VERIFIKASI METODE BIOANALISIS ASAM SALISILAT DALAM PLASMA DARAH DENGAN MENGGUNAKAN LC-MS/MS

VERIFIKASI METODE BIOANALISIS ASAM SALISILAT DALAM PLASMA DARAH DENGAN MENGGUNAKAN LC-MS/MS

OLEH

FRANSISKUS HARRY SUBAGYO NPM P2.48.40.4.21.042

JURUSAN ANALISIS FARMASI DAN MAKANAN POLITEKNIK KESEHATAN KEMENKES JAKARTA II

2024

VERIFIKASI METODE BIOANALISIS ASAM SALISILAT DALAM PLASMA DARAH DENGAN MENGGUNAKAN LC-MS/MS

Karya Tulis Ilmiah Ini Diajukan sebagai Syarat Untuk Memperoleh Gelar Ahli Madya Analis Farmasi dan Makanan

OLEH

FRANSISKUS HARRY SUBAGYO NPM P2.48.40.4.21.042

JURUSAN ANALISIS FARMASI DAN MAKANAN POLITEKNIK KESEHATAN KEMENKES JAKARTA II

2024

LEMBAR PERSETUJUAN

Karya Tulis Ilmiah dengan judul

“Verifikasi Metode Bioanalisis Asam Salisilat dalam Plasma Darah Menggunakan LC-MS/MS”

Disusun oleh : Fransiskus Harry Subagyo

NPM P2.84.04.21.042

Telah disetujui untuk dipertahankan di hadapan Tim Penguji Karya Tulis Ilmiah Jurusan Analisis Farmasi dan Makanan Politeknik Kesehatan Kementerian Kesehatan Jakarta II dalam rangka Ujian Akhir Program untuk memenuhi syarat guna memperoleh Gelar Ahli Madya Analis Farmasi dan Makanan.

Jakarta, Juni 2023

Pembimbung Utama, Pembimbing Pendamping,

Joko Sulistiyo, S.T., M.Si.

NIP 196811221989031002

Patimah, S.Si., M.Farm., Apt NIP

LEMBAR PENGESAHAN

Karya Tulis Ilmiah dengan Judul

“Verifikasi Metode Bioanalisis Asam Salisilat dalam Plasma Darah Menggunakan LC-MS/MS”

Disusun Oleh : Fransiskus Harry Subagyo

NPM P2.84.04.21.042

Telah dipertahankan di hadapan Tim Penguji Karya Tulis Ilmiah Jurusan Analisis Farmasi dan Makanan Politeknik Kesehatan Kementerian Kesehatan Jakarta II dalam rangka Ujian Akhir Program untuk memenuhi syarat guna memperoleh Gelar Ahli Madya Analis Farmasi dan Makanan.

Ketua

Dodi Irwandi, M.Si NIP 198102112006041005

Jakarta, Juni 2023 Tim Penguji :

Anggota :

1. Joko Sulistiyo, S.T., M.Si.

NIP

196811221989031002

2. Patimah, S.Si., M.Farm., Apt NIP

ABSTRACT

Fransiskus Harry Subagyo “Verification of Bioanalysis Method of Salicylic Acid in Blood Plasma by Using LC-MS/MS”, under the guidance of Joko Sulistiyo, S.T., M.Si. and Patimah, S.Si., M.Farm., APT., 2024.

Aspirin is a non-steroidal anti-inflammatory drug which also has antiplatelet effects for stroke prevention. Aspirin in the body breaks down very easily into salicylic acid as the main metabolite. Verification of a bioanalysis method for drugs in blood plasma needs to be carried out for reconfirmation so that the resulting data remains valid. This test aims to verify the Salicylic Acid Bioanalysis method for routine testing which refers to the Europan Medicine Agency in 2011. This test method uses the Protein Precipitation Extraction method with an organic solvent, namely acetonitrile in 0.1% formic acid as a precipitator and diluted with acetonitrile. This test uses an Agilent Poroshell 120 EC-C18(2.7µm) 3.0mm x 50.0mm LC-MS/MS column instrument, mobile phase Acetonitrile and Ammonium Acetate (75:25) with isotactic isolation, column temperature 35°C, flow rate 0.20 mL/Minute, and Celecoxib as Internal standard. Mass detection was carried out with Electrospray Ionization (ESI) type TQ-S Micrp LC in Multiple Reaction Monitoring (MRM) electrode (ESI+) mode. Salicylic Acid was detected at 137.00 93.00 and Celecoxib was detected at 379.93 316.00. The verification parameters tested were accuracy and precision with results of % Dev 7.34% Low Limit of Quantification (LLOQ), 3.56% Quality Control Low (QCL), 3.02% Quality Control Medium (QCM), 0.97% Quality Control High (QCH) and % CV results 6.56% Low Limit of Quantification (LLOQ), 2.03% Quality Control Low (QCL), 5.72% Quality Control Medium (QCM), 3.39% Quality Control High (QCH) so it can be concluded that the Salicylic Acid bioanalysis method meets the requirements based on the 2011 Europan Medicines Agency (EMA) and can be used for routine analysis.

Keywords: salicylic acid, analytical method, bioequivalence, blood plasma, method verification, LC-MS/MS

ABSTRAK

Fransiskus Harry Subagyo “Verifikasi Metode Bioanalisis Asam Salisilat dalam Plasma Darah dengan Menggunakan LC-MS/MS”, dibawah bimbingan Joko Sulistiyo, S.T., M.Si. and Patimah, S.Si., M.Farm., APT., 2024

Aspirin merupakan obat antinflamasi non steroid yang juga mempunyai efek antiplatelet untuk pencegahan stroke. Aspirin di dalam tubuh, sangat mudah terurai menjadi asam salisilat sebagai metabolit utama. Verifikasi suatu metode bioanalisis obat dalam plasma darah perlu dilakukan untuk konfirmasi ulang sehingga data yang dihasilkan tetap valid.

Pengujian ini bertujuan untuk memverifikasi metode Bioanalisis Asam Salisilat untuk pengujian rutin yang mengacu pada Europan Medicine Agency tahun 2011. Metode Pengujian ini menggunakan metode Ekstraksi Pengendapan Protein dengan pelarut organik yaitu asetonitril dalam asam format 0,1% sebagai pengendap dan diencerkan dengan asetonitril. Pengujian ini menggunakan instrument LC-MS/MS kolom Agilent Poroshell 120 EC-C18(2.7µm) 3.0mm x 50.0mm, fase gerak Asetonitril dan Amonium Asetat (75:25) dengan isolusi isokraktik, suhu kolom 35°C, laju alir 0.20 mL/Menit, dan Celecoxib sebagai Internal standar. Deteksi massa dilakukan dengan Electrospray Ionization (ESI) tipe TQ-S Micrp LC dalam mode Multiple Reaction Monitoring (MRM) elektroda (ESI+). Asam Salisilat terdeteksi pada 137,00  93,00 dan Celecoxib terdeteksi pada 379,93  316,00. Parameter verifikasi yang diuji yaitu akurasi dan presisi dengan hasil % Dev 7,34% Low Limit of Quantification (LLOQ), 3,56% Quality Control Low (QCL), 3,02% Quality Control Medium (QCM), 0,97% Quality Control High (QCH) dan hasil % CV 6,56% Low Limit of Quantification (LLOQ), 2,03% Quality Control Low (QCL), 5,72% Quality Control Medium (QCM), 3,39% Quality Control High (QCH) sehingga dapat disimpulkan metode bioanalisis Asam Salisilat memenuhi syarat berdasarkan Europan Medicines Agency (EMA) tahun 2011 dan dapat digunakan untuk analisis rutin.

Kata Kunci: asam salisilat, metode analisis, bioekivalensi, plasma darah, verifikasi metode, LC-MS/MS

KATA PENGHANTAR

Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT, yang telah melimpahkan rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan Karya Tulis Ilmiah (KTI) ini. Adapun judul KTI ini adalah “JUDUL”.

Karya Tulis Ilmiah ini dibuat untuk memenuhi salah satu syarat kelulusan untuk memperoleh gelar Ahli Madya Kesehatan di Poltekkes Kemenkes Jakarta II Jurusan Analisis Farmasi dan Makanan.

