Penapisan Beberapa Galur BAL Penghasil Senyawa Antikapang
Penapisan dilakukan terhadap enam galur BAL yaitu isolat DSK3 yang berasal dari dadih Sulawesi Selatan, isolat DR1-6-2 dan DP1-4-2 berasal dari dadih Riau, isolat 1A-2 berasal dari tapai, isolat TSD-10 berasal dari kotoran sapi, dan isolat 1BL-2 berasal dari buah strawberi. Sedangkan kapang uji yang digunakan yaitu A. fumigatus IPBCC-88.03, A. flavus, dan Penicillium sp. SR-3.
Hasil penapisan menunjukkan isolat BAL DR 1-6-2 dapat menghambat pertumbuhan A. fumigatus IPBCC-88.03 dan A. flavus (Gambar 3) masing-masing dengan persentase penghambatan sebesar 41% dan 32%. Hal ini terlihat dengan tidak tumbuhnya A. fumigatus IPBCC-88.03 dan A. flavus di sekitar koloni BAL DR 1-6-2. Isolat BAL TSD-10 dan DP 1-4-2 dapat menghambat pertumbuhan A.
flavus (Gambar 1) dengan persentase penghambatan masing-masing sebesar 32%. Dari keenam isolat BAL yang ditapis, tidak ada yang mampu menghambat
Penicillium sp.SR-3.
Gambar 3 Pengujian penghambatan pertumbuhan A. fumigatus, A.flavus, dan
Penicillium oleh enam galur BAL pada media MRS agar, diinkubasi pada suhu 30 °C selama lima hari.
Pengujian BAL dengan metode agar tegak dengan cara menginokulasi BAL dan kapang uji bersamaan (Gambar 4). Pada pengujian ini, isolat DR 1-6-2 tidak hanya mampu menghambat A. fumigatus, A. flavus, tetapi juga Penicillium. Hal tersebut ditunjukkan dengan tidak adanya pertumbuhan ketiga kapang uji tersebut. Pada kontrol negatif yang tidak diinokulasi dengan BAL dan hanya ditambahkan kapang uji, kapang tampak tumbuh merata dipermukaan medium.
Galur bakteri asam laktat Kapang
yang diujikan Kontrol - DR 1-6-2 1A-2 DSK-3 TSD-10 DP 1-4-2 1BL-2 Aspergillus fumigatus A. flavus Penicillium
13
Gambar 4 Pengujian penghambatan A. fumigatus, A. flavus, dan Penicillium oleh isolat BAL DR 1-6-2 menggunakan media MRSA tegak. Isolat BAL DR 1-6-2 dan kapang uji ditumbuhkan bersamaan pada MRSA dan diinkubasi pada suhu 30 °C selama lima hari.
Identifikasi Bakteri Asam Laktat Terseleksi
Isolat BAL terseleksi yaitu DR 1-6-2 diidentifikasi dengan menggunakan pendekatan molekuler sekuen gen 16S rRNA. Pita gen 16S rRNA dari isolat DR-16-2 menggunakan gel elektroforesis yang mempunyai ukuran ±1600 basa nukleotida (Gambar 5).
Produk PCR selanjutnya dianalisis sekuen DNA. Sekuen nukleotida yang diperoleh selanjutnya dianalisis BLAST dan pohon filogenetik (Gambar 6). Berdasarkan hasil BLAST dan pohon filogenetik, isolat DR 1-6-2 dengan L. plantarum memiliki nilai homologi sebesar 98% dari total 1454 nukleotida. Kekerabatan yang dekat antara isolat DR 1-6-2 dengan beberapa isolat L. plantarum mempunyai homologi 98% (Tabel 2).
