pertumbuhan BAL tidak
terganggu oleh Penicillium. Senyawa antikapang yang dihasilkan oleh BAL tidak
TAT
Warning ! Factor involved in an interaction.
21
mampu menghambat pertumbuhan kapang Penicillium, sementara antibiotik yang
mungkin dihasilkan oleh Penicillium tidak cukup untuk menghambat
pertumbuhan BAL. Dengan kata lain, walaupun Penicillium mampu
menghasilkan antibiotik, BAL masih tetap tumbuh. Menurut Mathur & Singh (2005) beberapa jenis BAL mempunyai sifat yang resisten terhadap beberapa antibiotik termasuk penisilin.
Pada deep tube agar assay (lebih bersifat anaerobik khususnya pada bagian
bawah tabung), pertumbuhan BAL maksimum baik di bagian bawah tabung maupun di bagian permukaannya. BAL mampu tumbuh dengan sempurna baik secara aerobik maupun anaerobik dan oleh karenanya sangat ideal dipergunakan sebagai inokulum pada fermentasi silase (Storm et al. 2008). Kondisi ini
diperagakan dengan baik oleh isolat BAL DR 1-6-2. Dengan menggunakan deep tube agar assay, pertumbuhan BAL sangat baik dan antikapang yang
dihasilkannya mempunyai spektrum penghambatan yang lebih luas jika dibandingkan dengan plate agar assay. Dalam keadaan anaerobik, BAL lebih
efektif menghambat pertumbuhan kapang termasuk Penicillium. Senyawa
antikapang yang dihasilkan oleh BAL pada kondisi anerobik mungkin lebih kuat dibandingkan pada kondisi aerobik. Sementara pertumbuhan Penicillium
kemungkinan tidak optimal pada kondisi fakultatif aerobik.
Pengujian pada media MRS agar tegak, pertumbuhan isolat DR 1-6-2 terdistribusi secara homogen dari bawah sampai atas tabung (Gambar 4). Hal tersebut menunjukkan bahwa isolat DR 1-6-2 merupakan BAL yang bersifat anaerobik fakultatif. Hasil pengujian pada medium MRS agar tegak menunjukkan bahwa isolat BAL DR 1-6-2 dapat hidup dengan baik pada kondisi aerobik maupun anerobik dan mampu menghambat pertumbuhan kapang kontaminan sehingga dapat digunakan sebagai inokulum silase.
Selain mempunyai kemampuan menghambat pertumbuhan kapang, isolat BAL DR 1-6-2 mampu menghasilkan senyawa antibakteri. Sari (2010) melakukan penelitian terhadap isolat DR 1-6-2. Isolat BAL tersebut mampu menghambat
Micrococcus luteus dan Listeria monocytogenes. Karakterisasi senyawa aktif dari
isolat BAL tersebut menggunakan SDS-PAGE. Senyawa aktif yang dimiliki oleh isolat BAL DR 1-6-2 mempunyai berat molekul >10 KDa. Ukuran molekul tersebut sama dengan ukuran berat molekul nisin. Penelitian yang dilakukan oleh Ayad et al. (2002) dan Alegría et al. (2010) mengungkapkan beberapa galurBAL
mampu menghasilkan bakteriosin.
Isolat BAL DR 1-6-2 teridentifikasi sebagai L. plantarum. Lactobacillus plantarum termasuk kelompok BAL homofermentatif yaitu menghasilkan asam
laktat sebagai produk utamanya (Axelsson 2004; Prema et al. 2010). Bakteri asam
laktat homofermentatif mengubah satu mol glukosa menjadi dua mol piruvat yang selanjutnya diubah menjadi laktat melalui jalur Embden-Meyerhof-Parnas
(Axelsson 2004).
Pelaez et al. (2012) mengungkapkan L. plantarum mampu menghasilkan
asam laktat, asam asetat, dan asam fenillaktat yang mampu menghambat pertumbuhan A. flavus. Lactobacillus plantarum juga menghasilkan senyawa
antikapang lainnya yaitu antara lain asam 3-(R) hidroksidekanoat, dipeptidasiklik,
dan metillhidantoin (Ström et al. 2002; Magnuson et al. 2003; Sjögren et al.
22
Asam laktat merupakan salah satu asam organik yang mempunyai aktivitas antikapang dan digunakan sebagai pengawet makanan dan pakan yang aman. Asam organik yang dihasilkan dapat menurunkan pH sitoplasma yang dapat menghambat pertumbuhan mikrob patogen/pembusuk (Dalie et al. 2010). Asam
organik lemah dalam bentuk tak terdisosiasi akan berdifusi melalui membran sel, yang tergantung pada pH intraseluler, selanjutnya terdisosiasi ke dalam sel yang akan melepaskan ion H+ yang dapat menurunkan pH sitoplasma. Di samping itu, pengaruh pH dalam bentuk tidak terdisosiasi dari molekul tersebut memicu pengaruh antimikrob yang dapat menghancurkan gradien proton elektrokimia dan menyebabkan bakteriostasis yang akhirnya akan menyebabkan kematian pada mikrob yang rentan (Magnuson 2003).
