プロダクト イノベーション
大腸菌を用いた遺伝子組換えタンパク質分泌発現技術
汎用的な組換えタンパク質高発現技術の開発と事業化に向けた化学メーカーの挑戦 三洋化成工業株式会社
柳原芳充，進藤康裕
三洋化成工業は，シャンプー・洗剤などで用いられる 界面活性剤，紙おむつなどで用いられる吸水性高分子，
自動車シート用原料，複写機・プリンターに使うトナー バインダーなどの機能性化学品（パフォーマンスケミカ ルス）事業を国内外で展開している化学品メーカーであ る（1）．このような化学メーカーがタンパク質発現技術を 開発していると聞くと意外に思われる方もいるかもしれ ない．しかし，当社では独自技術を応用することによる ユニークな技術開発（ニーシーズ指向）を推進してお り，本稿で紹介する高発現・高汎用性を特長とする大腸 菌によるタンパク質分泌発現技術の開発にあたっても，
当社の基盤技術の一つである界面活性剤技術の応用が必 要不可欠であった．
ところで，なぜ今さらタンパク質発現技術の開発を 行っているのか，との疑問をもたれる方もいるであろ う．近年，バイオ医薬品やバイオリファイナリーの台頭 でタンパク質の産業利用に関するニーズは年々高まって いる．酵素をはじめとするタンパク質の産業利用拡大に は，少なくとも2つの技術開発が必要である．
①目的に適した酵素などの探索・改変
②タンパク質の大量生産技術
酵素の探索・改変については，各種生物のゲノム解析，
メタゲノム解析が進み，指数関数的な勢いでの遺伝情報 蓄積と，それを解析するバイオインフォマティクス技術 の進展が著しい．一方，これらの技術的進展に比べれ ば，タンパク質の大量生産技術は，十分に進展しておら ず，汎用性が高いタンパク質高発現系の確立を行えば，
タンパク質産業を通じて社会に貢献できるのではないか と考えている．
本稿で紹介するタンパク質発現技術は，特殊な界面活 性剤を大腸菌培養液に添加することによって分泌発現を 行う方法である．このわれわれが見いだした方法は，過 去にほとんど検討されていない新しいアプローチである
が，非常に有用な方法であると考えているので，開発の 経緯と，その展望について概説したい．
タンパク質発現系の現状
近年，種々の生物種を用いた組換えタンパク質発現系 の開発が進められている．医薬品の生産では培養細胞・
大腸菌・酵母など，食品用酵素の生産では麹菌など，産 業用酵素の生産では大腸菌・麹菌・ 属菌（枯草 菌など）などが主に用いられている．
そのなかで，大腸菌を用いた発現系研究の歴史は古く 1970年代初頭にまで遡り，今日では種々の関連技術開 発が進んでいる（2）．タンパク質の糖鎖修飾ができない，
食品用途では用いられない，分泌型の微生物（
属菌など）を用いた系より発現量が劣るといった課題が 存在するものの，その汎用性から，糖鎖修飾が必要など の特別な理由が存在しなければ，まずはじめに検討され る発現系の一つである．
また大腸菌は代表的なモデル生物の一つとして，代謝 工学やシステムズバイオロジーなどの研究も進められて おり，今後ますます発展することが期待できる．
大腸菌を用いた分泌発現系
大腸菌は菌体内に組換えタンパク質を発現するが，一 般的には菌体内発現は分泌発現に比べて発現量が低い
（本稿において分泌発現とは菌体外（培地中）への発現 を指しており，ペリプラズム（後ほど詳しく述べる）へ の発現とは区別して用いている）．菌体内に組換えタン パク質を発現した場合，菌体内のタンパク質濃度を感知 して発現量を抑制する機構が働く，ほかの生存に必要な タンパク質と相互作用して生存に悪影響を及ぼすなどの 理由より，発現抑制がかかっていると考えられる．一
方，分泌型の生物を用いると，高発現させたときでも菌 体内のタンパク質濃度は増加しないため，発現量抑制機 構が働かず，タンパク質生産量を増加できることが期待 できる．
