소포체 스트레스에서 ATF4 의존성 TFEB 핵 이동에 대한 조사. 리소좀의 경우 TFEB/3에 의해 조절되는 LAMP1, 2의 발현과 리소좀 단백질 분해효소인 카텝신의 발현이 감소되는 것을 확인하였다.
서 론
그러나 이러한 소포체 스트레스가 지속되면 동일한 센서 단백질을 통해 세포사멸 경로가 활성화되어 손상된 세포를 제거하게 된다[4,5]. 최근 연구에 따르면 소포체 스트레스는 자가포식을 활성화하여 단백질 응집체나 손상된 세포소기관을 제거하는 것으로 보고되었습니다[6,8,10].
실험재료 및 방법
샘플 준비
방 법
웨스턴 블롯(Western blot) 분석
역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)과 qPCR(quantitative PCR)(quantitative
Xbp mRNA splicing analysis (RT-PCR)
Immunofluorescence microscope analysis
24시간 동안 TFEB/TFE3-3xFlag로 감염시킨 후, 1μg/ml Tunicamycin(Tm)을 처리하여 소포체 스트레스를 유도했습니다. 필요한 커버 유리만 챔버로 옮긴 후 BSA(PBS)로 실온에서 1시간 동안 차단하고 Flag 1차 항체로 4°C에서 밤새 처리합니다. 그런 다음 PBS-T로 암실에서 5분간 2회 세척하고, 5xDAPI로 암실, 실온에서 10분간 염색한 후 다시 PBS-T로 5분간 세척하고 건조시킨 후 마운팅 용액을 적하하여 슬라이드를 제작하였다.
결과는 공초점 레이저 현미경으로 관찰하여 분석하였다.
결 과 [Part.1]
ER stress affects mouse survival
ER stress affects mouse survival. A) After intraperitoneal injection of Tm (1 mg/kg), the survival of mice was greatly reduced within 5 days.
Observation of the UPR in livers of Tunicamycin (Tm)-challenged mice
또한, 리소좀의 핵심 조절자인 TFEB의 발현도 감소했습니다. 본 실험에서는 조직 수준에서 자가포식과 소포체 스트레스의 관계를 확인하기 위해 소포체 스트레스의 강력한 유도제인 투니카마이신(Tm)을 1 mg/kg 복강 내 주사하였다. Tm 주입 후 마우스 생존율이 감소하여 5일째 급격히 감소하는 것을 확인하였다. 아데노바이러스 IF를 사용한 결과 ATF4 결핍 세포에서 TFEB와 TFE3의 핵 이동이 감소하는 것을 확인하였다.
ATF4가 없는 경우에는 시간에 따른 증가를 보였지만, 특히 늦은 시간에는 발현 수준이 WT에 비해 훨씬 낮았습니다. mRNA의 경우 ATF4 결핍에 의해 ATF4 의존적 유전자 발현 수준이 감소하는 것을 확인하였다. 리소좀의 경우, 후기에 LAMP의 발현 수준이 크게 감소하였고, Tm에 의한 Cathepsin L proform 축적의 발현 수준도 훨씬 낮았다. 마찬가지로 일부 리소좀 관련 유전자의 발현 수준도 크게 감소한 것으로 확인됐다.
ATF4 결핍 세포에서 TFEB와 TFE3의 변화를 확인하기 위해 강력한 ER 스트레스 유도제인 Tunicamycin (Tm)을 처리하고 면역형광법과 Western blot 핵분획법으로 핵 이동을 확인했습니다. 이는 mRNA 수준에서도 나타났으며, ATF4 의존 유전자의 발현은 감소하였지만, UPR 유전자 중 Bip의 후기 발현은 낮은 것으로 확인되었다. 단백질 수준의 β-actin에 대한 정규화 및 비교 결과, ATF4가 결핍된 세포의 경우 LC3B-II에서는 차이가 없었으나, 관여하는 Beclin1, ATG5-ATG12 conjugation 및 Cargo Receptor p62의 발현이 관찰되었다. 자가포식소체의 형성이 감소됩니다.