Pada kesempatan kali ini penulis menyampaikan terimakasih terutama kepada:

1. Kedua orang tua penulis Bapak Sentot Prawiro Subagyo dan Ibu Mintju yang selalu memberikan kasih sayang, do’a, dan motivasi dalam setiap langkah hidup penulis.

2. Ibu Ai Emalia Sukmawati, S.Farm., M.Si selaku Ketua Jurusan Analisis Farmasi dan Makanan.

3. Bapak Joko Sulistiyo, S.T., M.Si. selaku pembimbing utama dan Ibu Patimah, S.Si., M.Farm., Apt. selaku pembimbing pendamping yang banyak meluangkan waktu untuk memberikan arahan dan membantu penyusunan Karya Tulis Ilmiah ini.

4. Bapak Andi Darmawan S.I.Kom selaku pembimbing Praktik Kerja Lapangan dan seluruh Kakak-kakak analis yang telah memberikan banyak ilmu dan pengetahuan kepada penulis beserta staff di PT. Biometrik Riset Indonesia.

5. Bapak/Ibu Dosen dan Staf Jurusan Analisis Farmasi dan Makanan Politeknik Kesehatan Kemenkes Jakarta II.

6. Semua pihak yang tidak bisa penulis sebutkan namanya satu per satu yang telah berperan dalam membantu dan selalu memberikan doa, semangat, dan motivasi kepada penulis.

Penulis menyadari bahwa dalam penulisan KTI ini masih banyak kekurangan, untuk itu saran dan kritik yang membangun sangat penulis harapkan.

Akhir kata penulis berharap semoga pengujian ini dapat bermanfaat bagi penulis maupun rekan-rekan lainnya.

Jakarta, Febuari 2024

i

Penulis

LEMBAR PERSETUJUAN LEMBAR PENGESAHAN ABSTRACT

ABSTRAK

DAFTAR ISI Halaman

KATA PENGHANTAR ... i

DAFTAR ISI ... iii

DAFTAR TABEL ... iii

DAFTAR GAMBAR ... iv

DAFTAR LAMPIRAN ... v

BAB I PENDAHULUAN ... 1

1.1 Latar Belakang ... 1

1.2 Perumusan Masalah ... 3

1.3 Pembatasan Masalah ... 3

1.4 Tujuan ... 3

1.4.1 Tujuan Umum ... 3

1.4.2 Tujuan Khusus ... 3

1.5 Manfaat ... 3

1.5.1 Bagi Mahasiswa ... 3

1.5.2 Bagi Masyarakat ... 3

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ... 4

BAB III METODE PENGUJIAN ... 22

BAB IV HASIL PENGUJIAN DAN PEMBAHASAN ... 34

BAB V SIMPULAN DAN SARAN ... 44

5.1 Simpulan ... 44

5.2 Saran ... 44

DAFTAR PUSTAKA ... 45

LAMPIRAN ... 47

DAFTAR TABEL

No. Nama Tabel Halaman

iii

DAFTAR GAMBAR

DAFTAR LAMPIRAN

No. Nama Lampiran Halaman

BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang

Obat analgetik antipiretik sering digunakan dalam pengobatan sendiri untuk mengatasi rasa nyeri dan demam. Analgetik yang sering dikenal dengan obat pereda nyeri merupakan obat yang memiliki kemampuan untuk meredakan nyeri pada tubuh, sedangkan antipiretik merupakan obat yang sering digunakan untuk menurunkan demam dari suhu tubuh yang tinggi ke suhu tubuh yang normal.

Namun jika obat analgetik dan obat antipiretik dikonsumsi secara tidak tepat (tidak rasional), mungkin dapat memiliki resiko efek samping yang negatif seperti reaksi hemodinamik termasuk hipotensi, penurunan fungsi hati dan ginjal yang terjadi dengan penggunaan jangka panjang. Selain efek samping analgetik dapat mengganggu fungsi hati, ginjal, saluran cerna, pankreas, dan memicu reaksi hipersensitivitas pada beberapa orang.(pendahuluan as 5).

Obat golongan salisilat merupakan salah satu obat yang paling sering digunakan karena mempunyasi sifat analgesic, antipiretik, antiinflamasi, antireumatik, dan yang paling mutakhir adalah sebagai antiagregasi trombosit (antitrombotik) atau antiplatelet. Salisilat tersedia dalam berbagai bentuk sediaan obat, diantaranya topical, tablet, serbuk, dan supositoria. Selain bentuk regular, salisilat juga tersedia dalam bentuk tablet salut selaput yang diharapkan akan mengalami disolusi dalam usus halus.(penahuluan asam salisilat 2)

Obat golongan asam salisilat yang paling banyak digunakan adalah aspirin (asam asetil salisilat). Sampai saat ini obat ini masi merupakan analgesic- antipiretik dan antiinflamasi yang paling banyak diresepkan dan menjadi standar untuk pembanding atau evaluasi antiinflamasi lainnya. .(penahuluan asam salisilat 2)

Aspirin merupakan golongan obat antiinflamasi non steroid (AINS) yang memiliki efek analgesik, antipiretik, dan antiinflamasi. Indikasinya yaitu nyeri (ringan-sedang), antiplatelet pada terapi kardiovaskular dan stroke, rheumatoid artritis, osteoarthritis, dan gout.3,4,5 Mekanisme kerja dari aspirin yaitu menghambat enzim siklooksigenase (COX) terutama siklooksigenase-1 (COX-1) sehingga terjadi penghambatan biosintesis prostaglandin dan tromboksan dari asam arakhidonat.(spendahuluan salisilat4)

Aspirin dalam pengunaannya untuk analgesik, anti inflamasi dan antipiretik yang sangat luas penggunaannya. Dalam dosis rendah, aspirin digunakan sebagai

6

zat antitrombosis untuk mencegah agregasi penghambatan enzim platelet melalui siklooksigenase. Aspirin diabsorpsi secara cepat di saluran pencernaan bagian atas, terutama di bagian pertama duodenum.1,2 Setelah pemberian secara oral, aspirin terhidrolisis secara cepat di dalam tubuh menghasilkan asam salisilat sebagai metabolit utama.3 Bioavailabilitas aspirin rendah akibat first pass effect metabolism dan hidrolisis menjadi salisilat di dinding usus.4 Banyak penelitian melaporkan bioavailabilitas aspirin dalam bentuk asam salisilat.5 Oleh karena itu, pemantauan asam salisilat sebagai metabolit utama dalam darah bersama-sama aspirin sangat diperlukan untuk menentukan profil farmakokinetik aspirin.

(pendahuluan asam salisilat 1)

Therapeutic Drug Monitoring (TDM) sering juga disebut Therapy Monitoring yang merupakan suatu cara untuk mengukur konsentrasi obat dalam plasma sekaligus mengetahui interprestasinya. Pada dasarnya, TDM merupakan salah satu upaya menginterprestasikan ilmu farmakokinetika dan farmakodinamika, dengan mengukur kosentrasi obat dalam plasma untuk mengoptimalkan dan malakukan individualisasi dosis sehingga sesuai untuk pasien. Hasil dari TDM ini dimanfaatkan untuk mengevaluasi derajat respon terapi suatu obat, memberikan informasi yang bermanfaat mengenai kesesuain terapi obat, evaluasi kepatuhan pasien terhadap dosis yang diberikan, mendeteksi kemungkinan efek samping dan toksisitas suatu obat, mengkonfirmasi kemungkinan adanya ineteraksi obat, serta untuk penyesuaian dosis obat.

Berdasarkan Peraturan Kepala Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia Nomor HK.00.05.3.1818 tahun 2005 tentang Pedoman Uji Bioekivalensi, salah satu parameter mutu yang dibutuhkan untuk produk obat

"copy" adalah bioekivalensi dengan produk obat inovator sebagai produk pembanding. Obat copy merupakan produk obat yang mempunyai ekuivalensi farmaseutik atau merupakan alternatif farmaseutik dengan produk obat inovator/pembandingnya dan dapat dipasarkan dengan nama dagang. Untuk mendapatkan nilai bioekivalensi perlu dilakukan uji bioekivalensi. Uji bioekivalensi adalah uji bioavailabilitas komparatif untuk menunjukkan bioekivalensi antar produk obat uji dengan obat pembanding (8).