また，分泌発現のさらなる利点として，精製の容易さ が挙げられる．菌体内発現の場合，集菌後に菌体を破砕 して組換えタンパク質を抽出する必要があるが，分泌発 現では菌体を取り除くだけで組換えタンパク質を含む溶 液を得ることができる．そのほかにも，菌体内のプロテ アーゼによる分解の影響が少ない，菌体にとって悪影響 をもたらすタンパク質でも発現することが可能，などと いった利点も存在する．
筆者らは，このように利点が多い分泌発現系を，汎用 性の高い大腸菌を用いて構築することに挑戦した．
今まで大腸菌で分泌発現を実現できていなかった理由 として，菌の膜構造により分泌が妨げられることが挙げ られる．大腸菌などのグラム陰性菌は内膜（細胞質膜）
に加えて，その外側に外膜と呼ばれる脂質二重膜を有す る構造である．一方，分泌発現可能な 属菌な どのグラム陽性菌には，内膜の外側に外膜が存在しな い．グラム陰性菌にもグラム陽性菌にも，タンパク質を 内膜の外側に移行させるための機構は存在する．しか し，グラム陰性菌の外膜には，（汎用的に用いることが できる）タンパク質移行機構が存在しない．この構造の 違いにより，一般的には 属菌などのグラム陽 性菌は分泌発現が可能であるが，大腸菌などのグラム陰 性菌は内膜と外膜の間（ペリプラズム）までの発現でと どまり，培地中への分泌発現はできない．
大腸菌を用いた分泌発現の研究として，いくつかのア プローチ（①外膜に発現するタンパク質に目的のタンパ ク質を融合させる方法，②細胞壁形成に異常をきたして いるL-form株と呼ばれる遺伝子欠損大腸菌を用いる方 法など）が存在する（3）．しかし，これらの方法では，膜 タンパク質が発現困難，L-form株は細胞壁をもたない ため高密度培養が困難などの技術的なハードルが存在し ている．
筆者らはこれら遺伝学的なアプローチではない方法，
すなわち界面活性剤を用いて大腸菌の外膜透過性を向上 させることで，ペリプラズムに発現させた組換えタンパ ク質を培地中に分泌発現させる方法を着想した．この方 法であれば，界面活性剤存在下でもタンパク質発現し続 ける培養条件を見いだしさえすれば，持続的に培地中に タンパク質を分泌発現し続けることができるであろうこ とが予想される．
界面活性剤について
筆者らの発現技術のキーは界面活性剤であることを述 べたが，界面活性剤とは，同一分子内に親水部と疎水部 を有する化合物である．その構造は脂質と類似してお り，細胞膜を形成する脂質二重膜に作用することや，脂 質の代わりとして働くことはよく知られている．本稿の 読者の方は，分子生物学の実験において，ゲノムDNA を調製するために細胞膜を溶解させる目的でCTAB
（臭化セチルトリメチルアンモニウム）などを用いてお られるかもしれない．あるいは，細胞内から組換えタン パク質を精製する際に Briji 35 などの界面活性剤を用 い，細胞膜を溶解させて抽出した経験がある方もいるか もしれない．また，塩化ベンザルコニウムなどの抗菌剤 は細胞膜や膜タンパク質などに作用することで効果を発 揮 す る と 考 え ら れ て い る し，Zwitterngen 3‒14や Tween 80などの界面活性剤は脂質の代わりとして働く と考えられており，膜タンパク質の精製に用いられたり もする．
一方，界面活性剤の疎水基の炭素数・親水基の種類・
分子量などが変われば作用の仕方も異なってくる．生体 に対する作用が弱い界面活性剤は人が直接触れる用途で 使用されることがある．ポリオキシアルキレンアルキル エーテルやソルビタン脂肪酸エステルなどの化粧品用乳 化剤，アミンオキサイド型やアミドベタイン型の台所用 洗剤やシャンプー用基材，グリセリン脂肪酸エステルや ステアリル乳酸カルシウムなどは食品用添加剤に利用さ れている（4）．
筆者らは，目的に則した界面活性剤を見いだすところ から開発に着手した．