Kontrol - DR 1-6-2 Kontrol - DR 1-6-2 Kontrol - DR 1-6-2 A. fumigatus A. flavus Penicillium
Gambar 5 Pita gen 16S berukuran ± 1600 basa rRNA dari isolat DR-16-2 menggunakan gel elektroforesis
10000 3000 1500 1000 750 500 250 DR 1-6-2 Marker 1 kb
14
Tabel 2 Isolat bakteri asam laktat yang mempunyai kekerabatan yang dekat dengan isolat BAL DR-16-2
No. Nama spesies Homologi (%) Nomor akses
1. L. plantarum galur KCC-10 98 KC422325.1 2. L. plantarum galur KCC-9 98 KC422324.1 3. L. plantarum galur KCC-8 98 KC422323.1 4. L. plantarum galur KCC-6 98 KC422321.1 5. L. plantarum galur KCC-3 98 KC422318.1 6. L. plantarum galur KCC-1 98 KC422316.1
7. L. plantarum galur PON10014 98 KC416990.1
8. L. plantarum galur qz-572-1 98 HF562939.1
9. L. plantarum galur CTBRBL22 98 JX426117.1
10. L. plantarum galur G8 98 JX183220.1
Berdasarkan analisis pohon filogenetik, isolat DR-1-6-2 termasuk famili bakteri asam laktat dan genus Lactobacillus yang ditandai dengan terpisahnya cabang dan masuk ke dalam klaster L. plantarum.
Optimasi Produksi Senyawa Antikapang
Media yang digunakan untuk optimasi adalah MRS cair dengan beberapa variabel dan level konsentrasi. Variabel yang dipilih untuk produksi senyawa
15
antikapang/asam laktat dari BAL DR 1-6-2 yaitu glukosa, ekstrak khamir, sodium asetat dan Tween 80. Pengaruh variabel-variabel tersebut dianalisis menggunakan
response surface method (RSM). Analisis regresi menggunakan software Design-Expert 7. Rancangan percobaan optimasi asam laktat dari isolat DR 1-6-2 menggunakan CCD (Lampiran 4).
Hasil optimasi produksi senyawa antikapang (asam laktat) dianalisis dengan analisis varian. Glukosa, Tween 80, interaksi glukosa dan ekstrak khamir, interaksi ekstrak khamir dan K2HPO4 secara signifikan mempengaruhi produksi asam laktat oleh L. plantarum DR 1-6-2 (Tabel 3). Berdasarkan hasil ANOVA, model regresi terbaik dengan nilai regresi (R2) sebesar 0,99 adalah sebagai berikut:
Y = 1,65 + 0,288 X1 - 0,023 X12 + 0,041 X5 + 0,047X1X4 + 0,049 X2X4
Pada persamaan tersebut, X1, X2, X4, X5 masing- masing menunjukkan glukosa, ekstrak khamir, K2HPO4, Tween 80, dan Y adalah total asam laktat tertitrasi.
Tabel 3 ANOVA untuk Response Surface Quadratic
Sumber Sum of Squares db Mean Square Nilai F Nilai P Prob > F Keterangan Model 1,454 20 0,073 75,39 < 0,0001 Signifikan X1-Glukosa 0,551 1 0,551 571,51 < 0,0001 X2-Ekstrak Khamir 0,002 1 0,002 1,87 0,2302 X3-CH3COONa 0,001 1 0,001 0,83 0,4042 X4-K2HPO4 0,001 1 0,001 1,30 0,3065 X5-Tween80 0,011 1 0,011 11,66 0,0189 X1X2 0,003 1 0,003 2,80 0,1552 X1X3 0,001 1 0,001 1,41 0,2888 X1X4 0,007 1 0,007 6,92 0,0465 X1X5 0,004 1 0,004 4,45 0,0886 X2X3 0,001 1 0,001 0,55 0,4899 X2X4 0,007 1 0,007 7,46 0,0412 X2X5 0,001 1 0,001 0,55 0,4914 X3X4 0,000 1 0,000 0,26 0,6332 X3X5 0,002 1 0,002 1,82 0,2350 X4X5 0,003 1 0,003 3,62 0,1154 X12 0,011 1 0,011 11,28 0,0202 X22 0,000 1 0,000 0,24 0,6481 X32 0,000 1 0,000 0,00 0,9673 X42 0,004 1 0,004 4,13 0,0979 X52 0,001 1 0,001 1,32 0,3029 Residual 0,005 5 0,001
Lack of Fit 0,002 1 0,002 2,18 0,2136 Tidak signifikan
Pure Error 0,003 4 0,001 Cor Total 1,459 25
Keterangan:
16
Hasil grafik dari percobaan divisualisasikan dalam bentuk tiga dimensi dan plot contour dari response surface yang menunjukkan hubungan antara dua faktor yang saling berinteraksi terhadap total asam laktat tertitrasi (Yu et al. 2010). Konsentrasi glukosa dan Tween 80 dan interaksinya berpengaruh signifikan terhadap konsentrasi asam laktat yang dihasilkan (Gambar 7). Demikian pula konsentrasi glukosa dan K2HPO4 dan interaksinya (Gambar 8) serta konsentrasi ekstrak khamir dan K2HPO4 dan interaksinya (Gambar 9) berpengaruh signifikan terhadap konsentrasi asam laktat yang dihasilkan. Pengaruh konsentrasi glukosa terhadap konsentrasi total asam laktat tertitrasi (Gambar 10).