Dalam melakukan uji bioekivalensi digunakan metode bioanalisis yaitu pemeriksaan kadar obat dalam plasma darah karena pada pengujian ini senyawa Carvedilol terdapat dalam plasma darah. Uji bioekivalensi harus dilakukan dengan metode yang telah divalidasi dan diverifikasi. Pada pengujian ini, metode yang 7

digunakan bersumber dari perpaduan European Medicine Agency (EMA) tahun 2011 dan beberapa jurnal yang telah divalidasi. Namun metode tersebut sudah lama tidak digunakan dalam laboratorium sehingga diperlukan uji verifikasi untuk memastikan kembali bahwa metode uji yang akan digunakan menghasilkan data yang valid. Parameter verifikasi metode yang diuji dalam pengujian ini adalah akurasi dan presisi yang dianalisis menggunakan LC-MS/MS, LC-MS/MS yang merupakan teknik umum yang digunakan dalam penentuan konsentrasi obat dalam matriks biologis karena mampu menganalisis senyawa dalam sampel pada konsentrasi rendah secara spesifik.

1.2 Perumusan Masalah

Perumusan masalah dari pengujian ini adalah apakah hasil dari verifikasi metode bioanalisis Asam Salisilat dalam plasma darah dengan menggunakan LC- MS/MS memenuhi syarat atau tidak berdasarkan dengan Europen Medicine Agency (EMA) tahun 2011.

1.3 Pembatasan Masalah

Pengujian ini dibatasi hanya pada verifikasi metode bioanalisis Asam Salisilat dalam plasma darah dengan menggunakan LC-MS/MS dengan menggunakan parameter akurasi dan presisi.

1.4 Tujuan

1.4.1 Tujuan Umum

Tujuan umum dari pengujian ini yaitu melakukan verifikasi terhadap metode bioanalisis Asam Salisilat dalam plasma darah dengan menggunakan LC-MS/MS yang digunakan untuk pengujian rutin.

1.4.2 Tujuan Khusus

Tujuan khusus ini hanya pada verifikasi metode bioanalisis Asam Salisilat dalam plasma darah dengan menggunakan LC-MS/MS dengan parameter akurasi dan presisi.

1.5 Manfaat

1.5.1 Bagi Mahasiswa

Karya tulis ini diharapkan dapat dijadikan acuan, dan pengujian ini dimasukkan untuk menambah wawasan, pengetahuan, dan pengalaman yang berlaku pada praktik laboratorium yang sesuai.

1.5.2 Bagi Masyarakat

Karya tulis ilmiah ini untuk masyrakat diharapkan dapat memberikan manfaat untuk memberika informasi mengenai verifikasi metode bioanalisis Asam Salisilat yang digunakan di laboratorium bioanalisa atau bioekivalensi.

8

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Landasan Teori

Darah

Darah merupakan cairan yang terdapat di dalam pembuluh darah yang memiliki fungsi mengatur keseimbangan asam dan basa, mentransportasikan O2, karbohidrat, dan metabolit, mengatur suhu tubuh dengan cara konduksi atau hantaran, membawa panas tubuh dari pusat produksi panas (hepar dan otot) untuk didistribusikan ke seluruh tubuh, dan pengaturn hormon dengan membawa dan mengantarkan dari kelenjar ke sasaran. Jumlah dalam tubuh bervariasi, tergantung dari berat badan seseorang. Pada orang dewasa, 1/13 berat badan atau kira-kira 4,5- 5 liternya adalah darah. Faktor lain yang menentukan banyaknya darah adalah usia, pekerjaan, keadaan jantung, dan pembuluh darah.

Darah seperti yang telah didefinisikan dan yang dapat dilihat, adalah suatu cairan tubuh yang berwarna merah dan kental. Kedua sifat utama ini, yaitu warna merah dan kental, yang membedakan darah dari cairan tubuh lainnya. Kekentalan ini disebabkan oleh banyaknya senyawa dengan berat molekul yang berbeda, dari yang kecil sampai yang besar seperti protein, yang terlarut didalam darah. Warna merah, yang memberi ciri yang sangat khas bagi darah, disebabkan oleh senyawa berwarna merah yang terdapat dalam sel-sel darah merah yang tersuspensi dalam darah.

Darah merupakan komponen esensial makhluk hidup, hewan dan manusia.

Darah selalu berada dalam pembuluh darah sehingga dapat menjalankan fungsinya sebagai pembawa O2 (oxygen 6 carrier), mekanisme pertahanan tubuh terhadap infeksi, dan mekanisme hemostasis.

Karakteristik Darah

Menurut Karakteristik umum darah meliputi warna, viskositas, pH, volume, dan komposisinya. Darah arteri berwarna merah muda karena banyak O2 yang berkaitan dengan hemoglobin dalam sel darah merah. Darah vena berwarna merah gelap/tua karena kurang O2, dibandingkan dengan darah arteri. Viskositas darah ¾ lebih tinggi dari pada viskositas air yaitu sebesar 1.048-1.006. pH darah bersifat alkaline dengan pH 7.35-7.45 (netral 7.00).

9

Pada orang dewasa volume darah sekitar 70-75 ml/kg BB, sekitar 4-5 liter.

Menurut Sadikin (2002) secara garis besar dapat dikatakan, bahwa fungsi darah ialah sebagai sarana transpor, alat homeostasis, dan alat pertahanan.

Komponen Darah a. Plasma Darah

Plasma darah tersusun atas 90% air dan 10% bahan-bahan terlarut yang terdiri dari 7% protein, 1% garam-garam mineral, dan 2% lemak. Fungsi dari plasma darah antara lain:

 Sebagai bahan pelarut bahan-bahan kimia

 Membawa mineral-mineral terlarut, glukosa dan asam amino, vitamin karbondioksida (sebagai ion hidrogen karbonat) dan bahan-bahan buanagn

 Menyebarkan panas dari organ yang lebih hangat ke organ yang lebih dingin

 Menjaga keseimbangan antara cairan di dalam sel dan cairan di luar sel.

Plasma mengandung protein-protein penting, seperti fibrinogen, globulin, albumin¸ dan lipoprotein. Fibrinogen berfungsi dalam pembekuan darah. Globulin berperan dalam pertahanan tubuh. Sementara itu, albumin berperan membantu aliran darah dan membantu tekanan osmotic darah. Protein-protein tersebut dapat dipisahkan dari plasma dan membentuk cairan yang disebut serum.

b. Butir-butir Darah

1. Sel Darah Merah (Eritosit)

Fungsi eritrosit untuk mengangkat oksigen dari paru-paru untuk diedarkan ke seluruh tubuh. Eritrosit mampu mengikat oksigen karena memiliki hemoglobin (Hb). Hemoglobin merupakan suatu protein khusus yang mengandung zat besi yang mampu mengikat oksigen.

Dalam setiap eritrosit terdapat sekitar 25 juta molekul Hb. Tiap molekul Hb dapat membawa empat molekul oksigen, hal itu berarti setiap kali eritrosit keluar dari paru-paru, ia membawa sekitar satu miliar oksigen.

2. Sel Darah Putih (Leukosit)

Leukosit merupakan sel yang memiliki fungsi khusus untuk pertahanan tubuh dari serangan mikroorganisme. Leukosit merupakan sel yang memiliki sifat seperti amoeba, yaitu dapat berubah-ubah. Leukosit dapat bergerak bebas, bahkan dapat keluar dari pembuluh darah dan masuk ke dalam jaringan lain yang terinfeksi mikroorganisme

10

3. Keping-keping Darah (Trombosit)

Trombosit atau keping-keping darah memiliki bentuk tidak teratur, tidak memiliki inti sel dan berukuran sangat kecil. Jumlahnya di dalam darah sekitar 150-400 ribu/ul. Trombosit berperan dalam pembekuan darah apabila terjadi luka dalam pembuluh darah, dengan demikian darah tidak banyak tebuang. Trombosit beredar didalam darah dan dibentuk oleh sel-sel besar yang ada di dalam sumsum tulang

2.1.1.1 Fungsi Darah (21)

a. Sebagai alat transportasi, misalnya :

1) Alat transpor makanan, yang diserap dari saluran cerna dan diedarkan ke seluruh tubuh.