Penggunaan L. plantarum sebagai inokulum silase telah banyak dilakukan
untuk memperoleh silase dengan kualitas yang baik. Hu et al. (2009)
mengungkapkan bahwa pengaruh penambahan inokulum L. plantarum pada
pembuatan silase dapat meningkatkan konsentrasi asam laktat. Produksi asam laktat dari BAL yang digunakan sebagai inokulum pada proses pembuatan silase dikaji kondisi optimumnya untuk menghasilkan produk yang tinggi. Beberapa percobaan optimasi pada beberapa variabel yang mempengaruhi suatu produk industri biasanya dilakukan dalam jumlah yang besar. Strategi untuk mengurangi jumlah percobaan tersebut ialah dengan menggunakan desain percobaan. Aplikasi desain percobaan secara statistik pada proses fermentasi dapat meningkatkan hasil produk, mengurangi variabilitas, juga mengurangi waktu dan biaya (Mu et al.
2009).
Desain optimasi dari media kultur merupakan aspek yang sangat penting pada bidang mikrobiologi makanan dan fermentasi. Teknik desain eksperimen secara statistik merupakan alat yang berguna untuk penapisan nutrisi, karena dapat memberikan model statistik yang membantu memahami interaksi antara parameter proses pada berbagai taraf dan perhitungan dari taraf optimal dari setiap parameter.
Response Surface Method secara luas telah digunakan untuk mempelajari
pengaruh beberapa variabel dan kombinasi untuk mencari kondisi optimum dari multivariabel. Response Surface Method merupakan gabungan dari teknik
matematika dan statistik untuk melihat hubungan antara satu atau lebih variabel pelakuan berbentuk kuantitatif dengan variabel respon (Mu et al. 2009).
Media yang digunakan untuk optimasi ialah MRS cair dengan lima variabel dan lima kombinasi. Variabel yang dipilih untuk produksi senyawa asam laktat dari isolat DR 1-6-2 yaitu glukosa, ekstrak khamir, natrium asetat dan Tween 80. Menurut Mu et al. (2009), variabel tersebut berpengaruh terhadap produksi asam
laktat. Glukosa merupakan sumber karbon utama, nutrisi yang sangat diperlukan untuk pertumbuhan. Penambahan Tween 80 ke dalam medium dapat merangsang pertumbuhan BAL, meningkatkan laju pertumbuhan, memperpendek waktu kultivasi, dan juga meningkatkan permeabilitas sel sehingga memungkinkan ekskresi produk dari sel (Johnsson et al. 1995).
Keberhasilan penggunaan metode statistik tersebut untuk optimasi produksi telah banyak dilaporkan, tetapi hanya sedikit penelitian mengenai optimasi asam laktat dari L. plantarum yang menggunakan metode RSM. Penelitian Mu et al.
23
mempengaruhi produksi senyawa asam fenillaktat yaitu glukosa, ekstrak khamir, sodium asetat, K2HPO4 dan Tween 80. Kondisi optimum yang dicapai pada
penelitian Mu et al. (2009) ialah 3% glukosa, 0,3% K2HPO4, 0,13% sodium
asetat, 3% ekstrak khamir, 0,3% Tween 80 dan 0,5% asam fenilpiruvat. Maksimum asam fenillaktat yang dihasilkan ialah 0,23%.
Hasil tersebut berbeda dengan yang telah dilakukan pada penelitian ini disebabkan karena senyawa target dan metode yang digunakan untuk analisis berbeda. Penggunaan metode analisis dengan titrimetri, semua asam laktat tertitrasi, sedangkan analisis senyawa asam fenillaktat menggunakan HPLC lebih mudah dianalisis. Penelitian yang sama dilakukan oleh Armaforte et al. (2006)
dan Prema et al. (2010) yaitu menganalisis asam fenilaktat yang diproduksi oleh L. plantarum pada media MRS cair dengan menggunakan HPLC.
Yu et al. (2008) melaporkan optimasi produksi asam laktat dari L. rhamnosus menggunakan metode RSM untuk mengevaluasi pengaruh corn steep liquor dengan glukosa, molase, Tween 80 and MnSO4. Penggunaan corn steep
liquor yaitu sebagai sumber nitrogen pengganti ekstrak khamir dan harganya
murah. Maksimum produksi asam laktat yaitu 11,3% pada konsentrasi optimum glukosa, molase, corn steep liquor, Tween 80 dan MnSO4 masing-masing sebesar
11,82%, 3,73%, 4,3%, 0,152% dan 0,03%.