Hasil analisis data optimasi menggunakan software statistik Design-ExpertR 7 (Stat-Ease, Inc., USA, 2009) menunjukkan bahwa kondisi optimal untuk produksi asam laktat ialah 2,91% glukosa, 0,58% ekstrak khamir, 0,29% K2HPO4
dan 0,19% Tween 80. Berdasarkan kondisi tersebut, perhitungan dari persamaan yang diperoleh konsentrasi total asam laktat tertitrasi yaitu sebesar 2,61%. Hasil optimasi tersebut meningkat 59% jika dibandingkan dengan produksi di media MRS cair tanpa optimasi yang memiliki konsentrasi total asam laktat tertitrasi sebesar 1,64%. Hasil percobaan verifikasi kondisi optimum diperoleh konsentrasi total asam laktat tertitrasi yaitu 2,59% atau meningkat 58% dari kondisi tanpa optimasi. Nilai dari hasil verifikasi tersebut mendekati nilai perkiraan. Dengan demikian, model regresi yang digunakan tersebut adalah ideal untuk produksi asam laktat dari isolat DR 1-6-2.
17
Gambar 7 Response surface plots bentuk tiga dimensi (a) dan bentuk contour (b) yang menggambarkan pengaruh konsentrasi glukosa dan Tween 80 terhadap konsentrasi total asam laktat tertitrasi.
Twe en 8 0 (% ) Glukosa (%) (b) (a) TAT Tween 80 (%) Glukosa (%)
18
Gambar 8 Response surface plots bentuk tiga dimensi (a) dan bentuk contour (b) yang menggambarkan pengaruh konsentrasi glukosa dan K2HPO4
terhadap konsentrasi total asam laktat tertitrasi. (a) K2HPO4 (%) Glukosa (%) TA T (% ) (b) K2 HPO 4 (% ) Glukosa (%)
19
Gambar 9 Response surface plots (a) bentuk tiga dimensi dan (b) bentuk contour
yang menggambarkan pengaruh konsentrasi ekstrak khamir dan K2HPO4 terhadap konsentrasi total asam laktat tertitrasi.
(a)
K2HPO4 (%) Ekstrak khamir (%)
TAT (% ) (b) K2 HPO 4 (% ) Ekstrak khamir (%)
20
Gambar 10 Pengaruh konsentrasi glukosa terhadap konsentrasi total asam laktat tertitrasi.
Pembahasan
Penapisan BAL penghasil senyawa antikapang/asam laktat telah dilakukan untuk mengetahui BAL yang mempunyai kemampuan menghambat pertumbuhan kapang Aspergillus fumigatus, A. flavus, dan Penicillium yang sering mengkontaminasi silase (Boudra dan Morgavi 2005; Richard et al. 2007; Storm et al. 2008). Silase yang terkontaminasi A. fumigatus, A. flavus, dan Penicillium jika dikonsumsi oleh hewan ternak akan mengakibatkan mikosis bagi hewan juga dapat beresiko terhadap manusia melalui susu dan daging yang dikonsumsi (Santos et al. 2002; Storm et al. 2008, Whitlow dan Hagler 2010).