2) Alat transport O2, yang diambil dari paru-paru untuk dibawa keseluruh tubuh.

3) Alat transpor bahan buangan dari jaringan ke alat-alat ekskresi untuk diteruskan ke empedu dan saluran cerna sebagai tinja.

4) Sebagai alat transport antar jaringan dari bahan-bahan yang dibutuhkan oleh suatu jaringan dibuat oleh jaringan lain.

5) Mepertahankan homeostasis dalam tubuh, termasuk didalamnya adalah mempertahankan suhu tubuh, mengatur keseimbangan distribusi air dan mempertahankan keseimbangan asam-basa sehingga pH yang dimiliki darah dan cairan tubuh lainnya tetap dalam keadaan yang seharusnya. Mempertahankan tubuh dari agresi benda atau seyawa asing yang umumnya dianggap mempunyai potensi menimbulkan ancaman

6) Sebagai obat jika darah tersebut sehat, seperti hemodialisa dan trnasfusi darah.

LC – MS/MS (Liquid Chromatography – Mass Spectrometry)

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC) adalah salah satunya teknik analisis yang paling umum digunakan dalam bidang farmasi industri untuk penentuan dan kuantifikasi zat obat dan zat terkaitnya. Karena reproduktifitas dan akurasi yang tinggi, HPLC secara rutin digunakan dalam bidang farmasi, kimia dan pestisida industri. Liquid Chromatography – Mass Spectrometry (LC-MS) adalah teknik analisis tanda hubung yang merupakan kombinasi dari Kromatografi Cair (LC) dan Spektrometri Massa (MS). HPLC (LC) memisahkan komponen-komponen campuran

11

dengan melewatinya kolom kromatografi. Umumnya komponen dipisahkan tidak dapat diidentifikasi secara positif LC saja. Spektrometri Massa juga digunakan untuk identifikasi senyawa yang tidak diketahui, senyawa yang diketahui dan untuk menjelaskan strukturnya. Spektrometri massa tidak sendirian baik untuk mengidentifikasi campuran karena campuran spektrum massa sebenarnya kompleks spektrum yang tumpang tindih dari individu yang terpisah komponen. Sulitnya menghubungkan Kromatografi cair (LC) dengan Spektrometri massa (MS). Hubungan digunakan untuk mentransfer eluen cair dari LC ke MS. LC-MS lebih banyak digunakan dalam mengundang studi disolusi, bioavailabilitas, bioekivalensi dan farmakodinamik . Sistem LC-MS preparatif dapat digunakan untuk pemurnian zat tertentu secara massal dan cepat dari zat tersebut campuran yang penting dalam penelitian dasar, farmasi, agrokimia, makanan dan industri lainnya.

Kromatografi Cair (LC) adalah kromatografi cair kinerja tinggi yang pemisahan komponen campuran dapat dilakukan dengan menggunakan fase diam bergerak cair dan fase diam padat. Ada berbagai jenis kromatografi seperti kromatografi cair fase normal, Terbalik kromatografi fasa, kromatografi cair penukar ion, Pemisahan kiral dan kromatografi cair afinitas. Dengan menggunakan pengepakan kolom yang berbeda dengan efisiensi tinggi dalam jumlah kecil campuran kompleks dapat dipisahkan.

Komponen LC – MS/MS a. Pompa

Terdiri dari bahan yang bersifat inert pelarut atau komposisi campuran buffer berair dan Pelarut organik. Ini memberikan peningkatan fase seluler dalam jumlah besar hingga 10mL/menit. Ada tiga jenis pompa utama yang digunakan yaitu pompa reciprocating, pompa Syringe dan tekanan konstan pompa.

b. Sampel Injektor

Ini digunakan untuk memperkenalkan volume sampel ke dalam sistem kromatografi. Umumnya volume sampel dari 1µL hingga 100µL dapat disuntikkan. Volume injeksi bisa ditingkatkan dengan loop injektor hingga volume 2mL. Ada dua jenis injektor utama yang digunakan yaitu injektor otomatis dan Injektor manual. Injektor otomatis lebih nyaman dan ramah pengguna serta lebih akurat dan tepat dibandingkan ke injektor manual

12

c. Kolom

Merupakan fasa diam yang terdiri dari silika bahan dalam kombinasi dengan rantai karbon. Umumnya panjang kolom yang digunakan sekitar 50mm hingga 300mm. Kolom yang digunakan dalam HPLC terdiri dari Octadecyl (C18), Octyl (C8), Cyano, Amino, pengepakan Phenyl. Kolom digunakan berdasarkan sifat senyawa yang akan dipisahkan

d. Detektor dan Recorder

Detektor adalah yang paling penting bagian dari HPLC. Ada berbagai jenis detektor yang digunakan Detektor UV-Visible, Detektor PDA, Indeks Bias (RI) detektor, Detektor elektrokimia, Detektor fluoresensi dan detektor konduktivitas.

Sinyal diterima dari detektor dapat direkam sebagai puncak dan masing-masing data dapat disimpan dalam perangkat lunak

Prinsip LC – MS/MS

Setelah sampel dipisahkan dengan kromatografi cair, masing-masing komponen masuk ke detektor spektrometer massa secara bergantian, dan setiap komponen terionisasi pada sumber ion, menghasilkan ion dengan muatan tertentu dan nomor massa yang berbeda. Ion terionisasi pada sumber ion untuk menghasilkan ion dengan muatan dan nomor massa yang berbeda. Ion-ion dipisahkan oleh penganalisis massa menurut rasio massa-ke-muatan yang berbeda (m/z), dan spektrum massa diperoleh dalam urutan rasio massa-ke-muatan. Hasil kualitatif dan kuantitatif sampel dapat diperoleh dengan pengolahan analitik spektrum massa.

Kelebihan LC-MS/MS

Menurut (26) Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry (LC- MS/MS) merupakan satu-satunya teknik kromatografi cair dengan detektor spektrometer massa. Penggunaan LC-MS/MS untuk penelitian bio-analisis dimulai pada akhir 1980-an. Kelebihan dari teknologi LC-MS/MS meliputi:

a. Spesifitas. Hasil Analisis yang khas dan spesifik diperoleh dari penggunaan spectrometer massa sebagai detector.

b. Aplikasi yang luas dengan sistem yang praktis Berbeda dengan GC-MS sebagai spektrometer musa "klasik", penerapan LC-MS/MS tidak terbatas untuk molekul volatil (biasanya dengan berat molekul dibawah 500 Da). Mampu mengukur analit yang sangat polar, selain itu persiapan sampel cukup sederhana tanpa adanya teknik derivatisasi.

13

c. Fleksibilitas. Pengujian yang berbeda dapat dikembangkan dengan tingkat fleksibilitas yang tinggi dan waktu yang singkat.

d. Kaya Informasi. Sejumlah data kuantitatif maupun kualitatif dapat diperoleh. Hal ini disebabkan seleksi ion yang sangat cepat dengan banyak parameter,

Spektrofotometer Massa

Spektrofotometer massa bekerja dengan molekul pengion yang kemudian akan memilah dan mengidentifikasi ion menurut massa, sesuai rasio fragmentasi mereka.