界面活性剤の探索
見いだすべき界面活性剤の要件として，外膜の透過性 を向上させるが，菌の生存への悪影響が弱いことが求め られる．スクリーニングを行うにあたって，表1に記載 しているように2種類の大腸菌（①ペリプラズムに組換 えタンパク質（MalE；マルトース結合タンパク質）を 発現している大腸菌，②細胞質内に組換えタンパク質
（PdxA；4-ヒドロキシトレオニン-4-リン酸デヒドロゲ ナーゼ）を発現している大腸菌）を用意した．用意した それぞれの菌液中に界面活性剤を添加し，溶出する組換 えタンパク質量を定量した．ペリプラズムに発現してい る組換えタンパク質が液中で多量に検出できれば，外膜 の透過性が向上していることが予測される（表1①参照）．
さらに，大腸菌が生存に適する界面活性剤は，細胞質内 に発現する組換えタンパク質を溶出させないと考えられ る（表1②参照）．なぜなら，細胞質内には生存に必須 のタンパク質が多量に存在するためである．スクリーニ ングに用いた界面活性剤については，外膜やペプチドグ リカンへの作用の強さや内膜への作用の弱さを念頭に置 きつつHLB，疎水基の炭素数，親水基の種類，分子量 などの観点で約100種類選んだ．
界面活性剤をそれぞれの大腸菌に作用させたときのタ ンパク質溶出割合をマッピングしたのが，図1である．
筆者らが望んでいる界面活性剤はグループⅠの外膜の透
過性が向上し，生存に悪影響を与えない界面活性剤であ る．グループIIの界面活性剤は，細胞質内のタンパク質 もペリプラズムのタンパク質も溶出させるので溶菌型の 界面活性剤である．グループIIIはどちらのタンパク質 も溶出させないので膜透過性に影響しにくい界面活性剤 と解釈できる．
このスクリーニングでグループIに分類された界面活 性剤はカルボン酸型アニオン性界面活性剤や両性界面活 性剤であった．これらの界面活性剤のことを以降では分 泌型の界面活性剤を呼ぶ．
分泌発現
分泌型の界面活性剤を用いて培養を行った結果を図2 に示す．ペリプラズムへの移行シグナル配列を融合した セルラーゼ（ 由来）を発現する 大腸菌を用いて実験を行った．界面活性剤（分泌型の両 性界面活性剤）を添加したのちも濁度が上昇（菌体増 殖）し続け（▲），経時的に組換えタンパク質発現量が 増えていることを確認できる（●）．また，菌体内発現
（□）に比べて界面活性剤を添加した条件の上清（●）
のほうが，発現量が向上していることも確認できる．こ の例では，最終的に培養上清中に6.2 g/Lのセルラーゼ を発現しており，酵素活性も確認できている．
これ以外にも微生物（ポリリン酸キナーゼなど）から 植物（プロテアーゼ阻害剤，糖リン酸化酵素など）・ヒ ト由来（プロインスリン，上皮細胞成長因子など）ま で，またタンパク質からペプチドまでのさまざまな分子 量のタンパク質の高発現を確認できており当初の想定ど おり汎用的なプロセスであると考えている．また，培養 時に界面活性剤を入れているので，それにより酵素が失 活することを懸念される方もいるかもしれないが，筆者 らの検討の範囲ではこの点はあまり問題になっていな い．今まで約40種類のタンパク質発現の検討を行って おり，発現が低かったタンパク質数種類について分泌型 図1■分泌型界面活性剤スクリーニングの結果
2種類の大腸菌（①ペリプラズムに組換えタンパク質が局在した 大腸菌，②細胞質内に組換えタンパク質が局在した大腸菌）に界 面活性剤 （0.01, 0.1, 1%） を作用させたときのタンパク質溶出割合 をプロットした．縦軸が大腸菌①からの組換えタンパク質溶出割 合，横軸が大腸菌②からの組換えタンパク質溶出割合．グループ