Liu et al. (2010) melaporkan optimasi produksi asam laktat dari termofilik L. plantarum menggunakan berbagai sumber nitrogen alternatif dengan RSM.
Sumber nitrogen yang digunakan yaitu malt sprout, corn steep liquor, NH4Cl,
NH4NO3, dan diamin sitrat. Sumber N yang berpengaruh secara signifikan
terhadap produksi asam laktat ialah malt sprout dan corn steep liquor dengan
konsentrasi masing-masing sebesar 1,6% dan 1,2%. Konsentrasi asam laktat yang diperoleh sebesar 6,68%.
Perbedaan konsentrasi asam laktat yang dihasilkan oleh L. plantarum DR
1-6-2 yaitu mencapai konsentrasi 2,61% dengan penelitian yang dilakukan oleh Yu
et al. (2008) dan Liu et al. (2010) karena penggunaan berbagai sumber nitrogen
dan dua sumber karbon yang digunakan akan meningkatkan konsentrasi asam laktat. Dalié et al. (2010) dan Lima et al. (2010) mengemukakan bahwa nitrogen
dan karbon dapat meningkatkan senyawa antikapang yang dihasilkan oleh bakteri asam laktat.
5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Isolat BAL DR 1-6-2 mampu menghambat pertumbuhan A. fumigatus dan A. flavus pada plate assay method dan juga menghambat Penicillium sp. SR3
pada metode agar-agar tegak. Isolat BAL DR 1-6-2 teridentifikasi sebagai
Lactobacillus plantarum dengan nilai homologi sebesar 98%.
Percobaan dengan menggunakan CCD-RSM berhasil diperoleh model regresi sebagai berikut:
Y = 1,65 + 0,288 X1 - 0,023 X12 + 0,041 X5 + 0,047X1X4 + 0,049 X2X4
X1, X2, X4, X5 masing- masing menunjukkan glukosa, ekstrak khamir,
24
Dengan model regresi tersebut diperoleh kadar optimum variabel yang paling berpengaruh sebagai berikut: glukosa 2,91% (w/v), ekstrak khamir 0,58% (w/v), K2HPO4 0,29% (w/v), dan Tween 80 0,19% (v/v) dengan prediksi produksi
asam laktat sebesar 2,61% (v/v) atau meningkat sebesar 59% dari kondisi sebelum dioptimasi. Hasil verifikasi dengan menggunakan model ini mendapatkan kadar asam laktat 2,59% (v/v).
Saran
Kondisi anerobik merupakan syarat yang perlu diperhatikan dalam pembuatan silase dengan menggunakan L. plantarum DR 1-6-2. Kemampuan L. plantarum DR 1-6-2 dalam keadaan anaerobik dapat menghambat pertumbuhan
kapang kontaminan lebih baik dan lebih luas spektrumnya. Perlu diteliti lebih jauh untuk mengidentifikasi senyawa antikapang lainnya yang diproduksi oleh L. plantarum DR 1-6- 2. Identifikasi ini perlu dilakukan untuk membuka peluang
25
DAFTAR PUSTAKA
Adams N. 2008. Do you know what’s in your silage. www.progressivedairy.com. (diakses pada tanggal 12 Maret 2012).
Alegría Á, Delgado S, Roces C, López B, Mayo B. 2010. Bacteriocins produced by wild Lactococcus lactis strains isolated from traditional, starter-free
cheeses made of raw milk. Int J Food Microbiol. 143(1-2):61–66.
Apriyantono A, Fardiaz D, Puspitasari NL, Sedarwati, Budiyanto S. 1989. Analisa Pangan. Bogor (ID): IPB Press.
Armaforte E, Carri S, Ferri G, Caboni MF. 2006. High-performance liquid chromatography determination of phenyllactic acid in MRS broth. J Chromatography. 1131(1-2):281–284.
Axelsson L. 2004. Lactic acid bacteria: Classification and physiology. In: Salminen S, von Wright A, editor. Lactic Acid Bacteria: Microbiology and Functional Aspects. 3th Edition, Revised and Expanded. New York (US):
Marcel Dekker, Inc. pp 1-2, 12-13 & 19-22.
Ayad EHE, Verheul A, Wouters JTM, Smit G. 2002. Antimicrobial-producing wild lactococci isolated from artisanal and non-dairy origins. Int Dairy J.
12(2):145–150.