Penapisan BAL penghasil senyawa antikapang telah dilakukan dengan menggunakan plate assay method pada media MRS. Pertumbuhan BAL pada media MRS menunjukkan pertumbuhan yang sangat baik. Media MRS mengandung nutrisi yang sangat kaya yang sangat dibutuhkan oleh BAL untuk pertumbuhan dan produksi asam laktat (Ström et al. 2002; Sjögren et al. 2003; Mu et al. 2009; Schillinger & Villarreal 2010; Zalán et al. 2010; Moon et al. 2012). Kombinasi asam laktat yang dihasilkan selama pertumbuhan BAL dan natrium asetat pada media MRS sebagai media pertumbuhan standar untuk BAL, memiliki hubungan sinergis terhadap pengaruh antikapang (Stiles et al. 2002).
Metode penapisan yang telah dilakukan tersebut berbeda dengan Magnuson
et al. (2003) yang melakukan penapisan BAL dengan menggunakan metode dual culture overlay. Metode tersebut dilakukan dengan cara menumbuhkan BAL pada media agar-agar MRS dengan cara digores, kemudian media agar-agar ME yang mengandung 1x104 spora/ml dituangkan ke media yang sudah ditumbuhi BAL. Pada penelitian ini, metode tersebut telah dilakukan terhadap enam isolat BAL, tetapi tidak berhasil. Hasil yang diperoleh yaitu koloni sel BAL tersebar setelah dituangi media agar-agar ME dipermukaan media sehingga menyulitkan pengamatan.
Plate assay method merupakan penapisan awal pada kondisi aerobik. Pada penapisan menggunakan metode plate assay (kondisi aerobik), Penicillium tidak mampu dihambat oleh BAL. Pengamatan secara visual menunjukkan bahwa pertumbuhan Penicillium tidak terganggu oleh BAL dan pertumbuhan BAL tidak terganggu oleh Penicillium. Senyawa antikapang yang dihasilkan oleh BAL tidak
TAT Glukosa (%) 1.50 1.85 2.21 2.56 2.91 1.00 1.30 1.60 1.90 2.20 a T One Factor
Warning ! Factor involved in an interaction.
2 2
21
mampu menghambat pertumbuhan kapang Penicillium, sementara antibiotik yang mungkin dihasilkan oleh Penicillium tidak cukup untuk menghambat pertumbuhan BAL. Dengan kata lain, walaupun Penicillium mampu menghasilkan antibiotik, BAL masih tetap tumbuh. Menurut Mathur & Singh (2005) beberapa jenis BAL mempunyai sifat yang resisten terhadap beberapa antibiotik termasuk penisilin.
Pada deep tube agar assay (lebih bersifat anaerobik khususnya pada bagian bawah tabung), pertumbuhan BAL maksimum baik di bagian bawah tabung maupun di bagian permukaannya. BAL mampu tumbuh dengan sempurna baik secara aerobik maupun anaerobik dan oleh karenanya sangat ideal dipergunakan sebagai inokulum pada fermentasi silase (Storm et al. 2008). Kondisi ini diperagakan dengan baik oleh isolat BAL DR 1-6-2. Dengan menggunakan deep tube agar assay, pertumbuhan BAL sangat baik dan antikapang yang dihasilkannya mempunyai spektrum penghambatan yang lebih luas jika dibandingkan dengan plate agar assay. Dalam keadaan anaerobik, BAL lebih efektif menghambat pertumbuhan kapang termasuk Penicillium. Senyawa antikapang yang dihasilkan oleh BAL pada kondisi anerobik mungkin lebih kuat dibandingkan pada kondisi aerobik. Sementara pertumbuhan Penicillium
kemungkinan tidak optimal pada kondisi fakultatif aerobik.
Pengujian pada media MRS agar tegak, pertumbuhan isolat DR 1-6-2 terdistribusi secara homogen dari bawah sampai atas tabung (Gambar 4). Hal tersebut menunjukkan bahwa isolat DR 1-6-2 merupakan BAL yang bersifat anaerobik fakultatif. Hasil pengujian pada medium MRS agar tegak menunjukkan bahwa isolat BAL DR 1-6-2 dapat hidup dengan baik pada kondisi aerobik maupun anerobik dan mampu menghambat pertumbuhan kapang kontaminan sehingga dapat digunakan sebagai inokulum silase.