Ⅰ；分泌型の界面活性剤（外膜の透過性のみ向上させ，内膜透過 性は向上しない．ポリオキシエチレンラウリルエーテル酢酸ナト リウムなどのカルボン酸型アニオン性界面活性剤や両性界面活性 剤など）．グループⅡ；溶菌型の界面活性剤（外膜だけでなく内膜 の透過性も向上させる．ドデシル硫酸ナトリウムなどの硫酸エス テル型アニオン性界面活性剤など）．グループIII；膜の透過性に 対する影響が少ない界面活性剤（Tween 80などの非イオン性界 面活性剤など）．
表1■分泌型界面活性剤スクリーニング法の概要 組換えタンパク質の局在 界面活性剤添加により
溶出するタンパク質量 解釈
大腸菌① ペリプラズム 多い 外膜透過性向上
⇒目的の界面活性剤の可能性あり 少ない 外膜透過性は向上していない 大腸菌② 細胞質 多い 菌の生存に対する悪影響が大きい
少ない 菌の生存に対する悪影響が小さい
⇒目的の界面活性剤の可能性あり
の界面活性剤による変性速度を測定した結果，3種類で 有意な変性を確認した程度である．
分泌型の界面活性剤添加によって外膜の透過性が向上 しているにもかかわらず，大腸菌が死なずに生きている のはなぜか．その理由を探るために，奈良先端科学技術 大学院大学の森 浩禎教授にご協力いただき，遺伝子欠 損株（5） を用いた検討を行った．その結果，リポ多糖合 成にかかわる遺伝子（ など）やATP合成にかかわ る遺伝子（ など），薬物の排出にかかわる遺伝子
（ など）を欠損した大腸菌は，分泌型の界面活性剤 に対して感受性を示すことが明らかになった．この結果 から細胞内に入った界面活性剤を細胞外に排出すること と，界面活性剤によってダメージを受けた外膜を修復す ることが生存にとって必要であると推測している．
界面活性剤を用いた大腸菌による分泌発現技術の特長 筆者らが開発している発現系の特長を，以下にまとめ た．
＜特長①；発現量が多い＞
これまでに発現検討した組換えタンパク質（約40種 類）のうち8割程度は，1 〜 3回程度の検討だけで培養 液中に数〜約20 g/Lの濃度で蓄積されることを確認し ている．通常，宿主・プラスミド・遺伝子配列最適化・
培養条件などさまざまな検討を行って高発現を達成する ことを考えると，本稿で紹介した分泌発現技術は簡単に 高発現を実現できる発現系であると言える．また，さら に条件最適化を行うことで，より一層発現量を向上でき
る余地が十分ある．なお，通常の菌体内発現法では，論 文などで確認するかぎり多くの場合，培養液中での発現 濃度は1ケタ以上少なく，数百mg/L以下である．
＜特長②；精製が容易＞
菌体内発現法では，菌体破砕により放出される菌体構 成タンパク質が混入する．また，分泌型微生物を用いた 場合でも，一般にはもともと微生物が有している分泌性 のタンパク質が大量に混入するので，多くの夾雑タンパ ク質を精製除去する必要がある．それに対して，本稿の 分泌発現技術は非分泌性の大腸菌を用いているので，夾 雑タンパク質としてはペリプラズムに発現している比較 的少量のタンパク質であり，精製が容易である．いくつ かのケースでは，菌体除去のための遠心分離とバッ ファー交換のための膜精製のみで95%以上の純度の組 換えタンパク質溶液を得ることに成功している．
＜特長③；応用範囲が広い＞
遺伝子工学技術が進んでいる大腸菌を用いることによ り，幅広い応用が期待できる．たとえば，目的に応じて オリジンやプロモーターなどが異なるさまざまなベク ターを使い分けることや，プロテアーゼ分解されやすい タンパク質の発現にはプロテアーゼ欠損株の使用など目 的に応じた宿主の選択が可能である．
また，分泌型微生物は外部に存在するタンパク質など の養分を積極的に分解して利用するため分泌されるプロ テアーゼ活性が高く，組換えタンパク質の分泌発現には 足かせとなる（6）．これに対して，大腸菌は非分泌型の微 生物なので培地中に分泌されるプロテアーゼ活性が低 い．さらに，大腸菌はタンパク質をペリプラズムに移行 させる機構を複数有しており，たとえば細胞内で立体構 造を形成したタンパク質をペリプラズムまで分泌できる TAT 経 路 （Twin-arginine translocation pathway） を 用いることができるので，将来的には細胞内で補因子を 結合した酵素の分泌発現なども可能になると考えられ る．
