Panduan Pembuatan Master Mix QIAcuity Probe PCR Kit

(1)

1. TUJUAN

Standard Operational Procedure (SOP) ini menjelaskan tahapan penggunaan alat atau reagen dalam rangka penerapan Sistem Manajemen Mutu di PT GENECRAFT LABS

2. STANDARD OPERATIONAL PROCEDURE

Panduan pembuatan master mix menggunakan QIAcuity Probe PCR Kit

3. PENGESAHAN

Disusun Oleh Disahkan oleh

(Imam Nur Alamsyah) Product Specialist

(Ismail)

Leader Product Specialist

4. RIWAYAT PERUBAHAN

REV TANGGAL URAIAN PERUBAHAN

00 12.08.2022 Initial Issued

(2)

A. Tujuan

Panduan pembuatan mastermix untuk QIAcuity

B. Bahan dan Alat

Peralatan yang dibutuhkan:

▪ Vortex

▪ Spin down

▪ microcentrifuge tube 1,5 ml

▪ Mikropipet (2 -20 µl, 10-100 µl, 20-200 µl, 0,5- 10 µl)

▪ Tips steril (20 µl, 200 µl 100 µl, 10 µl)

▪ Disposable Free Powder Gloves Bahan-bahan yang diperlukan:

1. QIAcuity Probe PCR kit 2. Enzim restriksi (optional)

C. Prosedur

Yang harus diperhatikan sebelum memulai pembuatan mastermix:

1. Fluorescent reference dye disediakan sebagai komponen dalam QIAcuity probe atau EG mastermix, untuk deteksi dalam pengisian partisi yang tepat pada qiacuity nanoplate

2. Untuk tingkat efesiensi yang tinggi dPCR menggunakan TaqMan probes, amplicon yang baik berukuran 60-150bp. Mirip dengan qPCR, Mirip dengan qPCR, amplikon yang lebih panjang juga dapat digunakan; namun, kinerja pengujian mungkin terganggu

3. Sebelum melakukan multiplex analisis, pilih reporter dye dan quencher yang cocok dengan deteksi optic pada qiacuity.

4. Selalu mulai dengan kondisi siklus dan konsentrasi prime yang ditentukan pada protokol ini 5. Initial inkubasi step harus 2 menit dengan suhu 95 °C untuk mengaktifasi QuantiNova DNA

Polymerase pada mastermix

6. Untuk kemudahan penggunaan, direkomendasikan untuk menyiapkan campuran primer-probe dengan konsentrasi 10x atau lebih tinggi yang mengandung primer dan probe spesifik target untuk setiap target. Campuran primer-probe 10x terdiri dari 8 μM primer maju, 8 μM primer

(3)

Template DNA Digestion

 DNA sampel dengan ukuran ≥ 20 kb (misalnya genomic DNA yang dipurifikasi dengan spin column membrane silica, atau metode salting out) harus di fragmentasi dengan menggunakan enzim restriksi sebelum partisi. Fragmentasi enzimatik pada DNA dengan ukuran besar dilakukan untuk memastikan distribusi sampel pada partisi dapat terjadi dengan baik

 Fragmentasi DNA melalui restriksi penting dilakukan khususnya ketika analisis copy number variation (CNV). Restriksi tidak perlu dilakukan pada sampel highly fragmented DNA (misalnya FFPE DNA atau circulating DNA) atau cDNA

 Pemilihan enzim restriksi harus disesuaikan dengan sampel agar tidak memotong daerah gen target pada sampel. Untuk QIAGEN CNV dan mutation detection assay dapat dicek melalui geneglobe.qiagen.com

 Enzim tervalidasi berikut akan mencerna DNA dalam 10 menit pada suhu kamar (15−25°C) bila ditambahkan langsung ke campuran reaksi QIAcuity pada konsentrasi yang ditunjukkan:

Table 1. Validated restriction enzymes

Prosedur Reaction setup

(4)

1. Cairkan dan vortex QIAcuity Probe PCR kit, template DNA atau cDNA, primers, probe dan RNase-free water. Lalu spindown

2. Siapkan reaction mix sejumlah reaksi yang dibutuhkan sesuai pada tabel 2. Karena hot-start, tidak perlu menyimpan sampel di atas es selama setup reaksi atau saat memprogram instrumen QIAcuity.

Table 2. Reaction setup QIAcuity probe PCR kit

3. Vorxtex reaction mix

4. Ambil campuran mastermix sesuai dengan volume yang dibutuhkan, dan pindahkan ke tabung PCR atau PCR plate

5. Tambahkan template DNA/RNA/cDNA

Note: * Jumlah template disesuaikan dengan parameter yang akan Dikerjakan

6. Vortex dan spindown campuran mastermix yang sudah ditambahkan template DNA/RNA/cDNA

(5)

8. Seal nanoplate QIAcuity. Pastikan seal terpasang dengan baik dan sudah menutup semua bagian nanoplate dengan rapat