We demonstrate that PG suppresses adipocyte differentiation in human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (hAMSCs) by reduced accumulation of lipid droplets. Collectively, these results demonstrate unusual function of PG on adipocyte differentiation in hAMSCs, and PG inhibits adipocyte differentiation through ERK signaling pathway and decrease in PPAR-γ activity.
Introduction
Therefore, understanding adipocyte differentiation is not only important in biology, but also necessary for the treatment of metabolic diseases such as type II diabetes and obesity. One of the well-known signaling pathways in the regulation of adipocyte differentiation is the mitogen-activated protein kinases (MAPKs). Furthermore, in the case of ERK, ERK inhibition promotes adipocyte differentiation without adipocyte-inducing hormone and prevents osteogenic differentiation of hAMSCs11.
As a result of screening, we found that propyl gallate (3,4,5-propyl ester of trihydroxybenzoic acid, PG) has a novel function that inhibits adipocyte differentiation in AMSC. However, although the properties of PG have been well investigated, the functions of PG in stem cell differentiation remain unknown. PG inhibits the adipocyte differentiation program and lipid droplet formation in hAMSCs via activation of ERK and inhibition of PPAR-γ activity.
These results suggest a novel function of PG in stem cell differentiation and molecular mechanism of anti-adipogenic activity of PG.
Materials and Method
- Materials
- Cell culture
- Induction of adipocyte differentiation
- Oil red O staining
- Cell Viability Assay
- Real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-PCR)
- Western blot analysis
- Transfection and luciferase activity assay
- Statistical analysis
Absorbance of the oil red O-containing isopropanol was analyzed at 540 nm with SpectraMax® M5 Multi-Mode Microplate Reader (Molecular Devices). A final concentration of MTT stock solution in culture medium should be 0.5 mg/ml and then incubation of the plates at 37°C for 3h 30min is required. For real-time PCR, cDNA was amplified with the following primers by the Light Cycler 2.0 PCR system (Roche Diagnostics): C/EBP-α [5′-.
For transfection, 3 x plasmid PPRE-tk-LUC, which has 3 copies of the PPAR-γ response element, construct pSV-PPAR-γ2, and pRL-SV40, which expresses renilla luciferase, were prepared (Promega Corporation). To investigate the effect of PG on PPAR-γ activation, Human embryonic kidney 293 cells (HEK293, 5 × 104 cells/well) were prepared in 24-well plates. After transfection, cells were cultured with the following treatments of rosiglitazone, PPAR-γ ligand, and PG for an additional 36 h.
According to the manufacturer's instructions, the luciferase activity assay was measured with the Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega Corporation).
Results
- PG reduces lipid droplet formation
- The expression of adipogenic genes and proteins are decreased by PG
- PG inhibits PPAR- γ activity
- PG negatively regulate adipocyte differentiation via ERK activation
At the 14 days, GM grown cells were presented as 1 when measuring the mean value. During differentiation of adipocytes, the protein level of PPAR-γ, C/EBP-α, and aP2 was detected by Western blot at the indicated time point. For adipocyte differentiation, PPAR-γ is a significant transcriptional factor and some natural compounds are known to modulate adipocyte differentiation by regulating the activity of PPAR-γ.
According to these reports, we test whether PG reduces adipocyte differentiation by regulating PPAR-γ activity. The previous research showed that a number of compounds regulate adipocyte differentiation through modulation of MAPK activity23a, 31. Based on these studies, we show that PG reduces adipocyte differentiation by controlling the activity of MAPK.
To determine whether PG inhibits adipocyte differentiation through ERK signaling pathway, we used the specific inhibitor of mitogen-activated protein kinase kinase (MEK), PD98059. In the adipocyte differentiation state, co-treatment of PD98059 restored PG-mediated inhibition of lipid accumulation (Fig. 5B). The mean values of venicle treated cells were presented as 100 and others were as its relative values.