今後の展望
本稿で紹介した発現技術は，まだ開発途上であり，培 養条件や用いる株が十分最適化できているとは言いがた い．高汎用性については，確認できつつあり，今後さら なる高発現の実現に向けて，開発を進める予定である．
ビジネスへの展開としては，お客様がせっかく開発し たにもかかわらず高発現できず商品化に行き詰っている タンパク質を，当社の分泌発現技術を用いることで産業 化するためのお手伝いをすることなどを考えている．そ 図2■ジャーファーメンターを用いた発現検討の結果
ジャーファーメンターを用いた培養を行い，培養槽内の菌体量
（▲）と組換えタンパク質量定量を行った．pH 6.8，培養温度30℃
に制御して流加培養法（35時間目の液量は110 mL，48時間目の 液量は125 mL）を行った．培養開始後，13時間目に分泌型の界面 活性剤添加を行った後も，菌体の増殖は続き，組換えタンパク質 の持続的な分泌発現が観察される．
れ以外にも，複合酵素変換系の開発も進めている．複合 酵素変換系とは複数の酵素を用いて多段階の酵素変換を 行う化合物合成プロセスのことである．現状では多段階 の酵素反応が必要なプロセスは，微生物を用いた発酵生 産法が主流である．しかし，発酵生産法にはいろいろな 制約（たとえば，微生物の生存に悪影響を及ぼす化合物 や微生物に分解されやすい化合物などは発酵生産できな い）がある．このような化合物の生産プロセスを醗酵法 から複合酵素変換系に切り換えることを考えている．複 合酵素系を構築するためには，酵素反応の反応特異性，
酵素の安定性などさまざまな要因を考えて酵素を選んで くる必要がある．複数の酵素を用いる複合酵素系でこれ らの要件を確認するためには，多種類の酵素を発現し，
精製し，活性測定などを行う必要がある．しかし，汎用 的な高発現技術を用いれば複数の酵素について短時間で 活性測定可能な量を発現することが可能になり，効率的 な開発ができる．このように大腸菌による分泌発現の技 術は，タンパク質高発現にとどまらず，複合酵素変換系 による化合物合成という新しい分野においても大いに貢 献しうる可能性を秘めた技術であり，本技術の開発を通 して，新分野の創出とバイオ産業の発展に寄与していき たい．
文献
1） 三洋化成工業ホームページ，http://www.sanyo-chemical.
co.jp/
2） K. Terpe : , 72, 211 （2006）.
3） J. F. Rippmann : , 64, 4862
（1998）.
4） 筧 哲男： 界面活性剤入門 ，三洋化成工業株式会社，
2007.
5） T. Baba : , 21, 1 （2006）.
6） W. Li, X. Zhou & P. Lu : , 155, 605 （2004）.
プロフィル
柳原 芳充（Fusamitsu YANAGIHARA）
＜略歴＞2007年奈良先端科学技術大学院 大学バイオサイエンス研究科博士後期課程 修了／2008年三洋化成工業（株）入社，現 在に至る＜研究テーマと抱負＞バイオ技術 は夢の技術と言われて久しいですが，産業 としては未熟です．この夢の技術をさらに 社会に役立つ技術にすることが目標であ り，本稿で紹介した技術もその一助にした いと考えています＜趣味＞ダイビング，史 跡めぐり，絵画鑑賞，読書
進藤 康裕（Yasuhiro SHINDO）
＜略歴＞1999年京都大学工学部工業化学 科卒業／2001年同大学大学院工学研究科 合成・生物化学専攻修了／同年三洋化成工 業（株）入社＜研究テーマと抱負＞新事業開 発＜趣味＞囲碁，バンド