Selain mempunyai kemampuan menghambat pertumbuhan kapang, isolat BAL DR 1-6-2 mampu menghasilkan senyawa antibakteri. Sari (2010) melakukan penelitian terhadap isolat DR 1-6-2. Isolat BAL tersebut mampu menghambat
Micrococcus luteus dan Listeria monocytogenes. Karakterisasi senyawa aktif dari isolat BAL tersebut menggunakan SDS-PAGE. Senyawa aktif yang dimiliki oleh isolat BAL DR 1-6-2 mempunyai berat molekul >10 KDa. Ukuran molekul tersebut sama dengan ukuran berat molekul nisin. Penelitian yang dilakukan oleh Ayad et al. (2002) dan Alegría et al. (2010) mengungkapkan beberapa galurBAL mampu menghasilkan bakteriosin.
Isolat BAL DR 1-6-2 teridentifikasi sebagai L. plantarum. Lactobacillus plantarum termasuk kelompok BAL homofermentatif yaitu menghasilkan asam laktat sebagai produk utamanya (Axelsson 2004; Prema et al. 2010). Bakteri asam laktat homofermentatif mengubah satu mol glukosa menjadi dua mol piruvat yang selanjutnya diubah menjadi laktat melalui jalur Embden-Meyerhof-Parnas
(Axelsson 2004).
Pelaez et al. (2012) mengungkapkan L. plantarum mampu menghasilkan asam laktat, asam asetat, dan asam fenillaktat yang mampu menghambat pertumbuhan A. flavus. Lactobacillus plantarum juga menghasilkan senyawa antikapang lainnya yaitu antara lain asam 3-(R) hidroksidekanoat, dipeptidasiklik, dan metillhidantoin (Ström et al. 2002; Magnuson et al. 2003; Sjögren et al. 2003).
22
Asam laktat merupakan salah satu asam organik yang mempunyai aktivitas antikapang dan digunakan sebagai pengawet makanan dan pakan yang aman. Asam organik yang dihasilkan dapat menurunkan pH sitoplasma yang dapat menghambat pertumbuhan mikrob patogen/pembusuk (Dalie et al. 2010). Asam organik lemah dalam bentuk tak terdisosiasi akan berdifusi melalui membran sel, yang tergantung pada pH intraseluler, selanjutnya terdisosiasi ke dalam sel yang akan melepaskan ion H+ yang dapat menurunkan pH sitoplasma. Di samping itu, pengaruh pH dalam bentuk tidak terdisosiasi dari molekul tersebut memicu pengaruh antimikrob yang dapat menghancurkan gradien proton elektrokimia dan menyebabkan bakteriostasis yang akhirnya akan menyebabkan kematian pada mikrob yang rentan (Magnuson 2003).
Penggunaan L. plantarum sebagai inokulum silase telah banyak dilakukan untuk memperoleh silase dengan kualitas yang baik. Hu et al. (2009)
mengungkapkan bahwa pengaruh penambahan inokulum L. plantarum pada
pembuatan silase dapat meningkatkan konsentrasi asam laktat. Produksi asam laktat dari BAL yang digunakan sebagai inokulum pada proses pembuatan silase dikaji kondisi optimumnya untuk menghasilkan produk yang tinggi. Beberapa percobaan optimasi pada beberapa variabel yang mempengaruhi suatu produk industri biasanya dilakukan dalam jumlah yang besar. Strategi untuk mengurangi jumlah percobaan tersebut ialah dengan menggunakan desain percobaan. Aplikasi desain percobaan secara statistik pada proses fermentasi dapat meningkatkan hasil produk, mengurangi variabilitas, juga mengurangi waktu dan biaya (Mu et al. 2009).
Desain optimasi dari media kultur merupakan aspek yang sangat penting pada bidang mikrobiologi makanan dan fermentasi. Teknik desain eksperimen secara statistik merupakan alat yang berguna untuk penapisan nutrisi, karena dapat memberikan model statistik yang membantu memahami interaksi antara parameter proses pada berbagai taraf dan perhitungan dari taraf optimal dari setiap parameter.
Response Surface Method secara luas telah digunakan untuk mempelajari pengaruh beberapa variabel dan kombinasi untuk mencari kondisi optimum dari multivariabel. Response Surface Method merupakan gabungan dari teknik matematika dan statistik untuk melihat hubungan antara satu atau lebih variabel pelakuan berbentuk kuantitatif dengan variabel respon (Mu et al. 2009).