Dua komponen kunci dalam proses ini adalah sumber ion (ion source) yang akan menghasilkan ion, dan analisis massa (mass analyzer) yang menseleksi ion . Menurut Komponen dari spektrometri massa yaitu :

1) Ion Source (Sumber Pengion)

Ada berbagai macam teknik ionisasi yang digunakan pada spektrometri massa. Hal yang harus dipertimbangkan dalam pemilihan teknik ionisasi antara lain energi internal yang dipindahkan pada saat proses ionisasi dan sifat fisikokimia dari analit yang dapat diionisasi. Metode ionisasi yang berkembang antara lain; electrospray ionization (ESI), atmospheric pressure chemical ionization (APCI), Atmospheric pressure photo-ionization (APPI), dan matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI).

a. Electrospray ionization (ESI)

Ionisasi dengan ESI melalui 3 tahap; produksi tetesan bermuatan, pengurangan ukuran tetesan bermuatan dan fase gas pembentukan ion. Tahap pertama, analit bersama dengan eluen dari Kromatografi cair dipompa masuk menuju kapiler. Di dalam kapiler terdapat anoda (kutup negatif) pada taylor cone dan katoda (kutup negatif) pada kapiler. Kutup ini berfungsi agar muatan yang berkumpul pada taylor cone adalah muatan positif sehingga nantinya saat terjadi penyemprotan dan terbentuk droplet (tetesan) tidak bergabung menjadi tetesan yang lebih besar lagi. Didalam kapiler yang sangat sempit dan bertegangan tinggi akan terjadi nebulasi, analit berinteraksi dengan lapisan permukaan pelarut menghasilkan tetesan

14

bermuatan positif/negatif. Tahap kedua, tetesan bermuatan ini akan mengalami pengurangan ukuran karena menguapnya pelarut, meningkatnya kerapatan muatan pada partikel sehingga meningkatkan tegangan permukaan dan tetesan akan pecah menjadi tetesan-tetesan lebih kecil (a. Analit dengan satu muatan dan beberapa muatan (analit ion), b. Satu analit bersama solven yang diliputi muatan positif, c. Beberapa analit bersama beberapa solven diliputi beberapa analit). Tahap terakhir, analit ion akan masuk ke dalam cone dimana di sisi kiri dan kanannya sudah mengalir gas nitrogen, gas ini berfungsi agar analit yang terbentuk stabil dan tidak terganggu oleh gas oksigen. Tetesan tersebut ditransfer melalui lubang kapiler penganalisis massa.

b. Atmospheric pressure chemical (APCI)

Teknik ionisasi yang menggunakan reaksi fase gas ion-molekul pada tekanan atmosfer. Secara umum digunakan untuk senyawa polar dan relatif non polar, dengan berat molekular sedang sekitar 1500 Da dan memberikan ion muatan tunggal. Analit dalam larutan dimasukkan ke dalam nebulizer, larutan dirubah menjadi uap tipis oleh nitrogen berkecepatan tinggi. Kemudian diteruskan ke korona dan terjadi ionisasi, ion-ion dari sumber ion bereaksi dengan analit dan mengionisasi melalui transfer muatan.

c. Atmospheric Pressure Photoionization (APPI)

APPI Merupakan salah satu perkembangan terakhir dari sumber ion yang memanfaatkan tekanan atmosferik. Prinsipnya adalah dengan menggunakan foton untuk mengionisasi molekul fase gas. Sampel dalam larutan diuapkan dengan pemanasan nebulizer mirip dengan metode pada APCI. Setelah penguapan, analit berinteraksi dengan foton yang dipancarkan oleh lampu pelepas. Foton ini memicu rangkaian reaksi fase gas yang mengarah pada proses ionisasi molekul sampel. Perbedaan dari metode APCI adalah adanya penggunaan lampu pemancar foton. Manfaat dari metode ini adalah metode ini mempunyai potensi untuk mengionisasi senyawa non-polar, efisien untuk analisis senyawa kelas flavonoid, steroid, pestisida, hidrokarbon poliaromatik.

15

2) Mass Analyzer (penganalisis massa)

Setelah terbentuk ion fase gas, maka ion-ion dipisahkan berdasarkan massa masing-masing, sifat fisika ion yang diukur oleh mass analyzer adalah rasio massa terhadap muatan (m/z). Karenanya, untuk ion bermuatan ganda, nilai m/z adalah bagian farksional dari massa aktual. Mass analyzer yang umum digunakan meliputi quadrupole, ion trap, time-of-flight (TOF), fourier transform-ion cyclotron resonance (FT-ICR).

a. Quadrupole

Sebuah analisis massa quadrupole terdiri dari empat batang paralel diatur dalam persegi. Ion analit diarahkan ke bagian tengah persegi. Tegangan yang dialirkan pada batang menghasilkan bidang elektromagnetik. Bidang ini menentukan rasio masa yang dapat melewati filter pada waktu tertentu.

Quadrupoles cenderung merupakan analisis massa yang paling sederhana dan paling murah.

b. Time-of-Flight (TOF)

Pada analisis massa time-of-flight (TOF), sebuah gaya elektromagnetik yang seragam diterapkan untuk semua ion pada waktu yang sama. Hal ini menyebabkan ion akan dipercepat menyusuri tabung penerbangan. Ion yang lebih ringan berjalan lebih cepat dan tiba pada detektor paling awal, sehingga rasio fragmentasi ion ^/ itentukan oleh waktu kedatangan mereka. Analisis massa (TOF) memiliki kisaran massa yang luas dan sangat akurat pada pengukuran massa suatu senyawa.

c. Perangkap Ion

Analisis massa perangkap ion massa terdiri dari elektroda melingkar cincin dua penutup di kedua ujungnya yang bersama-sama membentuk sebuah ruang. Ion memasuki ruang dan terjebak oleh medan elektromagnetik. Bidang lain digunakan untuk mengeluarkan dengan selektif dari dalam perangkap.

Perangkap ion memiliki kelebihan dapat melakukan beberapa tahapan pengukuran spektrometer massa tanpa analisis massa tambahan.

d. Fourier transform-ion cyclotron resonance (FT-ICR)

Analisis massa FT-ICR merupakan jenis lain dari analisis massa perangkap ion. Ion memasuki ruangan dan terjebak dalam lingkaran orbit oleh medan listrik dan medan magnet yang kuat. Ketika terjadi eksitasi oleh

16

frekuensi radio (RF) pada medan listrik, ion menghasilkan arus yang bergantung pada waktu. Arus ini dikonversi oleh fourier menjadi frekuensi orbital dari ion yang sesuai dengan rasio muatan massa senyawa. Seperti perangkap ion, analisis massa FT-ICR dapat melakukan beberapa tahapan spektrometri massa tanpa analisis massa tambahan. FT-ICR juga memiliki rentang massa yang lebar dan resolusi massa yang sangat baik. FT-ICR merupakan analisis massa termahal diantara yang lain.

3) Detektor

Detektor merupakan alat penting spektrometer massa itu menghasilkan arus yang sebanding dengan jumlah ion serang itu. Setelah ion-ion terbentuk dilewatkan dari analisa yang dimilikinya untuk dideteksi dan diubah menjadi sinyal. Terdapat dua jenis detektor yang umum digunakan. Detektor Kolektor Ion Titik Dalam hal ini pengumpul ion ditempatkan pada titik massa yang tetap spektrometer. Semua ion terfokus pada detektor yang terletak pada satu titik. Kedatangan ion dapat dicatat dengan aliran arus listrik dan data dapat direkam. Arus listrik aliran sebanding dengan ion yang tiba di titik detektor ion. Detektor Array Detektor Array adalah kumpulan pengumpul titik yang ditempatkan di dalamnya pesawat. Ion-ion tersebut tiba pada suatu titik atau melintasi bidang secara berurutan detektor. Ion- ion dengan nilai massa terhadap muatan (m/z) dipisahkan dan direkam sepanjang bidang menggunakan pengumpul ion titik. Secara spasial ion-ion yang terdiferensiasi dengan rentang massa terdeteksi secara bersamaan pada saat yang sama di detektor array.

17

BAB III

METODE PENGUJIAN 3.1 Waktu dan Lokasi Pengujian

3.1.1 Waktu Pengujian

Pengujian dilakukan pada tanggal 11 – 12 Maret 2024 3.1.2 Lokasi Pengujian

Pengujian ini dilakukan di Laboratorium Bioavailabilitas dan Bioekuivalensi PT. Biometrik Riset Indonesia yang berada di Ruko Brickhouse, Jlan Raya Bogor Km 31, No.52 Unit H dan I, Cisalak, Kecamatan Sukmajaya, Kota Depok, Jawa Barat, 16416.

3.2 Prosedur Pengujian 3.2.1 Prinsip Pengujian

Verifikasi metode Asam Salisilat parameter akurasi dan presisi dalam plasma darah dengan menggunakan liquid chromatography-mass spectrometry (LC- MS/MS).