마찬가지로 리소좀의 경우 카고 수용체 LAMP1, LAMP2의 후기 감소와 프로테아제인 카텝신 L의 발현 감소가 확인됐다. ATF4 의존성 Beclin1, Atg12, p62 및 Nbr1은 감소했고 TFEB 의존성 Cathepsin과 Lamp2a, 2b 및 2c도 감소한 발현을 보였으며 이는 ATF4 결핍으로 인한 TFEB 핵 이동 감소가 자가포식 활동을 억제할 수 있음을 시사합니다.
Observation of expression of autophagy genes in livers of Tm-challenged
고 찰 [Part.1]
ER 스트레스와 자가포식으로 인해 많은 생쥐가 5일 후에 사망하는 이유에 접근하기 위해 며칠 동안 간 조직을 절제하고 UPR과 자가포식 단백질 및 mRNA의 변화를 웨스턴 블롯과 qPCR을 사용하여 확인했습니다. UPR의 경우 훨씬 이른 날인 1일차에 가장 큰 활동을 보였으며, 마우스 생존율이 급격히 감소한 5일차에는 이미 회복 단계에 있었습니다. 반면, 자가포식 과정은 5일 후에 큰 변화를 보였습니다.
자가포식소체 마커로 유명한 LC3B-II와 카고 수용체인 p62의 축적이 확인되었습니다. 리소좀 막 단백질 중 자가포식과 융합을 담당하는 Vamp8과 리소좀 화물 수용체인 LAMP가 감소했습니다. , 그리고 카고 분해 프로테아제인 카텝신(cathepsin)이 활성화되었으며, Tm에 의한 글리코실화 억제로 인한 형태 감소(단일 사슬, 이중 사슬)와 프로폼 축적이 확인되었다. 이러한 리소좀 손상은 리소좀 생물 발생의 핵심 조절자인 TFEB의 단백질 및 mRNA 발현이 크게 감소하여 발생하는 것으로 예상됩니다. 다른 자가포식 유전자의 발현도 감소하였기 때문에 TFEB의 자가전사가 제대로 이루어지지 않아 단백질 수준이 감소하여 리소좀에 영향을 미친 것으로 생각된다.
1) 자가포식 흐름이 정말 막혔는가?, 2) 시간이 지남에 따라 TFEB/3의 핵운동에 변화가 있는 것인가?, 3) 자가포식이 회복되면 감소했던 5일 후에 도달한 생존율을 회복하는 것이 가능한가?
결 과 [Part.2]
ATF4 deficiency decrease nuclear translocation of TFEB/3 during ER stress. 21
ATF4 결핍은 ER 스트레스 동안 TFEB/3 핵 전위를 감소시킵니다. A), (B) TFEB 또는 TFE3-3xFlag 발현 아데노바이러스, 감염된 ATF4 간세포를 Tm으로 16시간 동안 처리하였다. ATF4 유무에 따라 ER 스트레스에 대한 UPR 활성에 차이가 있는지 확인하기 위해 PERK, IRE1 경로 및 샤페론 단백질의 변화를 조사했습니다. Bip은 단백질과 동일한 모습을 보였으나, Xbp1s와 Grp94는 단백질과 다른 결과를 보였다.
ATF4 is required for proper expression of autophagy genes during ER stress
고 찰 [Part.2]
ER stress inhibits ER function in all eukaryotic cells, which is the cause of the cellular stress response, which is called the conservation of ER biological function in the evolutionary conservation to protect cells from the stress response, UPR (unfolded protein response). ). UPR is help like Autophagy protein degradation system, Proteasome to remove immature proteins during ER stress. However, if ER stress persists for a long time, the cell fate changes from survival to cell death via apoptosis.
This study aims to investigate the relationship between ER stress and survival in a broader range by identifying changes in autophagy induced by ER stress at the tissue level. In vivo experiments with normal mouse C57BL/6 were performed to induce ER stress at the tissue level. Tunicamycin (Tm), a potent chemical ER stress inducer, was injected to induce ER stress and observed for a long time.
However, only the propensity of autophagy to ER stress at the tissue level has been identified, and its relationship to survival has not yet been identified.
영문요약