Discussion
The ERK pathway causes S112 phosphorylation of PPAR-γ and phosphorylation of PPAR-γ inhibits RXR/PPAR heterodimers activity on PPREs and can inhibit adipocyte differentiation. Therefore, we can assume that activated ERK cascade by PG contributes to the regulation of PPAR-γ genomic action through phosphorylation of PPAR-γ. A large number of researchers have focused on research and treatment of obesity through inhibition of adipocyte differentiation.
This report offers the possibility of obesity care through OG-stimulated-inhibition of adipocyte differentiation.
Conclusion
제가 대학원 공부를 시작한 것은 처음 BSN 연구실에서 인턴 생활을 하면서 연구에 대한 흥미와 호기심을 느끼고, 궁금증을 해결하기 위해 UNIST 대학원생으로 입학했을 때였습니다. 실험에 대해 많은 것을 배웠지만, 무엇보다 연구자가 갖춰야 할 태도와 사고방식 등 앞으로 나아가기 위한 밑거름이 될 수 있는 것들을 많이 배웠습니다. 그리고 제가 석사학위를 취득할 수 있도록 도와주신 최장현 교수님, 때로는 연구실 선배로, 때로는 교수로, 좋은 실험 결과를 만들어내는 것의 중요성과 해석 방법에 대해 연구하고 고민하는 것까지 가르쳐 주셨습니다. 실험 결과를 확인하고 다음 실험을 계획하고 있습니다. 박찬영 교수님에게도 감사의 말씀을 전하고 싶습니다.
실험에 대한 무지와 접근하기 어려운 선배들에 대한 막연한 두려움으로 실험실 생활의 시작은 어려웠지만, 함께 생활하면서 차츰차츰 다가와 주시는 선배님들과 선생님들 덕분에 많은 도움을 받아 성공적으로 해낼 수 있었습니다. 석사 학위를 마치고 이번 학위를 마칠 수 있었던 것 같아요. 석사과정 시작부터 연구실에 입학할 때까지 끝까지 지도해주신 김정민 사부님, 늘 친절하게 답변해주시고 모든 일을 도와주신 장현준 선배님, 그리고 많은 도움을 주신 김응균 사부님 선배로서 많은 것을 가르쳤고, 포항에서 울산까지 동물 실험도 했습니다. 일하면서 동물실험에 대해 많은 것을 가르쳐주신 양용렬 선배님, 가끔 이상한 농담으로 저를 놀라게 해주신 문효열 선배님, 무뚝뚝해 보이지만 이해심 많고 사려 깊으신 이유진 선배님 , 많은 실험을 동시에 깔끔하게 수행해내며 부러워했던 김정국 선배님과 우리 연구실. 막내로 들어오세요. 저희 연구실에는 무엇이든 믿고 물어봐도 되는 든든한 김영미 선생님, 현재 포항에 계시지만 멋진 라이프스타일을 보여주시는 이혜린 선생님, 그리고 말랐지만 밝은 얼굴과 에너지 넘치는 모습으로 일하는 오지현. 마지막으로 여기에 온 지 얼마나 됐나요? 비록 성공하지는 못했지만, 함께 공부하기 위해 최선을 다해주신 남다름 선생님께 감사드리고, 함께 먹은 점심이 너무 좋았다고 말씀드리고 싶습니다.
공부하는 동안 연구실 식구들뿐만 아니라 교수님, 연구자 분들도 많은 도움을 주셨습니다. 저의 고민을 들어주시고 조언을 해주신 박수아 교수님, 지금은 동물회의 회원이시지만 우리 연구실 소장으로 열심히 일해주신 김일신 교수님, 그리고 목축업에 많은 관심과 도움을 주시고 현미경도 사용해주셔서 가르쳐주신 박경수 교수님. 필요할 때마다 찾아와서 도와주신 허진회 교수님, 커피를 내려주시고 경청해주신 황수현 교수님 감사합니다. 내 고민에 대한 조언을 구합니다. 그리고 제 연구의 출발점을 결정하는데 많은 도움을 주신 최웅규 교수님, 인턴 시절 지도를 해주신 서정곤 선생님과, 한때 연구실을 공유해 마치 같은 연구실 구성원처럼 지내셨던 권혁무 교수님. 또한 감사의 말씀을 전하고 싶습니다.