3.2.2 Metode Pengujian

Liquid Chromatography-Mass Spectrometry 3.2.2.1 Sistem Kromatografi

a. Sistem LC : Waters, Acquity BSM J16BUR9377G; Acquity Sample Manager-FL J16UFL871M; Xevo TQ-S Micro QEA0531

b. Software Pengujian : MassLynx V4.1

c. Kolom : Agilent Poroshell 120 EC-C18 (2.7µm) 3.0mm x 50.0mm d. Laju Alir : 0,20 mL/Menit

e. Fase Gerak : Acetonitrile : Ammonium Acetate 5mM (75 : 25) f. Suhu Kolom : 35°C

g. Suhu autosampler : 10°C h. Volume injeksi : 10 µL

3.2.2.2 Preparasi Standar Kerja 1.1. Preparasi reagen dan Fase Gerak

18

a. Amonium Asetat 5mM

Timbang 192.70 mg ammonium asetat, larutan kedalam 500 mL aquadest, homogenisasikan b. 0.10% Asam Format didalam Asetonitril

Pipet 500 µL larutan asam format didalam 500 mL asetonitril, homogenisasikan

1.2. Pembuatan Larutan Stok Asam Salisilat LSS, Working Solution (WS) Asam Salisilat, Larutan Stok QC Asam Salisilat LSQC, Working Solution QC (WSQC) Asam Salisilat, Larutan Stock Celecoxib (LSIS) dan Working Solution Celecoxib (WSIS).

a. Pembuatan Larutan Stok Standar Asam Salisilat 1000000 ng/mL dalam Metanol

Ditimbang sejumlah Baku Pembanding Asam Salisilat setara dengan 5.00 mg Asam Salisilat yang telah diperhitungkan terhadap kadarnya dalam Sertifikat Analisa, dihomogenkan dalam 3 mL 0.10% asam format didalam asetonitril menggunakan ultra sonic hingga larut sempurna, kemudian ditambahkan dengan 0.10% asam format didalam asetonitril sampai tanda batas hingga diperoleh kadar 1000000 ng/mL pada labu ukur 5 mL (LSS). Penimbangan zat aktif pada saat bioanalisis direkam pada Form - Lembar Kerja Penimbangan.

b. Pembuatan Working Standar Solution (WSS-A) dalam 0.10% asam format didalam asetonitril :

Dipipet sejumlah LSS sesuai dengan kolom 3 pada table di bawah ini dan diencerkan menggunakan 0.10% asam format didalam asetonitril hingga volume yang tertera pada kolom 4 untuk memperoleh konsentrasi akhir pada kolom 5 Tabel 1.

Tabel 1: Matrik Pengenceran WSS-A

No.

Pengenceran dengan 0.10% asam format didalam asetonitril

Nama Larutan WSS Konsentrasi Awal

LSS

Volume LSS yang dipipet

(µL)

Volume Akhir (mL)

Konsentrasi WSS (ng/mL)

(1) (2) (3) (4) (5) (6)

1 1000000 500 5 100000 WSS-A

c. Pembuatan Working Standar Solution (WSS1 – WS8) dalam 0.10% asam format didalam asetonitril :

Dipipet sejumlah WSS-A sesuai dengan kolom 3 pada table di bawah ini dan diencerkan menggunakan 0.10% asam format didalam asetonitril hingga volume yang tertera pada kolom 4 untuk memperoleh konsentrasi akhir pada kolom 5 Tabel 2.

Tabel 2: Matrik Pengenceran WSS 1 - WSS 8

19

No.

Pengenceran dengan 0.10% asam format didalam asetonitril Nama Lar uta n W SS Konsentrasi Awal

WSS-A / WSS-B

Volume WSS-A / WSS-B

yang dipipet (µL)

Volume Akhir (mL)

Konsentrasi WSS (ng/mL)

(1) (2) (3) (4) (5) (6)

1 100000 25 5 500 WSS-1

2 100000 50 5 1000 WSS-2

3 100000 200 2 10000 WSS-3

4 1000000 40 2 20000 WSS-4

5 1000000 80 2 40000 WSS-5

6 1000000 120 2 60000 WSS-6

7 1000000 160 2 80000 WSS-7

8 1000000 200 2 100000 WSS-8

d. Pembuatan Larutan Kurva Kalibrasi dalam plasma.

Dipipet sejumlah WSS-1 sampai WSS-8 sesuai dengan kolom 3 pada tabel dibawah ini, kemudian diencerkan menggunakan plasma dengan volume yang tertera pada kolom 4 untuk memperoleh konsentrasi akhir pada kolom 5 di Tabel 3.

Tabel 3 : Matrix Preparasi Standar

No.

Pengenceran dengan Plasma Nama

Lar uta n KK Konsentrasi Awal

WSS (ng/mL)

Volume WSS yang dipipet (µL)

Volume Plasma (µL)

Konsentrasi KK (ng/mL)

(1) (2) (3) (4) (5) (6)

1 500 20 180 50.00 KK 1

2 1000 20 180 100.00 KK 2

3 10000 20 180 1000.00 KK 3

4 20000 20 180 2000.00 KK 4

5 40000 20 180 4000.00 KK 5

6 60000 20 180 6000.00 KK 6

7 80000 20 180 8000.00 KK 7

8 100000 20 180 10000.00 KK 8

e. Pembuatan Larutan Stok QC Asam Salisilat 1000000 ng/mL dalam 0.10% asam format didalam asetonitril. Ditimbang sejumlah Baku Pembanding Asam Salisilat setara dengan 5.00 mg Asam Salisilat yang telah diperhitungkan terhadap kadarnya dalam Sertifikat Analisa, dihomogenkan dalam 3 mL 0.10% asam format didalam asetonitril menggunakan ultra sonic hingga larut sempurna, kemudian ditambahkan dengan 0.10% asam format didalam asetonitril sampai tanda batas hingga diperoleh kadar

20

1000000 ng/mL pada labu ukur 5 mL (LSQC). Penimbangan zat aktif pada saat bioanalisis direkam pada Form - Lembar Kerja Penimbangan (No. Dokumen: Form-7.2-1-7).

f. Pembuatan Working Standar Solution Asam Salisilat (WSQC-A dan WSQC-B) dalam 0.10% asam format didalam asetonitril :

Dipipet sejumlah LSQC sesuai dengan kolom 2 pada tabel di bawah ini dan diencerkan menggunakan 0.10% asam format didalam asetonitril hingga volume yang tertera pada kolom 3 untuk memperoleh konsentrasi akhir pada kolom 4 Tabel 4.

Tabel 4: Matrik Pengenceran WSQC-A dan WSQC-B

No.

Pengenceran dengan 0.10% asam format didalam asetonitril Nama Larutan WSQC Konsentrasi Awal

LSQC

Volume yang

dipipet (µL)

Volume Akhir (mL)

Konsentrasi WSQC (ng/mL)

(1) (2) (3) (4) (5) (6)

1 1000000 500 5 100000 WSQC-A

g. Pembuatan Working Standar Solution QC Asam Salisilat (WSQC Low – WSQC High) dalam 0.10% asam format didalam asetonitril.

Dipipet sejumlah WSQC-A atau WSQC-B sesuai dengan kolom 4 pada tabel dibawah ini, kemudian diencerkan menggunakan 0.10% asam format didalam asetonitril hingga volume yang tertera pada kolom 4 untuk memperoleh konsentrasi akhir pada kolom 5 Tabel 5.

Tabel 5 : Pengenceran WSQC

No.

Pengenceran dengan 0.10% asam format didalam asetonitril

Nama Larutan WSQC Konsentrasi Awal

WSQC-A atau WSQC- B (ng/mL)

Volume WSQC-A atau WSQC-B yang dipipet (µL)

Volume Akhir (mL)

Konsentrasi WSQC (ng/mL)

(1) (2) (3) (4) (5) (6)

1 100000 30 2 1500 WSQC-Low

2 1000000 100 2 50000 WSQC-Med

3 1000000 150 2 75000 WSQC-High

h. Pembuatan Larutan QC Sampel dalam plasma

Dipipet sejumlah WSQC-Low sampai WSQC-High sesuai dengan kolom 3 pada tabel dibawah ini, kemudian diencerkan menggunakan plasma dengan volume yang tertera pada kolom 4 untuk memperoleh konsentrasi akhir pada kolom 5 di Tabel 6.

Tabel 6 : Matrix Preparasi Sampel QC

21

No.