Media yang digunakan untuk optimasi ialah MRS cair dengan lima variabel dan lima kombinasi. Variabel yang dipilih untuk produksi senyawa asam laktat dari isolat DR 1-6-2 yaitu glukosa, ekstrak khamir, natrium asetat dan Tween 80. Menurut Mu et al. (2009), variabel tersebut berpengaruh terhadap produksi asam laktat. Glukosa merupakan sumber karbon utama, nutrisi yang sangat diperlukan untuk pertumbuhan. Penambahan Tween 80 ke dalam medium dapat merangsang pertumbuhan BAL, meningkatkan laju pertumbuhan, memperpendek waktu kultivasi, dan juga meningkatkan permeabilitas sel sehingga memungkinkan ekskresi produk dari sel (Johnsson et al. 1995).
Keberhasilan penggunaan metode statistik tersebut untuk optimasi produksi telah banyak dilaporkan, tetapi hanya sedikit penelitian mengenai optimasi asam laktat dari L. plantarum yang menggunakan metode RSM. Penelitian Mu et al. (2009) telah berhasil melakukan optimasi senyawa antikapang yaitu asam fenillaktik dari Lactobacillus sp. dengan metode RSM-CCD. Faktor yang
23
mempengaruhi produksi senyawa asam fenillaktat yaitu glukosa, ekstrak khamir, sodium asetat, K2HPO4 dan Tween 80. Kondisi optimum yang dicapai pada penelitian Mu et al. (2009) ialah 3% glukosa, 0,3% K2HPO4, 0,13% sodium asetat, 3% ekstrak khamir, 0,3% Tween 80 dan 0,5% asam fenilpiruvat. Maksimum asam fenillaktat yang dihasilkan ialah 0,23%.
Hasil tersebut berbeda dengan yang telah dilakukan pada penelitian ini disebabkan karena senyawa target dan metode yang digunakan untuk analisis berbeda. Penggunaan metode analisis dengan titrimetri, semua asam laktat tertitrasi, sedangkan analisis senyawa asam fenillaktat menggunakan HPLC lebih mudah dianalisis. Penelitian yang sama dilakukan oleh Armaforte et al. (2006) dan Prema et al. (2010) yaitu menganalisis asam fenilaktat yang diproduksi oleh
L. plantarum pada media MRS cair dengan menggunakan HPLC.
Yu et al. (2008) melaporkan optimasi produksi asam laktat dari L. rhamnosus menggunakan metode RSM untuk mengevaluasi pengaruh corn steep liquor dengan glukosa, molase, Tween 80 and MnSO4. Penggunaan corn steep liquor yaitu sebagai sumber nitrogen pengganti ekstrak khamir dan harganya murah. Maksimum produksi asam laktat yaitu 11,3% pada konsentrasi optimum glukosa, molase, corn steep liquor, Tween 80 dan MnSO4 masing-masing sebesar 11,82%, 3,73%, 4,3%, 0,152% dan 0,03%.
Liu et al. (2010) melaporkan optimasi produksi asam laktat dari termofilik
L. plantarum menggunakan berbagai sumber nitrogen alternatif dengan RSM. Sumber nitrogen yang digunakan yaitu malt sprout, corn steep liquor, NH4Cl, NH4NO3, dan diamin sitrat. Sumber N yang berpengaruh secara signifikan terhadap produksi asam laktat ialah malt sprout dan corn steep liquor dengan konsentrasi masing-masing sebesar 1,6% dan 1,2%. Konsentrasi asam laktat yang diperoleh sebesar 6,68%.
Perbedaan konsentrasi asam laktat yang dihasilkan oleh L. plantarum DR 1-6-2 yaitu mencapai konsentrasi 2,61% dengan penelitian yang dilakukan oleh Yu
et al. (2008) dan Liu et al. (2010) karena penggunaan berbagai sumber nitrogen dan dua sumber karbon yang digunakan akan meningkatkan konsentrasi asam laktat. Dalié et al. (2010) dan Lima et al. (2010) mengemukakan bahwa nitrogen dan karbon dapat meningkatkan senyawa antikapang yang dihasilkan oleh bakteri asam laktat.
5 SIMPULAN DAN SARAN