해양바이러스 병원체 진단키트 실용화 기술 개발

LAMP 기반 해양바이러스 진단키트 시제품 생산 한글 해양병원체, 해양바이러스, 진단키트.

그림 1. 핵산 기반 해양병원체 진단기술]

개발기술의 국내외 기술동향

기술의 특징

또한 PCR에 비해 진단 효율이 약 1000배 증가한 것으로 보고되었으며, SYBR 녹색형광염색으로 실시간으로 확인할 수 있는 장점이 있어 현장 적용 면에서도 우수하다. 그 결과, 재조합 단백질 scFv를 이용하여 검증할 때 항체 등의 칩을 이용하여 신속하게 병원성 해양 바이러스를 검출할 수 있고, 특이성도 높아져 지금까지의 검출 방식을 시스템으로 구축할 수 있게 되었다.

그림 4. NNV, MABV, VHSV, RSIV LAMP 검출방법]

연구개발의 필요성

LAMP 기반 해양바이러스 병원체 진단키트 시제품 제작 LAMP 기반 해양바이러스 병원체 진단키트 상용화 및 기술이전 LAMP 기반 해양바이러스 병원체 4종 상용화 기술 개발 및 기술이전

상세한 프로토콜 준비 및 공인 인증이 포함된 진단 키트. 시제품 진단키트 성능평가 현장 적용 샘플 검증. 진단키트의 비특이적 반응 제거 형광시약 교환 검출조건 확립

Corporate Performance 소비 기업에 기술을 이전했을 때 달성할 수 있는 성과(매출 등).

세부목표

해양 바이러스 유전자 프라이머의 합성. LAMP 실시간 PCR 진단키트 시제품 4종 제작 양식어류를 이용한 실시간 LAMP PCR 진단키트 테스트.

지난 8월 양식어류 진단 결과 해양병원성 바이러스 3종 중 MABV가 가장 많이 검출됐으며 RSIV, VNNV 순이었다. 10월 양식어류 진단 결과 해양병원성 바이러스 3종 중 MABV가 가장 많았고, VNNV, RSIV 순이었다. 섹션 2 scFv 기반 해양 바이러스 진단 키트 프로토타이핑.

선별된 파지 디스플레이 scFv를 이용한 진단키트 시제품 제작 바이러스 특이적 파지 디스플레이 scFv 키트를 이용한 바이러스 진단. RSIV 진단 결과 등 근육 조직에서 바이러스가 가장 많이 검출되었고 장 조직에서 바이러스가 가장 적게 검출되었다.

진단키트를 활용한 해양병원체 종합정보 관리 해양 바이러스 탐지 키트의 프로토타입 프로토콜.

표 1. LAMP PCR 프라이머 염기서열

바이러스 cDNA 합성과정 간소화

검출에 사용되는 형광시약

지난 8월 RSIV 진단 결과 개체는 다르지만 아가미와 등근육은 같은 감염률을 보였고 장에서는 검출되지 않았다. 살아있는 개체에서는 감염이 발견되지 않았지만 죽은 개체에서는 RSIV가 검출되었습니다. 10월 RSIV 진단으로 아가미와 장에 감염률이 높았고 등 근육도 감염되었으나 상대적으로 감염률이 낮았다. 현장 샘플을 이용한 반복 실험을 통해 RSIV와 MABV의 실시간 LAMP PCR 현장 적용 가능성을 확인했습니다.

생산된 Phage scFv screen kit의 현장 적용 가능성을 확인하기 위해 바이러스 감염이 의심되는 양식 어류 시료를 대상으로 바이러스 진단 실험을 ​​수행하였다. 현장 검체를 이용하여 Phage screen scFv kit의 현장 적용성을 확인한 결과, RSIV 진단키트를 사용하여 실제 의심 검체에서 감염 여부를 확인하는데 문제가 없을 것으로 판단되었다. NNV의 경우 현재 검체에서 신경조직 이외의 조직 감염 가능성이 낮고 전체적인 감염률이 낮은 것으로 알려져 있어 다른 진단 및 방법을 통해 다른 감염 검체를 확보할 필요가 있어 보인다. 추가 실험을 수행합니다.

이번 연구과제에서 제작된 진단키트 시제품은 SYBR의 단점을 보완하고 실시간 모니터링이 가능한 SYTO-9를 이용한 실시간 LAMP PCR 방식을 사용한다. 정부 차원의 해양병원체 저감 정책수립에 활용 - 해양생물산업 중 해양병원체 진단 시장 선점. 복잡한 사용으로 고가의 검사실 장비를 대체하는 효과 - 진단키트의 소형화를 통한 현장 적용성 증대.

진단키트의 안정적 공급을 위한 양산기반 마련 시제품 진단키트를 이용한 해양바이러스 검출 실험이 소비자 기업에서 진행 중 - (주)서린바이오사이언스 부설 서린생명과학연구원에서 추가 검증

표 6. Real-time LAMP PCR 조성

양식장 어류를 이용한 진단키트 테스트

실험을 통해 확립된 파지 디스플레이 scFv를 이용한 ELISA 키트 실험 프로토콜은 다음과 같다. Ÿ 생선 조직을 액체 질소로 냉동하고 멸균 막자사발과 막자 사발로 균질화합니다. Ÿ 단백질은 PRO-PREP™ 단백질 추출 솔루션(iNtRON)을 사용하여 균질화된 샘플에서 얻습니다.

Ÿ 얻어진 단백질을 carbonate coating buffer에 50:1 비율로 희석하여 100 μl를 96-well immunoplate에 넣고 4℃에서 밤새 반응시켰다. Ÿ 405nm에서 흡광도를 확인하고 음성 대조군과 비교했습니다.

바이러스 특이 phage display scFv kit를 이용한 바이러스 진단

성과 지표 내용 목표 평가(검증) 방법. LAMP PCR은 실험을 진행하기 위해 3단계 이상의 온도 조절 단계가 필요한 기존 PCR 방법과 달리 모든 실험이 등온선에서 수행된다는 장점이 있습니다. 해양 바이러스와 밀접한 관련이 있는 양식장과 같은 장소에서 현장 적용성을 높이기 위해 이전 과제에서 LAMP PCR 방법을 확립했습니다.

다만, 이전 실험에서 사용한 SYBR은 real-time PCR 과정을 방해하여 검출 특이도 및 민감도에 영향을 미칠 수 있으므로 기존 검출 방식을 개선하였다. 해양 병원체의 지속적인 모니터링에 사용됩니다. 기술 분사 및 기술의 기대 효과.

연구결과에 대한 기업만족 및 사업화 방안 신경 괴사 바이러스에 대한 항체 및 이의 용도. 참돔 이리도바이러스에 대한 항체 및 이의 용도.

그림 22. 등 근육 조직 진단 결과

해양바이러스 진단시스템 비교