Pengenceran dengan Plasma

Nama Larutan QC Konsentrasi

Awal WSQC (ng/mL)

Volume WSQC

yang dipipet (µL)

Volume Plasma (µL)

Konsentrasi QC (ng/mL)

(1) (2) (3) (4) (5) (6)

1 1500 20 180 150.00 QC Low

2 50000 20 180 5000.00 QC Med

3 75000 20 180 7500.00 QC High

i. Pembuatan Larutan Stok Celecoxib 1000000 ng/mL dalam Metanol

Ditimbang sejumlah Baku Pembanding Celecoxib 5.00 mg yang telah diperhitungkan terhadap kadarnya dalam Sertifikat Analisa, kemudian ultra sonic dalam 3 mL Metanol hingga larut sempurna, kemudian ditambahkan dengan Metanol yang sampai tanda batas, hingga diperoleh kadar 1000000 ng/mL pada labu ukur 5 mL (LSIS). Penimbangan zat aktif pada saat bioanalisis direkam pada Form - Lembar Kerja Penimbangan (No. Dokumen: Form-7.2-1-7)pembuatan IS Celecoxib 100000 ng/mL dalam Metanol.

Diencerkan LSIS dengan cara dipipet 2500 µL LSIS, kemudian dipindahkan pada labu takar 25 mL, selanjutnya ditambahkan methanol (IS) sampai tanda batas.

1.3. Preparasi Sistem Suitabiliti (SST)

Pipet 450 µL acetonitril, tambahkan 50 µL IS Celecoxib 100000 ng/mL kemudian tambahkan 50 µL larutan Asam Salisilat konsentrasi Medium QC. Vortex selama 30 detik, pindahkan kedalam vial. Larutan SST siap diinjeksikan. (% CV area ≤ 6.00%

dan CV waktu retensi ≤ 2.00%)

1.4. Preparasi Kurva Kalibrasi dan QC Sampel

Larutan Kurva Kalibrasi yang telah dibuat sesuai dengan Tabel 3 dan QC Sampel yang telah dibuat sesuai dengan Tabel 6 ditambahkan 20 µL IS Celecoxib 100000 ng/mL. Kemudian dihomogenkan menggunakan Vortex selama 30 detik, selanjutnya ditambahkan 800 µL 0.10% asam format didalam asetonitril, Vortex selama 5 menit, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 14000 rpm selama 10 menit pada suhu 5oC.

Pindahkan supernatan ke mikrotube lainnya. Kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 14000 rpm selama 5 menit pada suhu 5oC. Substrat dipindahkan kedalam vial autosampler ,substrat siap untuk diukur kadar Asam Salisilat dalam plasma.

1.5. Preparasi Sampel

22

Preparasi sampel mengikuti prosedur yang sama dengan preparasi standar yaitu 200 µL sampel plasma ditambahkan 20 µL IS Celecoxib 100000 ng/mL. Kemudian dihomogenkan menggunakan Vortex selama 30 detik, selanjutnya ditambahkan 800 µL 0.10% asam format didalam asetonitril, Vortex selama 5 menit, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 14000 rpm selama 10 menit pada suhu 5oC. Pindahkan supernatan ke mikrotube lainnya. Kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 14000 rpm selama 5 menit pada suhu 5oC. Substrat dipindahkan kedalam vial autosampler ,substrat siap untuk diukur kadar Asam Salisilat dalam plasma

23

BAB IV

HASIL PENGUJIAN DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil Pengujian

4.1.1 Organoleptik

Sampel yang digunakan adalah cairan plasma yang di dapatkan dari Palang Merah Indonesia (PMI) yang diproduksi pada dengan golongan darah.

Tabel 12 Data Organoleptik Plasma

Pemerian Hasil Pengamatan

Bentuk Cair

Warna Kuning

Bau -

Rasa -

4.1.2 Data Verifikasi

a. Data Kurva Kalibrasi

Pada pengujian ini, kurva kalibrasi dibuat sebanyak 8 titik kurva dengan konsentrasi 50 ng/mL; 100 ng/mL; 1000 ng/mL; 2000 ng/mL; 4000 ng/mL; 6000 ng/mL; 8000 ng/mL; 10000 ng/mL. Tabel 13 Data

Pengukuran Kurva Kalibrasi

34

Calibration Curve

Cons. (ng/mL)

Std Cons. (ng/mL)

% Dev Curve

50 52,68 5,4

100 90,05 -9,9

1000 892,62 -10,7

2000 2048,95 2,4

4000 4167,10 4,2

6000 5857,34 -2,4

8000 8140,51 1,8

10000 10932,08 9,3

r² 0,9939

b. Data Akurasi dan Presisi

Tabel 14 Data Pengukuran Akurasi dan Presisi

Statistical Variable

Standard Concentration (ng/mL)

LLOQ QC LOW QC MED QC High

49,90 149,70 4990,02 7485,03

Measured Data

47,84 146,25 4739,63 7128,78

56,67 159,36 5517,97 7043,28

36,07 133,16 5236,77 7618,48

43,45 151,56 5243,81 7746,00

47,14 131,50 4966,00 7523,29

Within day Mean

46,234 144,366 5140,836 7411,966 Within day (%CV)

6,56 2,03 5,72 3,39

Within day (%Dev)

7,34 3,56 3,02 0,97

4.2 Perhitungan 4.2.1 Penimbangan

a. Penimbangan Asam Salisilat

BP =Kemurnian baku^100% x Bobot Prosedur CRV BP = _99,42%^100% x 5 mg

= 5,03 mg

b. Penimbangan Celecoxib

35

BP = 𝐵𝑒𝑟𝑎� 𝑀𝑜𝑙𝑒𝑘𝑢𝑙 𝐵𝑖𝑠𝑜𝑝𝑟𝑜𝑙𝑜𝑙 𝐹𝑢𝑟𝑚𝑎𝑟𝑎�𝑒

𝐵𝑒𝑟𝑎� 𝑀𝑜𝑙𝑒𝑘𝑢𝑙 𝐵𝑖𝑠𝑜𝑝𝑟𝑜𝑙𝑜𝑙 ×2 × 𝐵𝑜𝑏𝑜 𝑃𝑟𝑜𝑠𝑒𝑑𝑢𝑟

𝐾𝑒𝑚𝑢𝑟𝑛𝑖𝑎𝑛 𝐵𝑎𝑘𝑢 × 100%

BP = 325,4 𝑚� ×2^{766,96 𝑚�}

= 5,88 mg

× _{100,19 %}^{5 𝑚�} × 100%

4.2.2 Persamaan Regresi Liniear XAre

a PNZ Area

is

Xi (Cons

) Yi (Res pons e)