Bello FD, Clarke CI, Ryan LAM, Ulmer H, Schober TJ, Ström K, Sjögren J, Sinderen DV, Schnürer J, Arendt EK. 2007. Improvement of the quality and shelf life of wheat bread by fermentation with the antifungal strain
Lactobacillus plantarum FST 1.7. J Cereal Sci, 45 (3): 309–318.
Boudra H, Morgavi DP. 2005. Mycotoxin risk evaluation in feeds contaminated by Aspergillus fumigatus. Anim Feed Sci Technol. 120(1):113–123.
Cizeikiene D, Juodeikiene G, Paskevicius A, Bartkiene E. 2013. Activity of lactic acid bacteria against pathogenic and spoilage microorganism isolated from food and their control in wheat bread. Food Control, 31(1): 539-545.
Condon S. 1987. Responses of lactic acid bacteria to oxygen. FEMS Microbiol Lett.46(3):69-280.
Coulombe RA. 1993. Symposium: biological action of mycotoxins. J Dairy Sci.
76:880–891.
Dalié DKD, Deschamps AM, Forget FR. 2010. Lactic acid bacteria – Potential for control of mould growth and mycotoxins: A review. Food Control.
21(4):370–380.
Fokkema NJ. 1973. The role of saprophytic fungi in antagonism against
Drechslera sorokiniana (Helminthosporium sativum) on agar plates and on
rye leaves with pollen. Physiol Plant Pathol. 3:195-205.
Hu W, Schmidt RJ, McDonell EE, Klingerman CM, Kung Jr L. 2009. The effect of Lactobacillus buchneri 40788 or Lactobacillus plantarum MTD-1 on the
fermentation and aerobic stability of corn silages ensiled at two dry matter
26
Illaningtyas F. 2003. Aktivitas Antikapang dari Bakteri Asam Laktat terhadap Pertumbuhan Kapang Kontaminan Keju. [Tesis]. Bogor (ID): Sekolah Pasca Sarjana, Institut Pertanian Bogor.
Johnsson T, Nikkila P, Toivonen L. 1995. Cellular fatty acid profiles of
Lactobacillus and Lactococcus strains in relation to the oleic acid content of
the cultivation medium. Appl Environ Microbiol. 61(12):4497–4499.
Khurana S, Kapoor M , Gupta S, Kuhad RC. 2007. Statistical optimization of
alkaline xylanase production from Streptomyces violaceoruber under
submerged fermentation using response surface methodology. Indian J
Microbiol. 47(2):144-152.
Lavermicocca P, Valerio F, Evidente A, Lazzaroni S, Corsetti A, Gobbetti M. 2000. Purification and characterization of novel antifungal compounds from the sourdough Lactobacillus plantarum Strain 21B. Appl Environ Microbiol. 66(9):4084–4090.
Lee JY, Kim CJ, Kunz B. 2006. Identification of lactic acid bacteria isolated from kimchi and studies on their suitability for application as starter culture in the production of fermented sausage. Meat Sci. 72(3):437–445.
Lima CJB, Coelho LF, Contier J. 2010. Use of response surface methodology in
optimization of lactic acid production: focus on medium supplementation, temperature and pH Control. Food Technol Biotechnol. 48(2):175–181.
Liu B, Yanga M, Qia B, Chena X, Sua Z, Wana Y. 2010. Optimizing l-(+)-lactic acid production by thermophile Lactobacillus plantarum As.1.3 using
alternative nitrogen sources with response surface method. Biochem Eng J.
52(2-3):212–219.
Magnuson J. 2003. Antifungal activity of lacic acid bacteria. [dissertation]. Uppsala: Department of Microbiology, Swedish University of Agricultural. Magnusson J, Schnürer J. 2001. Lactobacillus coryniformis subsp.coryniformis
strain Si3 Produces a broad-spectrum proteinaceous antifungal compuond.
Appl Environ Microbiol. 67(1):1–5.
Magnusson J, Ström K, Roos S, Sjögren J, Schnürer J. 2003. Broad and complex antifungal activity among environmental isolates of lactic acid bacteria.
FEMS Microbiol Lett. 219(1):129-135.
Mathur S, Singh R. 2005. Antibiotic resistance in food lactic acid bacteria—a review. Int J Food Microbiol.105 (3): 281– 295.
Moon SK, Wee YJ, Choi GW. 2012. A novel lactic acid bacterium for the production of high purity L-lactic acid, Lactobacillus paracasei subsp. paracasei CHB2121. J Biosci Bioeng. 114(2):155-159.
Mu W, Chen C, Li X, Zhang T, Jiang B. 2009. Optimization of culture medium for the production of phenyllactic acid by Lactobacillus sp. SK007. Biores Technol. 100(3):1366–1370.