Wi (1/X

^2) Xi*

Wi Xi- XW, mean

Yi*

Wi Yi- YW, mea n

Swx y

Swx

x CSS

Yi pred

= axi+

b Yi-

Yi pred

ic RSS 173,76

00000 000

14480, 18000 00000

50,000 00000 00

0,01 1999 8508

0,00 0400 0000

0,02 0000 0000

50,000 00000 00

0,00 0004 7999

0,01 1999 8508

0,00 0239 9970

1,00 0000 0000

0,00 0000 0576

0,01 1350 3712

0,00 0649 4796

0,00 0000 0002 235,90

00000 000

14993, 41000 00000

100,00 00000 000

0,01 5733 5790

0,00 0100 0000

0,01 0000 0000

100,00 00000 000

0,00 0001 5734

0,01 5733 5790

0,00 0157 3358

1,00 0000 0000

0,00 0000 0248

0,01 7698 3783

- 0,00 1964 7994

0,00 0000 0004 1245,6

10000 0000

12988, 48000 00000

1000,0 00000 0000

0,09 5901 1370

0,00 0001 0000

0,00 1000 0000

1000,0 00000 0000

0,00 0000 0959

0,09 5901 1370

0,00 0095 9011

1,00 0000 0000

0,00 0000 0092

0,13 1962 5064

- 0,03 6061 3694

0,00 0000 0013 3255,0

00000 0000

15396, 89000 00000

2000,0 00000 0000

0,21 1406 3295

0,00 0000 2500

0,00 0500 0000

2000,0 00000 0000

0,00 0000 0529

0,21 1406 3295

0,00 0105 7032

1,00 0000 0000

0,00 0000 0112

0,25 8922 6487

- 0,04 7516 3192

0,00 0000 0006 8439,6

60000 0000

19952, 50000 00000

4000,0 00000 0000

0,42 2987 5955

0,00 0000 0625

0,00 0250 0000

4000,0 00000 0000

0,00 0000 0264

0,42 2987 5955

0,00 0105 7469

1,00 0000 0000

0,00 0000 0112

0,51 2842 9332

- 0,08 9855 3377

0,00 0000 0005 10330,

78000 00000

17455, 82000 00000

6000,0 00000 0000

0,59 1824 3887

0,00 0000 0278

0,00 0166 6667

6000,0 00000 0000

0,00 0000 0164

0,59 1824 3887

0,00 0098 6374

1,00 0000 0000

0,00 0000 0097

0,76 6763 2178

- 0,17 4938 8291

0,00 0000 0009 9914,8

70000 0000

12092, 94000 00000

8000,0 00000 0000

0,81 9889 1254

0,00 0000 0156

0,00 0125 0000

8000,0 00000 0000

0,00 0000 0128

0,81 9889 1254

0,00 0102 4861

1,00 0000 0000

0,00 0000 0105

1,02 0683 5024

- 0,20 0794 3770

0,00 0000 0006 17373,

63000 00000

15812, 38000 00000

10000, 00000 00000

1,09 8735 9272

0,00 0000 0100

0,00 0100 0000

10000, 00000 00000

0,00 0000 0110

1,09 8735 9272

0,00 0109 8736

1,00 0000 0000

0,00 0000 0121

1,27 4603 7869

- 0,17 5867 8598

0,00 0000 0003

Sum

0,00 0501 3659

0,03 2141 6667

0,00 0006 5887

3,26 8477 9330

0,00 1015 6811

8,00 0000 0000

0,00 0000 1462

0,00 0000 0047

Mean

64,1 0820 2190 4

0,01 3141 5506

l 15 Perhitungan Persamaan Garis Linear dan Koefisien Korelasi 4.2.2.1 Nilai Slope (b)

b=

∑

^xy−[

∑

^x−

∑

^y

n ]

∑

^x2−[

∑

^x2

n ] b=

23314,2−[31150−3,296

8 ]

221012500−[(31150)²

8 ]

b=0,00 01061 4.2.2.2 Nilai Intersep (a)

36

a= ´y−(b .´x)

a = 0,408625 – ( 0,0001061 . 3893,75) a = 0,0047

4.2.2.3 Nilai Koefisien Korelasi (r)

37

r = 𝑛 (∑ 𝑥𝑦)−(∑ 𝑥)(∑ 𝑦)

√𝑛 .∑ 𝑥² −( ∑ 𝑥)² .√𝑛 .∑ 𝑦² −( ∑ 𝑦)²

r =

8 (23314,2)−(31150)(3,296)

√8 . 221012500−(31150)2.√8 . 2,463731−(3,296)2

r =

186513,6 – 102670,4

√1768100000−970322500 .√19,709848−10,863616

r =

√797777500 .√8.846232^83843,2

= 0,9980

4.2.3 Akurasi (% Deviasi) Kurva Kalibrasi

% Dev KK 1 = (52,68−50)

50 x100 %=5,4 %

% Dev KK 2 ¿(90,05−100)

100 x100 %=−9,9 %

% Dev KK 3 ¿(892,62−1000)

1000 x100 %=−10,7 %

% Dev KK 4 ¿(2048,95−2000)

2000 x100 %=2,4 %

% Dev KK 5 ¿(4167,10−4000)

4000 x100 %=4,2 %

% Dev KK 6 ¿(5857,34−6000)

6000 x100 %=−2,4 %

% Dev KK 7 ¿(8140−8000)

8000 x100 %=1,8 %

% Dev KK 8 = (10932,08−10000)

10000 x100 %=9,3 % Low Limit of Quantification (LLOQ)

% Dev LLOQ ¿(46,234−49,90)

49,90 x100 %=−7,34 % Quality Control Low

% Dev QCL ¿(144,366−149,70)

149,70 x100 %=−3,56 % Quality Control Medium

% Dev QCM ¿(5140,836−4990,02)

4990,02 x100 %=3,01 % Quality Control High

% Dev QCH ¿(7411,966−7485,03)

7485,03 x100 %=−0,97 % 4.2.4 Presisi

Simpangan Baku (SD) SD =√ ^{∑ (𝑥−𝑥̅)²}_𝑛−1

38

Koefisien Variasi (%CV)

% CV = ^𝑆�

% 𝑟𝑎�𝑎−𝑟𝑎�𝑎 𝑥 100%

39

Low Limit of Quantification (LLOQ)

Tabel 16 Data Presisi LLOQ

Perlakukan Konsentari (ng/mL) |� − �̅| |� − �̅|²

1 0,012 0,0008 0,00000064

2 0,012 0,0008 0,00000064

3 0,010 0,0012 0,00000144

4 0,011 0,0002 0,00000004

5 0,011 0,0002 0,00000004

� 0,056 0,0032 0,00000216

𝑥̅ 0,0112 0,00064 0,000000432

SD=

√

^{0,000002164 %CV=0,00073480,0112 x100 %}

¿

√

0,00000054 ¿6,56 % = 0,0007348

Quality Control Low (QCL)

Tabel 17 Data Presisi QCL

Perlakukan Konsentari (ng/mL) |� − �̅| |� − �̅|²

1 0,021 0,0002 0,00000004

2 0,023 0,00018 0,0000000324

3 0,020 0,00012 0,0000000144

4 0,022 0,0008 0,00000064

5 0,020 0,00012 0,0000000144

� 0,106 0,00142 0,0000007412

𝑥̅ 0,0212 0,000284 0,00000014824

SD=

√

0,0000007412

4 %CV=0,000430464

0,0212 x100 %

¿

√

0,0000001853 ¿2,03 % = 0,000430464

Quality Control Medium (QCM)

Tabel 18 Data Presisi QCM

Perlakukan Konsentari (ng/mL) |� − �̅| |� − �̅|²

40

1 0,480 0,0404 0,00163216

2 0,558 0,0376 0,00141376

3 0,530 0,0096 0,00009216

4 0,531 0,0106 0,00011236

5 0,503 0,0174 0,00030276

� 2,602 0,1156 0,0035532

𝑥̅ 0,5204 0,02312 0,00071064

SD=

√

^{0,00355324 %CV=}0,029804362

05204 x100 %

¿

√

^0,0008883 ¿5,72 % = 0,029804362

Quality Control High (QCH)

Tabel 19 Data Presisi QCH

Perlakukan Konsentari (ng/mL) |� − �̅| |� − �̅|²

1 0,719 0,028 0,000784

2 0,710 0,037 0,0001369

3 0,768 0,021 0,000441

4 0,780 0,033 0,001089

5 0,758 0,011 0,000121

Σ 3,735 0,13 0,0025719

x̅ 0,747 0,026 0,00051438

SD=

√

^{0,00257194 %CV=}0,025356951

0,747 x100 %

¿

√

0,000642975 ¿3,39 % = 0,025356951

4.2.5 Persyaratan dan Hasil

Tabel 20 Persyaratan dan Hasil Penelitian

No. Parameter Kriteria Hasil

Kurva Kalibrasi

r² ≥ 0.9900 r² 0,9967

% Dev LLOQ ≤ 20% % Dev LLOQ : 1,33%

41

No. Parameter Kriteria Hasil

1. % Dev non-LLOQ ≤ 15% % Dev non-LLOQ : -0,5% - 8,6 %

2. Akurasi

% Dev LLOQ ≤ 20% LLOQ : -12%

QCL : -1,3%

% Dev non-LLOQ ≤ 15% QCM = 4,56 QCH = 7,20

3. Presisi

% CV LLOQ ≤ 20% LLOQ = 2,98 QCL = 5,55

% CV non-LLOQ ≤ 15% QCM = 3,37 QCH = 3,56

Kesimpulan VERIFIKASI MEMENUHI SYARAT

42

5.1 Simpulan

BAB V SIMPULAN DAN SARAN

DAFTAR PUSTAKA

1. Danniswara FG, Restadianmawti. Hipertensi Terhadap Laju Aliran Saliva Dan Pembesaran Gingiva. Media Med Muda. 2015;4(4):713–22.

44

L A M

P I R A N

45

46